免疫层析试纸条监测实验感染日本血吸虫病牛治疗前后抗体消长

应用牛日本血吸虫病抗体检测免疫层析试纸条（以下简称试纸条）检测5头牛实验感染日本血吸虫（以下简称血吸虫）后0～10周和治疗后第1～24周的血清抗体。结果表明,牛在感染后第4～5周开始检测到血吸虫抗体,在感染后第8～10周抗体水平达高峰,从治疗后第6周开始,抗体水平逐渐下降,1,2,3,4和5号牛依次在治疗后第24,16,22,20和20周抗体转阴。     

日本血吸虫22.6kD重组抗原二步金标免疫渗滤法诊断家畜血吸虫病的初步研究

以胶体金标记的日本血吸虫重组抗原GST-Sj22.6为探针,检测家畜血吸虫抗体,建立重组抗原金标免疫渗滤法（RAg-T-DIGFA）。该法可以检测出人工感染血吸虫尾蚴28 d和21 d以上的阳性牛和兔血纸抗体,用该法检测肝片吸虫、蛔虫、弓形虫、旋毛虫病血清抗体,无交叉反应。与T-DIGFA法阳性符合率为100%,阴性符合率为100%。血吸虫抗原胶体金在4～8℃保存期可达6个月、室温保存期为3个月。重组蛋白金标免疫渗滤法具有抗原容易制备和良好的敏感性、特异性、重复性和稳定性,适合于基层单位和现场进行家畜血吸虫病抗体的快速诊断。     

免疫金试纸法快速检测盐酸克伦特罗

试验选取自身蛋白制备克盐酸伦特罗克伦特罗载体抗原,免疫动物后产生高效价的特异性抗体,纯化抗体与胶体金结合成免疫金,制备成简易的检测试纸条。通过检测试纸条敏感性、保存期、金标抗体工作浓度选择、操作方法对比、实验检测及与单抗金标试纸条平行检测等试验,证明建立的免疫金试纸法快速检测盐酸克伦特罗具有实用性、可靠性和稳定性。自身全血清作载体可使抗盐酸克伦特罗的ELISA效价高达4万以上。免疫金试纸法对盐酸克伦特罗的最小检测量为40ng·mL-1,试纸条在室温保存150d不影响检测结果。实验检测86份ELISA试剂盒阴性样品和42份阳性样品,其符合率分别为100%和95.2%。市售单抗金标试纸条检测结果与ELISA法的阳性符合率为95%(19/20)。     

两种检测水貂阿留申病毒抗体方法敏感性的比较研究

本研究对胶体金试纸条检测法与对流免疫电泳检测法检测水貂阿留申病毒抗体的敏感性进行对比研究。试验采用实验室制备的检验合格的试纸条,分别对20份不同效价的水貂阿留申病毒阳性质控血清和100份自然感染的田间血清进行检测,分析不同稀释度的阳性血清检出数量和阳性检出率,从而对两种检测方法的敏感性进行评估。结果显示,阳性质控血清在1∶64倍以下稀释时,试纸条对阳性血清和弱阳性血清的检出率均为100%,对100份自然感染阳性血清检出率为96%,表明该试纸条的检测具有较高的敏感性。     

检测猪瘟病毒胶体金和量子点试纸条的初步研制

为建立快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)抗体的方法,本研究采用胶体金和量子点免疫层析技术,将纯化的重组CSFV E2蛋白作为捕捉抗原,以纯化的抗CSFV E2蛋白多克隆抗体和HRP兔抗猪IgG分别包被于硝酸纤维素膜上,作为质控线(C线)和检测线(T线),优化反应条件,制备免疫层析试纸条,用于临床检测。结果表明,制备的2种试纸条都可用于检测CSFV标准阳性血清,使用不同批次试纸条进行检测,结果无差异。2种试纸条与CSFV阳性血清反应呈阳性,与伪狂犬病毒(PRV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和圆环病毒2型(PCV2)反应呈阴性;胶体金试纸条在临床样品中阳性检出率为84.38%(81/96),与CSFV抗体检测ELISA试剂盒检测阳性符合率为92.05%(81/88);量子点试纸条阳性检出率为87.50%(84/96),与ELISA试剂盒检测阳性符合率为95.45%(84/88)。本研究制备的2种试纸条都具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性。     

