玉米ZmCPK12基因真核表达载体的构建及转化

[目的]CDPK是一类依赖于Ca2+而不依赖CaM及磷脂的蛋白激酶,或类钙调素结构域的蛋白激酶,是植物和低等动物所特有.研究为玉米CDPK基因家族在抗逆中的作用提供基础.[方法]构建玉米ZmCPK12基因真核表达载体是了解玉米中该基因功能的重要途径之一.实验利用RT - PCR技术扩增得到大小为1 533 bp的玉米ZmCPK12基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP -5N连接,获得重组真核表达质粒ZmCPK12 - 5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒ZmCPK12-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转人酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建了玉米mCPK12基因真核表达载体,并且成功转化了酵母.     

盐穗木HcPS_H基因真核表达载体的构建及转化

[目的]盐穗木(Halostachys caspica)属藜科盐生植物,是广泛分布于新疆干旱或半干旱荒漠盐碱环境中的一种极端耐盐的多年生稀盐多汁半灌木,对盐分适应性极强.PS_H基因是一个参与光合反应光系统的基因,在植物光合作用中起着重要的作用.构建盐穗木HcPS_H基因真核表达载体对于了解该基因在盐穗木耐盐过程中的作用有着重要意义.[方法]利用PCR技术扩增得到大小为441 bp的盐穗木HcPS_H基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP-5N连接,获得重组真核表达质粒HcPS_H-5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒HcPS_H-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转入酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建盐穗木HcPS_H基因真核表达载体,并且能在真核细胞中正常表达.     

猪Sarlb基因真核表达载体构建及鉴定

根据已发表的猪Sarlb基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,用RT-PCR方法从猪肝脏组织总RNA中扩增出Sarlb基因cDNA序列,纯化后,经BamHⅠ／XhoⅠ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）,获得pcDNA3,1（＋）一Sarlb重组载体。通过茵液PCR、双酶切及DNA直接测序分析,证实重组表达载体pcDNA3,1（＋）-Sarlb构建成功。     

新型冠状病毒E基因真核表达载体的构建及表达

囊膜蛋白（E蛋白）是新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2,SARS-CoV-2)的小包膜蛋白,在调控冠状病毒复制方面有重要作用。为了更有利地研究SARS-CoV-2 E蛋白的生物学功能,研究成功构建了SARS-CoV-2 E基因的真核表达载体。首先,通过PCR技术扩增SARS-CoV-2 E基因,并将pCMV-Myc载体进行双酶切。随后,利用同源重组将SARS-CoV-2 E基因连接至pCMV-Myc载体。经酶切和测序鉴定发现,SARS-CoV-2 E基因成功克隆至pCMV-Myc载体中,并将重组质粒命名为pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E。将重组质粒pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E转染至HEK-293T细胞,利用Western Blot和间接免疫荧光技术检测重组质粒的表达以及定位情况。结果表明,重组质粒pCMV-Myc-SARS-CoV-2-E在HEK-293T细胞中成功表达,并且发现重组蛋白主要分布于胞质,少量存在于胞核,为进一步研究SARS-CoV-2 E蛋白的功能奠定基础。     

口蹄疫病毒L基因真核表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法,从口蹄疫病毒中扩增出长约600 bp的核苷酸片段.纯化后与载体pMD18-Tsimple连接,重组质粒经PCR鉴定及DNA测序,结果表明克隆的片段为口蹄疫病毒L基因.将质粒pMD18-L与表达载体pEGFP-N1分别用BamHⅠ+XhoLⅠ双酶切,将所获目的基因与带有酶切位点的载体连接,经酶切、PCR鉴定及DNA测序,结果表明重组表达质粒pEGFP-L构建成功.将转染的BHK-21细胞,经荧光鉴定和RT-PCR检测,证实L基因在BHK-21细胞中得到表达.     

