番茄抗叶霉病相关基因片段克隆及VIGS重组载体的构建与鉴定

以含有Cf-19基因的番茄抗叶霉病品种CGN18423为材料,运用RT-PCR技术克隆番茄抗叶霉病相关基因细胞色素P450 90A1-like(CYP 90A1-like)部分序列,片段长295 bp;以番茄八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因作为阳性对照,片段长349 bp。测序结果表明,序列与番茄同源性达100%;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,在番茄感染叶霉病后,随时间延长CYP 90A1-like基因相对表达量呈上调趋势,说明该基因在番茄抗叶霉病过程中有重要作用;以烟草脆裂病毒(TRV2)为载体,成功构建CYP 90A1-like、PDS基因的病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)重组载体。构建的p TRV2-CYP 90A1-like、p TRV2-PDS重组载体将为下一步利用VIGS技术在番茄上研究CYP 90A1-like基因与番茄抗叶霉病的关系奠定试验基础。     

小麦WRKY转录因子VIGS基因沉默载体构建及验证

WRKY转录因子家族广泛存在于各种植物中,有助于提高植物抗逆性。本研究用病毒介导的基因沉默方法沉默Brock中克隆到的TaWRKY基因,发现白粉菌成功侵染小麦叶片的比例上升,畸形胞比例下降。研究表明,TaWRKY基因在小麦抵抗白粉菌侵染过程中发挥着重要作用。     

番茄红素环化酶基因片段克隆及反义表达载体构建

根据已知的番茄红素环化酶基因,即13环化酶基因和s环化酶基因的保守序列设计特异性引物。提取番茄叶片的RNA,经RT—PCR反应,扩增出723bp和569bp的目的片段,将它们分别连接到pEASY—T1 Cloning Vector上,测序鉴定其正确性。克隆到载体上的13环化酶基因用BamHI和SmaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCb反义表达载体。同样连接到克隆载体上的s环化酶基因用BamHI和XbaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCe反义表达载体。     

玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的克隆与过表达载体的构建

【研究目的】克隆玉米分支酶基因SBEⅡb并构建该基因的过表达载体pCASBEⅡb。【研究方法】从糯玉米（Waxycorn）新鲜胚乳中提取总RNA,利用RT-PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA。【结果】克隆得到了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA,用BLAST软件作同源序列比对的结果显示,该片段的核苷酸序列与GenBank上报道的序列具有99%的同源性,全长2719bp,编码799个氨基酸。【结论】将该基因连接到携带GUS报告基因的植物表达载体pCAMBIA1303中,并通过了GUS活性检测,说明已成功构建了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的过表达载体pCASBEⅡb。     

小麦DREB基因的克隆及植物表达载体构建

脱水应答元件结合蛋白在高等植物应答干旱、高盐和低温胁迫中发挥重要的作用。根据GenBank中小麦(Triticum aestivum L.)DREB基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦中克隆了DREB基因837 bp的编码区。为进一步研究小麦DREB基因的功能,以pMD18-T-DREB质粒为模板,PCR扩增DREB基因片段,构建了该基因的植物表达载体。经菌液PCR和测序鉴定后,转化到农杆菌LBA4404中,为通过转基因技术深入研究小麦DREB基因的功能奠定了基础。     

小麦GPX基因的克隆及植物表达载体构建

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)是植物体内清除活性氧的主要酶,与植物抗逆性紧密相关。为利用农杆菌介导法转化小麦以及提高小麦抗逆能力奠定基础,采用RT-PCR方法从小麦品种新麦26中克隆GPX基因的编码区序列,运用T-A克隆方法克隆pGM-T载体,通过酶切、连接和转化等技术构建植物表达载体。结果表明:扩增到约为500bp的GPX基因,成功构建植物表达载体pBI121-GPX,并导入农杆菌LBA4044中。     

加工番茄PG基因片段的cDNA克隆及表达载体构建

从加工番茄红熟果实中提取总RNA,根据已发表的多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的序列设计合成一对特异引物,经过反转录PCR,扩增出一条697bp的目的片段。通过TA克隆,把它连接到pMD18-T vector上,测序鉴定其正确性。扩增片段经Sal I和Sma I双酶切插入到表达载体pBinAR CaMV 35S启动子和OCS终止子之间,用M13测序引物和目的片段引物进行PCR扩增鉴定,构建成含有PG基因片段的反义表达载体pBinAR-aPG,为进一步对加工番茄的遗传转化奠定了基础。     

玉米MAPK5基因片段的克隆及RNA干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从玉米品种B73幼苗中克隆出促分裂原活化蛋白激酶基因5(MAPK5)的cDNA部分片段(691 bp),与GenBank已发表的玉米MAPK5(AB016802)同源性达97%。重新设计带酶切位点的引物,克隆出长度为281 bp的正、反向片段。使用DNA重组技术,用pCAMBIA3300质粒构建了玉米MAPK5的RNAi载体。     