实验感染血吸虫牛、兔抗体的消长规律

用家畜血吸虫病金标免疫渗滤法试剂盒(以下简称试剂盒)检测实验感染血吸虫治疗前后3头牛和3只兔的血清中的血吸虫抗体水平.结果表明,1号、2号和3号牛分别于感染后第3周、第4周和第2周检测到血吸虫抗体,于治疗后第29周、第27周和第39周抗体转阴.1号、2号和3号兔分别于感染后第3周、第3周和第4周检测到抗体,于治疗后第35周、第17周和第39周抗体转阴.用试剂盒检测可比粪孵毛蚴法提早2周检出病畜.表明本试剂盒可用于家畜血吸虫病的早期诊断,并且在患血吸虫病家畜治疗10个月后,用本试剂盒的检查具有疗效考核价值.     

猫泛白细胞减少症病毒单克隆抗体的制备及其制备胶体金检测试纸条的应用

制备猫泛白细胞减少症病毒(FPV)单克隆抗体,研制胶体金检测试纸条.用FPV临床分离株免疫Balb/c小鼠,取血凝抑制(HI)效价最高的小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,采用HI方法筛选获得2株可稳定分泌FPV单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对其用于胶体金检测试纸条进行评价.2株杂交瘤细胞3C3和4A1株,分泌的单克隆抗体重链亚型分别为IgG2b、IgG2a,轻链亚型均为kappa;腹水纯化后单克隆抗体3C3、4A1的HI效价分别为1:5120、1:10240.用胶体金标记单克隆抗体4A1,单克隆抗体3C3作为检测线,羊抗鼠二抗作为对照线制备的胶体金检测试纸条,检测FPV病毒液的灵敏度为103.7 TCID50/mL;检测猫源其他病毒如FHV-1、FCV均为阴性;批内和批间重复性检测不同含量的FPV结果一致;检测513份临床样品,与PCR的阳性符合率为76％(71/93),阴性符合率为100％(420/420),总符合率为96％(491/513).该研究制备的FPV单克隆抗体可用于FPV胶体金检测试纸条的生产,用于FPV的现场快速检测.     

检测牛血吸虫病的重组LHD-Sj23蛋白乳胶凝集试验的建立

利用原核表达的日本血吸虫重组LHD-Sj23蛋白作为抗原致敏乳胶,建立诊断牛血吸虫病的乳胶凝集试验(LAT).用制备的乳胶抗原分别检测牛结核杆菌、牛泰勒虫、牛巴贝斯虫、牛口蹄疫、牛边虫、牛传染性支气管炎阳性血清,结果均为阴性,说明建立的乳胶凝集方法具有良好的特异性.用所建立的LAT方法与ELISA方法同时检测169份牛血清,结果表明,建立的LAT方法的特异性为94.29%.敏感性为93.10%,两种方法的符合率为94.08%(P>0.05),差异不显著.用同一批乳胶抗原检测7份牛血清,5次检测结果一致,说明致敏的乳胶抗原是稳定的.保存期试验结果表明,致敏乳胶在25℃可保存1个月,在4℃可保存3个月.这表明建立的LAT方法稳定、特异性强、灵敏度高、操作简便快速,无需昂贵仪器,适宜在临床上推广应用.     

