花生抗病基因的克隆及功能分析

课题目标、内容：利用基因芯片技术和构建cDNA差减杂交文库分离黄曲霉抗性相关基因,获得黄曲霉抗性相关的ESTs和干旱胁迫诱导差异表达的ESTs30～50条,并在GenBank注册。     

调控棉花纤维发育microRNA基因的克隆、功能分析及利用

课题目标、内容：棉花是我国重要的经济作物之一,其纤维是天然纺织材料的主要来源。棉花纤维的发育机理备受人们的关注。本研究以陆地棉（Cossypium hirsutun）及其无短绒光子突变系为试验材料,通过以直接克隆法分离、克隆和鉴定与棉纤维发育相关的miRNA,探索这些miRNA在棉纤维生长发育过程中上调或下调的时空的表达模式。     

小鼠CD19基因部分片段的克隆及其鉴定

[目的]为了研究小鼠CD19胞膜外区的结构与功能。[方法]应用反转录—聚合酶链式反应技术(RT-PCR),通过一对自行设计的引物,从小鼠脾脏RNA中扩增出一条特异性基因片段,大小约为910 bp,对该片段进行酶切和测序鉴定。[结果]所获得的DNA片段的酶切位点与所报道的小鼠CD19基因一致,从而确定其为小鼠CD19胞膜外区基因。[结论]该研究为小鼠CD19胞膜外区的结构与功能的进一步研究提供了试验基础。     

油菜BnPMEI1基因的克隆及功能分析

以高抗菌核病的油菜品种湘油15和高感菌核病的油菜品种98C40为材料,采用RT–PCR方法克隆BnPMEI1基因的编码区全长,利用生物信息学软件和实时荧光定量PCR分析BnPMEI1的结构和表达特性,并构建该基因超表达载体,分析该基因的功能。序列分析结果表明,该基因编码区全长615bp,编码204个氨基酸,具有1个信号肽和1个PMEI结构域,属于PMEI家族基因,命名为BnPMEI1(GenBank登录号为ON254917)。表达分析结果表明,BnPMEI1在根、茎、花、叶、角果皮和籽粒中均有表达,在叶中的表达量最高,根中的表达量最低;湘油15的茎、叶、花中的表达量均显著高于98C40的。在核盘菌、茉莉酸甲酯(Me JA)和水杨酸(SA)处理下,BnPMEI1在湘油15中的表达上调,在98C40中的表达则受到抑制;乙烯处理下,BnPMEI1在2个品种中的表达均下调,在湘油15中下调的幅度更大;离体叶片接种结果显示,超表达Bn PMEI1的油菜突变体叶片病斑明显小于野生型叶片的。综合分析,BnPMEI1基因可能介导了SA和茉莉酸途径的调控,诱导油菜菌核病抗性的提高。     

欧美杨PdSIKI基因的克隆与功能分析

[目的]筛选抗旱节水欧美杨品种。[方法]以欧美杨为材料,通过RT-PCR方法从欧美杨叶片中克隆到抗旱PdSIKI基因,将其转入拟南芥中,研究转PdSIKI基因拟南芥的表型性状和生理指标。[结果]PdSIKI基因开放阅读框为2 442 bp,编码813个氨基酸。蛋白质分析表明PdSIKI蛋白含有典型的类受体蛋白激酶高度保守的丝氨酸/苏氨酸结构域和跨膜区域。荧光定量PCR分析表明该基因在顶端叶中表达量最高,功能叶、根和茎中则无表达。逆境胁迫分析表明该基因受Na Cl、ABA和干旱诱导表达明显。与野生型相比,干旱处理下转PdSIKI基因拟南芥表现出更强的生长状态,且叶绿素含量降低,丙二醛含量升高。[结论]超表达PdSIKI基因提高了拟南芥抗干旱能力。     

水稻SIDP301基因的克隆与功能分析

水稻是一种非常重要农业粮食作物,属于单子叶植物,对其进行抗逆相关基因克隆功能分析有非常重要理论意义,水稻SIDP301基因编码蛋白质含有锌指结构域,数据表明基因在水稻各个组织中都有一定表达,根和叶水平比较高,基因受到高盐和高温诱导,对照相比可以发现基因耐盐性不是非常明显,抑制基因高盐具有高敏感检测相关标记基因,在抑制超量转基因表达中高于野生型植株,是一个抗逆相关基因,会降低水稻抗逆性。     