玉米大斑病菌St3HNR基因真核表达载体构建及表达分析

本研究在克隆获得玉米大斑病菌1,3,8-三羟基萘还原酶基因(St3HNR)的基础上,拟对该基因编码产物进行异源表达分析,明确基因功能.试验利用毕赤酵母真核表达系统,构建了玉米大斑病菌St3HNR基因的真核表达载体pPIC9K-St3HNR,采用电击转化法将重组质粒转入表达宿主菌GS115中得到了重组酵母菌株,经甲醇诱导...     

猪pGH基因真核表达载体的构建及其表达

从120日龄的长白猪脑垂体组织中扩增出pGH基因的cDNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-pGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,并将其转染PK15细胞,通过荧光素酶活性检测特异性表达强度.结果表明,成功构建了pEGFP-N1-pGH真核表达载体,为转基因猪的研究奠定了基础。     

猪Annexin A2基因真核表达载体的构建及表达

根据猪的Annexin A2基因序列设计引物,通过PCR方法扩增Annexin A2基因cDNA,并将其克隆到pGEM-T载体后进行测序分析,然后将测序结果正确的Annexin A2基因cDNA亚克隆到pEGFP-N1表达载体上,成功构建了表达载体.将表达载体瞬时转染Marc-145细胞,结果表明:表达载体pEGFP-N1 -ANXA2可以在Marc-145细胞中表达.     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建

目的：构建HBVX基因与pCI-neo相融合的高效真核表达载体。方法：设计并合成HBVX基因的引物,以HBVDNA阳性血清PCR扩增得到HBVX基因全序列,将X基因连接到真核表达载体pCI—neo上后,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果：以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBVX基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论：成功构建了HBVX基因的真核表达载体,为进一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。     

民猪LPL基因真核表达载体的构建

为了进一步分析脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,LPL)基因的生物学功能。采用克隆测序的方法获得了民猪LPL基因的完整CDS序列,将其克隆到pMD-18T载体上,将测序验证正确的基因序列插入到pcDNA3.1(+)质粒载体中,构建了pcDNA-LPL真核表达载体。结果表明,所得序列与GenBank中登录的猪LPL基因同源性为99.30%,说明LPL基因的真核载体构建成功。该研究为在细胞水平上研究LPL的表达和功能奠定了试验基础,为进一步分析LPL基因功能提供了理论依据。     

玉米蛋白激酶基因ZmASK1表达载体的构建及遗传转化

为了研究玉米蛋白激酶基因ZmASK1的功能,把ZmASK1的cDNA连接到植物表达栽体pGreen0029中,通过农杆菌介导转入拟南芥中进行过量表达.PCR和Western-blot分析表明,ZmASK1已经转入到拟南芥中,并且在大多数转化植株中稳定表达.通过本试验,为以后对ZmASK1的功能验证工作打下基础.     

猪Ghrelin基因真核表达载体构建(英文)

[目的]为研究转生长相关基因对猪的作用。[方法]采用RT-PCR方法,从13/17罗伯逊易位杂合子猪小肠组织中提取总RNA,将其纯化后作为PCR扩增模板,参考GenBank公布的猪Ghrelin的mRNA序列设计合成具有Nhe I和Hind III双酶切位点引物,扩增获得Ghrelin基因cD-NA全长序列。将准确的Ghrelin基因片段克隆于 pMD19-T simple Vector后进行序列分析,获得猪Ghrelin基因cDNA全长基因片段。经Nhe I和Hind III双酶切,将 Ghrelin基因cDNA片段连接到真核表达载体pEGFP-N1,获得真核表达载体的重组质粒pEGFP-Ghrelin。重组质粒转染猪成纤维细胞,观察标记基因荧光蛋白的表达。[结果]13/17罗伯逊易位杂合子猪的Ghrelin基因与已发表的序列相同,并成功获得具备猪Ghrelin基因全长cDNA序列的真核表达载体pEGFP-Ghrelin。[结论]构建的真核表达载体可以用于转基因猪的进一步试验,同时也为研究Ghrelin的调节机制奠定基础。     