牛旁检测诊断产后初期奶牛亚临床酮病研究

 酮病是奶牛的一种重要的营养代谢病。采用酮粉法、尿液分析试纸条、乳汁分析试纸条、试剂盒法分别对乳酮、尿酮和血酮含量进行检测,以血清β-羟丁酸含量1200μmol/L作为健康奶牛和亚临床酮病奶牛的诊断标准。乳汁检测试纸条和尿液分析试纸条的诊断标准分别为200μmol/L和15mg/dl（1470μmol/L）。酮病牛血清β-羟丁酸和葡萄糖的浓度分别为726±43μmol/L、3.42±0.05mmol/L,健康牛血清β-羟丁酸和葡萄糖的浓度分别为2563±238μmol/L、2.78±0.07mmol/L,差异显著（P<0.05）。乳汁分析试纸条的敏感性和特异性分别为67%和92%,尿液分析试纸条的敏感性和特异性分别为57%和85%,酮粉的敏感性和特异性的敏感性和特异性分别为60%和94%。使用乳汁分析试纸条牛旁检测是一种有效的奶牛亚临床酮病诊断方法。     

MPAIA、DIGFA、IHA、ELISA平行检测日本血吸虫抗体效果比较

目的：评价磁微粒分离酶联免疫法（MPAIA）、日本血吸虫抗体检测试纸条（DIGFA）、间接红细胞凝集试验（IHA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）平行检测日本血吸虫抗体效果。方法：采用MPAIA、DIGFA、IHA、ELISA,分别对荆州市血吸虫病专科医院每日收集的血吸虫病检查血清标本进行平行检测,并对检测结果进行统计分析。结果：对医院1321例标本,采用MPAIA与DIGFA、IHA、ELISA进行平行检测,阳性率分别为36．34％、27．93％、33．23％和20．29％,差别有统计学意义（P＜0．01）,MPAIA阳性率高于其他3种方法。结论：MPAIA、DIGFA、IHA、ELISA平行检测血吸虫血清抗体的阳性检出率较为符合,MPAIA适用于临床检验和现场调查。     

生姜液预防日本血吸虫尾蚴感染的实验研究

目的：探讨生姜液预防日本血吸虫尾蚴感染的效果以及对皮肤的毒副作用。方法：A组（n=24）小鼠皮肤涂抹生姜液后直接用日本血吸虫尾蚴感染,B组（n=24）小鼠皮肤涂抹生姜液用泥浆水洗擦后感染日本血吸虫尾蚴,观察防护作用。另以生姜液涂于小鼠腹部,观察对皮肤的毒副作用。结果：A组小鼠日本血吸虫尾蚴的感染率为18．18％,减虫率达95．99％;B组小鼠感染率为80．95％,减虫率为4．55％。小鼠皮肤未见异常反应。结论：生姜液涂肤未洗擦时有防御日本血吸虫感染的作用,且对皮肤无明显毒副作用。     

禽流感病毒感染与疫苗免疫鉴别诊断试纸条的研制及应用

 【目的】结合胶体金免疫层析技术建立一种适合养鸡业基层生产人员使用的便捷的快速诊断禽流感病毒感染鸡群的方法。【方法】将含禽流感病毒非结构基因ns1的表达载体KG-NS1转化入BL21（DE3）感受态细胞,筛选阳性克隆进行诱导表达,表达产物用GST亲和层析柱进行纯化和Western-blot分析;以NS1重组蛋白为诊断抗原,抗鸡IgFc的单抗标记的胶体金为示踪物,结合免疫层析技术,组装禽流感病毒NS1抗体的免疫胶体金鉴别诊断试纸条,评价其灵敏度和特异性,并对试验感染和临床采集的血样进行检测。【结果】NS1重组蛋白分子量约为52 kD,具有免疫学活性。在25 min内用肉眼观察到禽流感病毒感染鸡血清和NS1蛋白免疫鸡血清在试纸条的检测线处出现明显的棕红色,呈明显的阳性反应,而其它病原的血清在试纸条的检测线处不出现任何颜色,呈阴性反应。而且感染鸡群的NS1抗体在感染后3 d即可检测到,感染后1～2周为高峰期,维持时间约1周,检测阳性率为80%左右。临床样品的阳性率为9.1%。【结论】试纸条使用方便,操作简单,25 min内可以用肉眼判断结果,可区分禽流感疫苗免疫和野毒感染家禽,具有很大的推广应用价值。     