山羊FSHR基因编码蛋白的结构及功能分析

通过Prot Param和ProtScale等在线软件对山羊FSHR基因编码蛋白的理化性质、亚细胞定位及功能进行分析,分别使用Chou-Fasman和同源建模方法对二级、三级结构进行预测,并对采用邻近法构建的不同物种FSHR基因编码蛋白的系统发育树进行分析。结果显示,山羊FSHR基因编码蛋白由695个氨基酸残基组成,包含7个跨膜域和1个G蛋白耦合受体,属于不稳定蛋白,具有较高的亲水性;亚细胞定位结果显示,FSHR基因编码蛋白分布在内质网、液泡和线粒体内;二级结构主要是α螺旋,三级结构富含helix螺旋结构域和长链卷曲。对不同物种FSHR基因编码蛋白进行系统发育分析发现,与其他物种相比,山羊与绵羊、家牛、野猪亲缘关系较近,系统发育分析结果与其动物学分类结果一致。     

棉花黄萎病相关基因GhMYB6的克隆与功能分析

【目的】克隆陆地棉MYB家族基因GhMYB6,并对其在棉花抗黄萎病反应中的功能进行初步探究,为挖掘棉花抗病相关基因及棉花抗病育种提供参考。【方法】基于棉花转录组测序数据,筛选并克隆了响应黄萎病菌侵染的基因GhMYB6,对其序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在黄萎病诱导下的表达模式,并利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术初步验证棉花抗黄萎病中的生物学功能。【结果】克隆获得的GhMYB6基因开放阅读框(ORF)为258 bp,编码85个氨基酸残基,理论等电点(pI)为9.34,脂肪系数为73.41,平均疏水性为-0.793,相对分子质量为9.86 kD,不稳定指数为73.41,为亲水性、碱性的非跨膜蛋白,无信号肽,定位于细胞核,在第11~63氨基酸处含有1个SANT结构域。GhMYB6蛋白与雷蒙德氏棉GrMYB6聚在同一小分支上,说明二者的亲缘关系较近。GhMYB6基因在V991侵染后6和12 h时相对表达量较对照(未侵染处理,CK)极显著下调(P<0.01),72 h时显著上调(P<0.05,下同),24和48 h时与CK无显著差异(P>0.05)。与阴性对照植株TRV:00相比,GhMYB6基因沉默植株萎蔫程度和叶片黄化更严重,病情指数显著升高,茎秆的褐变程度更严重,且茎段在培养基上生长的真菌菌丝数量明显增多。【结论】GhMYB6基因响应黄萎病菌V991侵染,当抑制GhMYB6基因表达后,棉花对黄萎病菌的敏感性增强,抗性明显降低,推测GhMYB6是棉花抗黄萎病防御的一个正向调节因子。     

橡胶延伸因子REF基因的克隆、转化及功能分析

取巴西橡胶树新鲜橡胶胶乳,利用改良CTAB法提取胶乳总RNA,反转录合成cDNA。根据GenBank中REF基因序列的报道,设计特异性引物,Taq酶扩增,获得REF基因并构建DHN pBin 438-REF植物表达载体。利用叶盘转化法侵染橡胶草无菌幼嫩叶片,通过RT-PCR方法鉴定阳性植株,对其可溶性糖、胶乳和蛋白质含量等进行检测。结果表明,转基因橡胶草可溶性糖质量浓度为0.053 8g/L,约是野生型橡胶草的2倍;橡胶是野生型植株橡胶的1~3倍;而转基因橡胶草中REF基因在蛋白质水平高效表达,其中根和花梗中REF基因高效表达。本研究通过农杆菌介导的遗传转化,获得5株阳性转基因橡胶草植株,分子生物学结果表明,REF基因可在橡胶草中稳定表达,并显著地提高橡胶草中合成天然橡胶的生物量。     

基于线粒体COⅡ基因的安徽白蚁的分子鉴定及系统进化分析

利用同源克隆技术分离了安徽省40个不同地理种群白蚁样品的线粒体XOⅡ基因,并进行了序列分析,结合GenBank中的数据,构建系统进化树并进行了遗传变异分析。序列比对分析表明,40个白蚁样品分属3个属(土白蚁属、散白蚁属、乳白蚁属)的6个种,3个属COⅡ全长基因中多态性位点分别占0.1%、9.2%和7.4%;基因序列中A+T含量为61.8%,显著高于C+G含量,碱基变异的主要形式为转换。同种白蚁个体间的碱基差异明显小于不同种间的差异,种内个体间的差异为0.1%~1.3%,种间个体间的差异为5.5%~7.6%。分子系统树表明,乳白蚁属和散白蚁属构成姐妹关系聚成一支,亲缘关系较近,而土白蚁属关系较远,分子鉴定及系统进化分析的结果与传统形态学结果相一致,是对形态分类的有力支持。     

大白菜BrAGL19的克隆及表达分析

利用同源克隆的方法在大白菜中获得一条与拟南芥AGL19基因高度同源的cDNA序列,命名为BrAGL19.序列分析结果表明,该基因cDNA序列全长660 bp,编码219个氨基酸,与拟南芥AGL19 cDNA编码氨基酸的一致性为85.07%,具有典型的MADS-box和K-box结构.实时荧光定量PCR检测结果表明,在春化过程中,BrAGL19的表达量不断增加;在抽薹开花过程中,18 h的长日照较12 h的短日照更能促进该基因的表达.由此推测,BrAGL19基因对大白菜抽薹开花的调控起着重要作用.     