黑曲霉木聚糖酶基因xynA的克隆及真核表达载体的构建

从黑曲霉(Aspergillus niger)GI M3.452中克隆得到木聚糖酶基因xynA的成熟肽编码序列。通过重叠延伸PCR将不带原基因信号肽编码序列的xynA基因片段和猪腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein,PSP)基因的信号肽进行拼接得到融合片段SPA,并将其克隆到真核表达载体pcDNA6/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-SPA,重组质粒经过酶切、测序鉴定其读码框的正确性,在脂质体介导下将重组质粒pcDNA-SPA转染猪肾细胞(PK15),通过RT-PCR证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中检测到木聚糖酶活性为7.6I U/mL。     

抗菌肽Defensin基因pcr3.1真核表达载体的构建

通过克隆果蝇的defensin基因,构建了defeBSin基因的哺乳动物细胞真核表达栽体.把黑腹果蝇基因组DNA通过PCR获得defensin,克隆载体pMD18-T/defeBSin,并将其转化到大肠杆菌里.最后进行抗菌肽基因重组真核表达载体pcr3.1/defensin的构建和鉴定.结果表明,以果蝇总DNA为模板扩增出280bp左右的特异性条带,测序结果与GeneBank测序结果相比,除一个碱基外,其余的完全一致,译成的氨基酸序列相同.对重组质粒pcr3.1/defensin进行双酶切鉴定并测序.结果也完全一致.所以,重组质粒per3.1/defensin由真核载体pcr3.1和defensin DNA片段组成.且插入的defensin DNA片段与已知序列完全相同.     

水牛NAAA基因克隆分析及其真核表达载体构建

为了阐明水牛N-酰基乙醇胺酸酰胺酶（N-acylethanolamine acid amidase,NAAA）基因在水牛卵泡发生和胚胎发生过程中的作用及分子机制,本试验采用了3'Race、生物信息学分析、载体构建和细胞转染等技术对NAAA进行了研究。结果表明：水牛NAAA基因的编码区全长1 071 bp,共编码356个氨基酸;多重序列比较分析显示：水牛NAAA核苷酸序列与牛、山羊、绵羊、猪、马、猫和人相应序列的相似性分别为98%、96%、95%、87%、87%、85%和84%,结合系统进化树分析结果,NAAA基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。对NAAA蛋白质的分析表明：该蛋白呈弱酸性,第26~27位氨基酸为其信号肽,细胞亚定位于溶酶体,存在NAAA-beta和Ntn_AC_NAAA结构域。成功构建水牛NAAA基因真核表达载体,转染293 T后,能够正确形成NAAA-EGFP融合蛋白,产生绿色荧光信号。研究结果为阐明NAAA基因在水牛卵泡发生和胚胎发生过程中的作用及分子机制奠定了理论基础。     

PGM-35Sbar玉米通用表达载体的构建及玉米转化研究

[目的]构建玉米通用表达载体,以期为利用转基因手段提高玉米对非生物胁迫的耐受性奠定基础。[方法]通过对现有的pGreen0229植物表达载体进行改造,构建含有CaMv35S启动子驱动的抗草胺膦筛选基因bar、可用于连接目的基因的玉米表达载体PGM-35Sbar,并通过花粉管通道法转化吉444玉米自交系。[结果]PGM-35Sbar玉米通用载体构建成功,转化玉米植株后,得到抗性植株14棵,经PCR检测其中有12棵为阳性植株。[结论]该研究为快速构建含有特定目的基因的玉米表达载体奠定了基础。     

PGM-35Sbar玉米通用表达载体的构建及玉米转化研究(英文)

[目的]构建玉米通用表达载体,以期为利用转基因手段提高玉米对非生物胁迫的耐受性奠定基础。[方法]通过对现有的pGreen0229植物表达载体进行改造,构建含有CaMv35S启动子驱动的抗草胺膦筛选基因bar、可用于连接目的基因的玉米表达载体PGM-35Sbar,并通过花粉管通道法转化吉444玉米自交系。[结果]PGM-35Sbar玉米通用载体构建成功,转化玉米植株后,得到抗性植株14棵,经PCR检测其中有12棵为阳性植株。[结论]该研究为快速构建含有特定目的基因的玉米表达载体奠定了基础。