三种免疫血清学方法检测弓形虫抗体的比较

用斑点酶联免疫吸附试验、金萄菌A蛋白酶联免疫吸附试验及间接血球凝集试验二种血清学方法检测弓形虫感染鼠血清及健康鼠血清各100份,平均阳性率分别为96.0％、94.0％和88.0％,平均假阳性率分别为4.0％、7.0％及8.0％;检测10份阿米巴肝脓肿病人血清及20份日本血吸虫感染兔血清,平均交叉反应率分别为3.3％、10.0％及13.3％。结果表明,三法对弓形虫特异性抗体的检测均有较好的敏感性、特异性、重现性及较低的交叉反应率。三法中,以斑点酶联免疫吸附试验的敏感性最好,且有省试剂、反应快、操作简便等优点,是一种很有实用价值前景的免疫诊断方法。     

日本血吸虫SjELAV-like 1的克隆、表达及功能分析

【目的】克隆和表达日本血吸虫胚胎致死异常视觉基因1（SjELAV-like 1）,分析其在日本血吸虫体内的表达情况及定位,探究该基因对日本血吸虫形态和生殖发育的影响。【方法】利用RACE技术扩增5′/3′末端,获得SjELAV-like 1基因序列提交至NCBI,Gene Bank登录号：MG515727,构建该序列的重组表达质粒 pET28-SjELAV-like 1,并在大肠杆菌BL21中利用IPTG诱导表达,收集不同诱导时间的菌体,SDS-PAGE法进行蛋白电泳。利用His镍柱亲和层析法纯化大量表达所得重组蛋白,用纯化重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用于Western blotting 分析虫体内该天然蛋白的免疫原性,以及间接免疫荧光检测该蛋白在虫体内的分布情况。小鼠腹部贴片法感染日本血虫尾蚴,收集虫体不同发育阶段混合和合抱分开的雌、雄虫体,以单钉螺逸出的尾蚴感染小鼠获得25 d单性雌、雄虫体,通过实时定量 PCR分析该基因的表达情况。通过尾静脉注射小干扰RNA（siRNA）于感染小鼠体内,使该基因表达沉默,筛选最佳干扰效果的siRNA,用于长期RNA干扰（RNAi）试验,分析其对日本血吸虫雌虫产卵及卵胚孵化的影响。利用扫描电镜和透射电镜观察RNAi对虫体体被结构及雌、雄虫生殖器官的影响。【结果】获得的1 797 bp的SjELAV-like 1基因序列含有poly A尾,其中编码序列为1 533 bp,编码510个氨基酸。重组质粒pET28-SjELAV-like 1在诱导4 h时表达量最高,主要以包涵体的形式存在,利用纯化蛋白获得了优质多抗,获得的重组蛋白具有良好的免疫原性,经分析发现SjELAV-like 1蛋白主要分布在虫体体被。RT-qPCR 发现SjELAV-like 1在不同时期雌、雄虫体内均有表达,在雄虫体内表达稳定,但在雌虫体内随着发育成熟其表达水平呈下降趋势;在不同感染状态的雌、雄虫体内,与正常发育雌虫相比,该基因在发育阻遏雌虫体内高表达,而在雄虫体内无明显差异。RNAi试验中,与NC组相比,长期干扰组小鼠肝减卵率、雌虫对肝卵贡献减少率和卵胚减孵化率分别为58.27%（P＜0.05）、40.59%（P＜0.01）和74.58%（P＜0.01）;电镜观察发现,干扰组虫体体被结构改变,雄虫体表粘附的泡状物消失,立体的褶脊结构塌陷,整齐排列的条索状皮脊变的疏松,网状结构消失,雌虫体壁表面组织间隙增宽,分布于其上的体棘减少、变钝,雄虫精母细胞数目减少,其内的染色质减少,细胞肿大,细胞间质增宽,雌虫卵黄细胞中卵黄球减少,其中包含的卵黄滴也减少,内质网肿大,皮质颗粒排列散乱。【结论】成功克隆和表达了在日本血吸虫发育阻遏雌虫中高表达的部分SjELAV-like 1基因序列,且发现该基因主要在虫体体被表达。该基因沉默使肝脏荷卵数、雌虫对肝卵贡献率和卵胚孵化率均显著降低,并改变虫体体被结构,抑制生殖腺的正常发育,提示该基因对日本血吸虫的生殖发育有重要的作用。     