鸭维甲酸诱导基因I克隆及其结构域功能分析

【目的】克隆鸭维甲酸诱导基因I（retinoic acid inducible gene I,RIG-I）,分析其不同结构域的功能。【方法】根据GenBank上公布的鸭RIG-I序列设计引物,利用RT-PCR克隆鸭RIG-I基因CDS（coding sequence）区,根据保守结构域预测结果,构建携带6*his组氨酸标签的不同结构域缺失突变体的真核表载体（RIG-I-Full、RIG-I-N和RIG-I-C）,转染鸡胚成纤维细胞DF1,经RT-PCR、间接免疫荧光方法鉴定重组质粒在细胞中转录与表达;同时,利用RT-qPCR检测RLR抗病毒信号通路中的IFN-β、Mx1和PKR等下游基因的表达变化。【结果】鸭RIG-I基因CDS区全长2 802 bp,共编码933个氨基酸;不同结构域缺失突变体的真核表载体转染DF1细胞后,重组蛋白均在DF1细胞中表达;RT-qPCR结果显示,N端能显著激活RLR通路上IFN-β、Mx1及PKR基因的表达上调。【结论】 duRIG-I及不同区段均能在DF1细胞中表达,其中N端在调节RLR抗病毒信号通路下游基因的表达过程中发挥了重要作用。     

欧美杨PdPP2C基因的克隆与功能分析

欧美杨是中纬度地区最适合的短轮伐期工业用材集约经营树种之一,然而盐渍、干旱和低温严重影响了欧美杨的生长发育和产量。本文利用RT-PCR等技术克隆出欧美杨PP2C基因并进行了序列分析。PdPP2C基因开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。蛋白质序列分析表明,PP2C蛋白N端保守性不强,C端有保守的蛋白磷酸酶区域。荧光定量PCR分析表明,该基因在欧美杨根、成熟叶、顶端叶和茎中都有表达且根中表达量最高。逆境胁迫分析表明,该基因受NaCl、ABA和干旱等诱导表达。干旱和盐胁迫处理下转PdPP2C基因拟南芥与野生型相比生长受到较少抑制,且叶绿素含量上升,丙二醛含量下降,表明PdPP2C基因作为一种蛋白磷酸酶提高了拟南芥的抗逆性。      

油菜抗菌核病和抗逆相关基因的克隆和功能分析

主要研究成果： 油菜抗菌核病和抗逆相关基因的克隆 已经通过分子标记、突变体筛选、基因芯片、致病因子为诱饵蛋白的酵母双杂交等技术定位和克隆了20多个功能基因,其中4个基因有重要利用价值;发现了乙烯／茉莉酸信号途径及ROS在抗病中起主要作用;     

不结球白菜花青苷合成转录因子基因BcEGL3的克隆及沉默分析

[目的]本文旨在探究BcEGL3基因在不结球白菜紫色材料和其绿色突变体中的特性及其调控功能.[方法]以不结球白菜紫色自交系NJZX1-3和其绿色突变体NJZX1-0为材料,克隆BcEGL3基因;构建表达载体pRI101-BcEGL3,进行亚细胞定位;构建沉默载体pTY-BcEGL3,分析材料中花青苷含量变化,以及BcE...     

大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子克隆与功能验证

【目的】克隆大鼠胰岛素Ⅱ基因启动子（RIP2）序列并对其功能进行验证,为培育胰岛特异性表达外源基因的转基因动物奠定基础。【方法】根据GenBank中已发表的RIP2序列（J00748．1）设计引物,以大鼠基因组DNA为模板,PCR扩增RIP2序列,连接pMD18-T载体后用HindⅢ和BamH I进行双酶切,回收RIP2片段并连接至不含启动子的pEGFP-1载体上构建真核表达载体pEGFP-1-RIP2。重组质粒转染PK15细胞,24h后观察细胞荧光蛋白表达情况。【结果】克隆获得的RIP2序列与参考序列（J00748．1）的同源性为99．9％,存在3处碱基差异,即从起始密码子ATG（＋1）上游-57处有一个G碱基缺失,-387处C突变为A,-707处插入一个G碱基。RIP2序列存在一个TATA-box（-206～201位点）和一个CAAT-box（-343-339位点）。以重组质粒pEGFP-1-PIP2转染PK15细胞,24h后能观察到绿色荧光。【结论】克隆获得的大鼠RIP2序列具有启动子功能,但活性较CMV启动子弱。     