梭菌氢酶基因部分片段的同源克隆及敲除载体的构建

为从分子水平探索典型铁还原菌-梭菌的铁还原能力与其氢酶产氢之间的关系,以从水稻土中分离得到一株具有高铁还原能力和高产氢能力的梭菌为材料,通过同源克隆获得长度为761bp氢酶基因的部分序列。生物信息分析发现,该基因片段覆盖氢酶的活性中心,是氢酶的主要功能结构域。采用Overlap PCR的方法构建含有四环素抗性基因的氢酶基因敲除载体(pMD-19-HTH),以期进一步构建氢酶基因缺失的梭菌突变体,为分析氢酶产氢与铁还原的关系奠定基础。     

黄瓜磷脂酶D基因片段克隆及其反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法,从新泰密刺黄瓜的幼叶中得到长为1018 bp的cDNA片段,编码339个氨基酸,与GenBank中甜瓜磷脂酶D基因相比核苷酸同源性为96%,氨基酸同源性为97%.克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构成磷脂酶D基因的反义表达载体.     

重组抗菌肽LfcinB/LfampinB基因的克隆及表达载体的构建

根据GeneBank中提供的牛乳铁蛋白基因序列,设计并合成了重组LfcinB/LfampinB基因,并通过PGEM-Teasy载体扩增。酶切回收的LfcinB/LfampinB片段与中间载体pP6连接。pP6上的启动子、信号肽和调控序列与LfcinB/LfampinB共同切下,获得具有上游调控元件的PLfc/Lfa基因片段。将PLfc/Lfa与pME290表达载体连接,并转化绿脓杆菌。结果表明,本试验成功构建了重组pPLfc/Lfa表达载体。     

玉米淀粉合成酶SSⅡa启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆玉米Zea mays淀粉合成酶SSⅡa启动子,并分析其功能,为进一步研究和应用SSⅡa启动子奠定基础。【方法】通过NCBI上公布的玉米基因组序列,在网站Maize GDB上BLAST查找到SSⅡa 5'侧翼序列,利用PCR方法从玉米B73中克隆SSⅡa启动子;通过Plant Care在线分析启动子顺式作用元件,用特异性引物分别克隆出长度为1 407、867、633、483和365 bp的片段,与植物表达载体p CAMBIA3301连接,构建5种5'缺失体的植物表达载体,命名为P1、P2、P3、P4和P5。用农杆菌介导法转化拟南芥Arabidopsis thaliana,获得转基因拟南芥。【结果】以玉米B73基因组DNA为模板,用特异性引物SSⅡa F/SSⅡaR进行扩增,得到2 526 bp序列;除草剂筛选的阳性拟南芥植株PCR验证均检测出gus基因;GUS组织化学分析表明,5种类型启动子构建的表达载体在成熟期叶片、果荚中均显蓝色;gus基因定量分析表明,成熟期5种转基因拟南芥叶片中,gus基因表达量P1最高,其他基本一致;种子中gus基因表达量P1和P2相近,且高于P3、P4和P5。【结论】成功克隆玉米SSⅡa启动子;构建的5种SSⅡa启动子缺失体表达载体在转基因拟南芥中均具有活性,长度为1 407 bp(P1)和867 bp(P2)的启动子具有胚乳特异性。     

抗性淀粉含量不同的小麦品种(系)淀粉分支酶SBE Ⅱa和SBE Ⅱb基因多态性分析

[目的]克隆抗性淀粉含量不同的小麦品种(系)中淀粉合成酶关键基因SBEⅡa和SBEⅡb进行多态性分析,从分子水平阐述不同小麦品种(系)间抗性淀粉含量差异的原因.[方法]根据GeneBank中公布的小麦SBEⅡa(AF286319.1)和SBEⅡb(AY740401.1)基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆SBEⅡa和SBEⅡb基因序列,利用Clustal.W进行测序结果的比对分析,NCBI Conserved domain和intePro在线网站对SBEⅡa和SBEⅡb氨基酸序列进行结构域预测,寻找影响抗性淀粉含量的主效基因位点.[结果]克隆了SBEⅡa(2 471 bp)、SBEⅡb(2 510 bp)基因ORF(open reading frame,ORF)全长.序列分析表明:SBEⅡa、SBEⅡb基因与公布的序列同源性分别为98.64;和99.07;.[结论]SBEⅡa基因ORF的三个结构域中未发现影响籽粒抗性淀粉含量的候选差异位点.在SBEⅡb基因编码区羧基C-末端的3个候选差异位点和α-淀粉催化酶结构域的1个候选差异位点可能是造成小麦品种(系)间抗性淀粉含量差异的原因.SBEⅡa、SBEⅡb氨基N-末端前面序列中共计10个单碱基变异作为潜在差异位点,也可能参与SBE基因的表达.     