吡喹酮注射液的临床药效和靶动物安全性研究

研究30%吡喹酮注射液的临床药效和靶动物安全性,为其临床合理用药提供依据。通过实验性临床试验和扩大临床试验,考察吡喹酮注射液对自然感染血吸虫病牛的临床治疗效果。通过给药前后临床体征、血常规及血清生化指标的比较,评价吡喹酮注射液对靶动物水牛的安全性。实验性临床试验中,吡喹酮注射液高(20 mg/kg)、中(10 mg/kg)、低(5 mg/kg)剂量组的毛蚴转阴率分别为100%(8/8)、100%(9/9)、77.8%(7/9)。扩大临床试验中,吡喹酮注射液推荐剂量组(10 mg/kg)的毛蚴转阴率为100%(52/52)。靶动物安全性试验中,吡喹酮注射液至少在3倍推荐剂量(30 mg/kg)范围内对靶动物水牛的血常规和血清生化指标无明显影响(P0.05)。30%吡喹酮注射液按推荐剂量(10 mg/kg)肌内注射给药,对牛血吸虫病具有良好的治疗效果,临床应用安全。     

牛冠状病毒核衣壳蛋白原核表达及鉴定

【目的】 诊断致犊牛腹泻冠状病毒。【方法】采集石河子、沙湾、奎屯等10个规模化奶牛场141份腹泻犊牛粪样,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)进行冠状病毒检测,PCR方法进行核酸复检。同时根据GenBank登录的牛冠状病毒 N基因序列,设计特异性引物,对Mebus分离株N基因进行扩增,克隆到PMD 19-T载体后,将测序正确的基因片段经EcoRI和HindIII双酶切后连接到PET-28a和PET-32a载体中,构建重组表达载体PET-28a-N和PET-32a-N,进行测序,亚克隆入BL21(DE₃)表达载体,用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。【结果】所采集141份腹泻犊牛粪便中,用ELISA检测阳性率70.21%;再用RT-PCR检测出阳性率为61.7%同时,克隆了牛冠状病毒N基因,片段大小为1 400 bp,双酶切鉴定目的条带正确,测序结果与标准序列的进行比对同源性达到98.22%,通过SDS-PAGE分析证实表达的重组蛋白PET-28a-N-DE₃相对分子质量为54KD;重组蛋白BCV-32a-N-DE₃相对分子质量为70KD,Western blot分析表明该重组蛋白BCV-32a-N-DE₃和BCV-28a-N-DE₃和可以与牛冠状病毒阳性血清发生特异性反应。【结论】犊牛冠状病毒是导致石河子、沙湾、奎屯等10个规模化奶牛场和部分肉牛场犊牛腹泻的主要病原;ELISA方法和RT-PCR方法结合应用检测犊牛冠状病毒效果具有参考意义。获得的牛冠状病毒N蛋白具有很好的免疫反应性,为牛冠状病毒诊断试剂研发奠定基础。     