银杏HDR基因的克隆与功能分析

[目的]获得银杏HDR基因的克隆并研究HDR基因的功能。[方法]采用RT-PCR技术获得银杏HDR的全长cDNA,命名为Gb-HDR（GenBank登录号：DQ364231）,该基因cDNA全长为1827bp,包含1425bp的开放阅读框,编码474个氨基酸残基的蛋白;并构建GbHDR的原核表达载体pTrcGbHDR,与原核表达载体pAC-BETA共转入大肠杆菌XL1-Blue,获得β-胡萝卜素工程菌。[结果]克隆获得实际长度为1441bp的GbHDR基因,该序列包含1425bp的HDR基因ORF,编码474个氨基酸残基的蛋白,其预测分子量为53.2kD,等电点预测为5.76。功能互补分析表明,GbHDR能推动工程菌XL1-Blue＋pTrcGbHDR＋pAC-BETA超量表达β-胡萝卜素,在颜色互补平板上呈现β-胡萝卜素特有的橘黄色,证实GbHDR具有典型的HDR基因功能。[结论]获得1株可高量积累β-胡萝卜素的大肠杆菌工程菌,为最终实现β-胡萝卜素代谢工程提供侯选基因和作用靶点。     

葱蝇Dorsal基因的克隆·表达及生物信息学分析

[目的]探讨Dorsal与葱蝇滞育发育的关系。[方法]以葱蝇(Delia antiqua)为试虫,采用RACE方法克隆了葱蝇Dorsal的全长cDNA序列;将该序列推导的氨基酸序列在GenBank搜寻同源序列,与搜寻到的14个代表性昆虫Dorsal序列进行相似性比较,并进行系统进化分析;采用半定量RT-PCR方法分析了Dorsal基因在葱蝇非滞育、夏滞育、冬滞育蛹中的表达情况。[结果]克隆了葱蝇Dorsal基因的cDNA序列,全长2 412 bp,开放阅读框1 974 bp,编码657个氨基酸,等电点PI约8.5,分子量72.9 kDa。与GenBank中的其他14个昆虫代表性Dorsal序列相似性比较和进化分析显示葱蝇的Dorsal与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、拟暗果蝇(Drosophlia pseudoob-scura)的Dorsal序列相似性最大。半定量分析显示葱蝇Dorsal基因在葱蝇冬滞育、夏滞育、非滞育蛹滞育发育关键期的表达量均明显升高,尤其在滞育后期表达量最高,初步判断Dorsal基因与葱蝇滞育发育相关。[结论]为进一步开展Dorsal基因在昆虫滞育发育过程中的功能研究奠定了基础。     

产黄青霉几丁质合成酶基因的克隆及系统学分析

通过对产黄青霉基因组DNA进行PCR扩增得到几丁质合成酶基因的同源片段。经克隆及序列分析表明所得,片段为4种不同基因,分别命名为PcCHS1,PcCH-S2,PcCHS3及PcCHS4,经比较演绎氨基酸序列,PcCHS1属于I型几丁质合成酶,Pc-CHS2及PcCHS3为Ⅱ型,PcCHS4为Ⅲ型。为了进行产黄青霉的系统学研究,将几丁质合成酶基因保守区的演绎氨基酸片段进行同源性搜索及引导序列分析,结果表明青霉菌与子囊菌,尤其是曲霉属真菌具有紧密的演化关系。几丁质合成酶引导序列分析结果也支持了几丁质合成酶在丝状真菌系统学研究中的有效性。     

百子莲生长素受体基因TIR1的全长cDNA克隆及功能分析

采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法获得百子莲生长素受体TIR1基因cDNA全长序列,对该序列进行生物信息学分析的结果显示,TIR1基因的mRNA序列全长为2 235bp;5’非编码区296bp,3’非编码区172bp;该基因的ORF全长为1 764bp,编码一个含有588个氨基酸的蛋白。百子莲TIR1推导蛋白序列与葡萄(Vitis vinifera)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、高粱(Sorghum bicolor),玉米(Zea mays)等植物均具有较高的同源性,同源性最高的是葡萄,可达78%。系统进化树表明,百子莲与葡萄距离最近。由α-螺旋,随机卷曲和延伸链组成一个磁状结构,为亲水蛋白,疏水性值为-0.092,在百子莲体细胞胚胎发生过程中,实时荧光定量PCR结果表明TIR1基因表达量在愈伤组织中含量最低,在胚性愈伤组织和体细胞胚胎中含量均有所升高,而在体胚幼苗中表达量最高,表明该基因介导的生长素信号在体细胞胚胎发生过程中发挥着非常重要的作用。