马槟榔MBLⅡ基因重组及果实特异表达载体构建

根据马槟榔(MBLⅡ)甜蛋白核酸序列及相应氨基酸序列的结构及功能预测,采用基因重迭延伸技术在编码A链和B链的序列间插入连接多肽LP4/2A,对MBLⅡ基因进行亚克隆并构建重组体.结果表明:试验克隆全长乙烯应答果实特异性E8启动子,构建了含除草剂抗性基因bar的E8启动子驱动的重组MBLⅡ基因植物表达载体pCA-E8-M...     

牡丹ACC氧化酶基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

利用CTAB改良法提取牡丹洛阳红花瓣总RNA,通过反转录酶和设计的ACC氧化酶基因特异引物合成709bp目的片段,进行测序和比对,以确定目的片段的正确性。在709bpACC氧化酶基因片段和pBI121植物表达载体上选择合适的酶切位点,进行XbaⅠ和SmaⅠ双酶切。将709bp片段上切下的510bp片段反向插入pBI121植物表达载体35S启动子后面,构建成含510bp牡丹ACC氧化酶基因反义表达载体。最后采用电击法转化进感受态农杆菌GV3101,以备用于花粉管通道法转化牡丹。     

蝴蝶兰ACC合成酶基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

［目的］克隆蝴蝶兰ACC合成酶cDNA片段,构建其反义表达载体。［方法］根据已报道的蝴蝶兰ACC合成酶的基因序列,设计并合成了1对引物,通过RTPCR以蝴蝶兰总RNA中扩增出ACC合成酶的cDNA片段,将其连接到MD19T质粒载体上进行测序。用XbaⅠ和SacⅠ对重组质粒和pBI221酶切后连接,构建蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因表达载体。［结果］获得了蝴蝶兰ACC合成酶的cDNA片段,测序结果显示,该片段与参考的已报道序列具有98.92%和76.36%的同源性。通过引入XbaⅠ和SacⅠ酶切位点,进行载体构建,构建了蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因表达载体。［结论］成功构建了蝴蝶兰ACC合成酶的反义基因植物表达载体,为进一步研究其对蝴蝶兰花期和生长的影响打下了基础。     

猪TLR3胞外区片段重组载体的构建、表达和多克隆抗体的制备

为制备猪TLR3(poTLR3)胞外区蛋白的多克隆抗体,从poTLR3克隆载体扩增胞外区基因序列连接到pGEX-4T-1载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下,表达GST-poTLR3融合蛋白,将表达的融合蛋白纯化,免疫家兔制备抗体,并以间接ELISA法测定抗体效价,利用Western-blot和细胞免疫荧光验证抗体与真核表达蛋结合的白特异性.结果表明:制备的多克隆抗体的效价可达1∶128 000,poTLR3胞外区蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并且制备的多克隆抗体特异性好、滴度高.     

生长分化因子15基因的克隆及重组原核表达载体的构建

为克隆人生长分化因子15基因,构建h GDF15基因的重组原核表达载体,为研究该基因的功能奠定实验基础,利用PCR技术克隆其基因序列,将其分别连接至p ET28a和p Cold I载体,构建重组p ET28a-h GDF15和p Cold I-h GDF15原核表达载体,并进行质粒PCR和双酶切验证以及测序验证。结果表明:重组载体构建成功,为进一步研究h GDF15蛋白的作用机制奠定基础。     

小麦淀粉合成相关酶基因 SSⅡa、 SBEⅡa和 SBEⅡb表达序列多态性及对淀粉质量分数的影响

为了探究小麦淀粉合成相关酶SSⅡa、SBEⅡa和SBEⅡb基因表达序列核苷酸多态性及其与淀粉质量分数的关系,根据GenBank中已公布的基因序列设计特异引物,克隆基因的表达序列并测序,通过Clustal X2比对分析,用Dnasp 5.0计算核苷酸多态性信息,并建树做单倍型与淀粉质量分数的相关分析。结果表明,克隆得到3个基因的ORF(Open reading frame)序列,NCBI/Blast同源比对SSⅡa、SBEⅡa和SBEⅡb与GenBank中已登记的序列的同源性分别为98.19%、98.64%和99.04%。在SSⅡa、SBEⅡa和SBEⅡb中分别发现40、14和18个SNP位点,其中共包括4个InDel。在SSⅡa中,其第2外显子区为变异富集区,Tajima’s D检验D值均不显著。可见,这3个基因的多态性信息均较丰富,其单核苷酸多态性与小麦淀粉质量分数之间存在一定的对应关系。