日本血吸虫新基因SjPP的筛选、克隆及对小鼠的免疫效果

【目的】筛选克隆东方田鼠血清识别的日本血吸虫靶抗原基因，并研究其免疫保护效果。【方法】利用东方田鼠感染血清免疫筛选日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA表达文库获得阳性克隆，以5′ RACE技术扩增获基因全长序列，构建含目的基因的核酸疫苗并研究在小鼠中的免疫保护效果。【结果】（1）获得4个日本血吸虫新的EST序列，即mfs-1（GenBank登录号BE974942）、mfs-3（GenBank登录号BE974944）、mfs-4（GenBank登录号BE974945）和mfs-5（GenBank登录号BE974946）。（2）mfs-5进行全长序列克隆，获得的日本血吸虫新基因SjPP(GenBank登录号AY902477)长1311 bp, 编码302个氨基酸，理论分子量为34.7 kD，等电点为5.51；其氨基酸序列具有丝/苏氨酸蛋白磷酸酶（serine/threonine specific protein phosphatase，简称PP）的保守序列LRGNHE，并且含有该酶特异性抑制剂冈田酸的作用位点SAPNYC，与人的PP6、鼠PP6、果蝇PPⅤ等蛋白的氨基酸序列具有高度同源性，分别达72%、70%和70%。（3）成功构建核酸疫苗pCMV-Script／SjPP，免疫BALB/c小鼠诱导产生肝组织减卵率为23.91%，粪便减卵率为31.91%。【结论】（1）获得日本血吸虫新的抗原基因SjPP。（2）含SjPP基因的核酸疫苗在小鼠中诱导了部分免疫保护效果。     

布鲁氏菌病不同初筛方法及诊断试剂检测差异性分析

[目的]应用布鲁氏菌病4种初筛方法及11种商品化诊断试剂检测新疆地区采集的207份牛、羊血清学样品,分析结果差异,对方法及产品进行评价.[方法]以英国参考实验室APHA竞争性ELISA试剂盒检测结果为标准,确定布鲁氏菌病牛阳性血清78份、阴性57份,羊阳性血清52份、阴性20份.应用RBT抗原(Ⅰ)、(Ⅱ),FPA抗原...     

日本血吸虫22.6 ku膜相关蛋白基因的克隆及原核表达

为了得到重组的日本血吸虫22.6 ku膜相关蛋白,研究设计了1对引物,以日本血吸虫mRNA为模板,用RT-PCR方法克隆了576 bp的22.6 ku膜相关蛋白基因片段,测序结果表明,该片段与已公布的Sj22.6基因序列(U75510)同源性达到99%。将该基因片段插入原核表达载体pGEX-KG构建了原核表达质粒pGEX-Sj22.6,在大肠杆菌BL21 codn plus中表达获得了约48 ku的融合蛋白,经Western-blot检测,该重组蛋白具有良好的免疫原性。     

牛病毒性腹泻病毒夹心ELISA快速检测方法的建立与初步应用

用增殖与浓缩后的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)分别免疫健康牛犊和家兔,制备牛抗BVDV和兔抗BVDV超免疫血清,并用层析法纯化牛抗BVDV IgG和兔抗BVDV IgG,建立了检测BVDV的双抗体夹心ELISA快速检测方法.结果表明:该检测方法的最佳反应条件为:牛抗BVDV IgG包被浓度为100μg/mL,兔抗BVDV IgG最佳工作浓度为50μg/mL,样品反应时间为90min,酶标抗体工作浓度为1∶8 000,以D490nm≥0.177作为阳性判定标准.该ELISA检测方法的重复性CV小于10%,最低检测限为1.87μg/mL,与牛轮状病毒、牛冠状病毒、猪瘟病毒、犊牛大肠杆菌和沙门菌等病原无交叉反应,该ELISA试剂在室温下至少可保存6个月.用该ELISA方法和IDEXX公司抗原检测试剂盒对甘肃省不同地区牛场156份临床粪便样品进行了检测,阳性检出率分别为17.3%和16.7%.表明本试验建立的ELISA方法特异性强、敏感性高且重复性好,可用于BVDV的快速检测.