鱼类胚胎低温保存

低温生物学技术的问世，为人类控制利用生物资源提供了有效的手段。畜牧业、医疗保健已率先尝受到了这一技术成果，当今家畜胚胎的低温保存令人振奋鼓舞，其应用程度已遍及全球了。然而鱼类胚胎的冷冻保存研究进展几乎是停滞的，原因不外现行试验研究手段受限以及鱼卵与胚胎的自身特性所致。近年我们对此也进行了初步的探索，并就此课题的研究前景借本文一并讨论。     

鱼类胚胎低温保存

低温生物学技术的问世，为人类控制利用生物资源提供了有效的手段。畜牧业、医疗保健已率先尝受到了这一技术成果，当今家畜胚胎的低温保存令人振奋鼓舞，其应用程度已遍及全球了。然而鱼类胚胎的冷冻保存研究进展几乎是停滞的，原因不外现行试验研究手段受限以及鱼卵与胚胎的自身特性所致。近年我们对此也进行了初步的探索，并就此课题的研究前景借本文一并讨论。     

小鼠胚胎冷冻保存条件研究

为探索在实验室条件下最佳的小鼠胚胎冷冻保存条件.对不同发育阶段小鼠胚胎按照同一个冷冻程序进行冷冻;两个不同的冷冻程序对同一个发育阶段的小鼠胚胎进行冷冻.结果表明,-7℃平衡10 min,然后以0.3℃/min的速率迅速降至-35℃,-35℃平衡5min后投入液氮中,此冷冻程序比较适合小鼠胚胎冷冻;冷冻保存对16细胞以上的小鼠胚胎影响较小.     

奶牛胚胎冷冻保存技术的研究

<正> 自从Whittngham发现经超低温冷冻保存的小鼠胚胎可以成活后,超低温冷冻保存哺乳动物胚胎的方法取得很大进展。目前许多国家都在对不同的胚胎冷冻保护技术进行探讨,如加入冷冻保护剂的种类和浓度、冷冻程序的选择、脱除保护剂的方法等,试图寻找一个胚胎冷冻和解冻的最佳方案。我们从87年开始从事这方面的研究,其目的是探索胚胎冷冻的方法和步骤、寻找适宜于基层生产单位应用的解冻和脱除冷冻保护剂的简易方法。为今后胚胎移植的推广应用打下基础。     

动物胚胎冷冻保存技术的研究进展

分析了动物胚胎冷冻保存的机理,综述了几种常见的动物胚胎冷冻保存方法的研究进展,并对动物胚胎玻璃化冷冻保存技术的发展前景进行了展望。     

星斑川鲽胚胎的玻璃化冷冻保存

为研究星斑川鲽胚胎玻璃化冷冻保存,首先,于室温条件下采用玻璃化液五步平衡法处理星斑川鲽的尾芽期胚胎30 min,比较分析分别含有葡萄糖、果糖、蔗糖和海藻糖的4种不同玻璃化液(PMG3G、PMG3F、PMG3S、PMG3T)的毒性,发现含有海藻糖的玻璃化液(PMG3T)对尾芽期胚胎的毒性最小,胚胎的成活率与孵化率相对较高,分别为75.00%±5.43%和50.00%±4.53%(P0.05)。其次,分析玻璃化液PMG3T对星斑川鲽囊胚期至出膜前期7个时期的胚胎的毒性,发现尾芽期胚胎和心跳期胚胎经处理后成活率较高,分别为69.33%±6.43%和72.67%±3.94%(P0.05),但心跳期胚胎的孵化率较高,为65.33%±3.91%(P0.05),尾芽期胚胎次之,说明心跳期胚胎对PMG3T的耐受能力相对于尾芽期胚胎更好,更适宜进行胚胎的玻璃化冷冻保存实验。最后,采用玻璃化液PMG3T对心跳期胚胎进行–196℃冷冻实验,发现所处理的60粒胚胎中有7粒成活,可漂浮水面,继续培养后可见进一步发育,但未孵化出膜。另外,将100 mL未受精卵(未经玻璃化液处理)置于–20℃,分别在冷冻5～70 min时取出10 mL复温并进行授精,结果显示,冷冻5 min的卵的受精率为89.83%±6.51%(P0.05),随着冷冻时间的延长,受精率越来越低,冷冻70min时受精率为3.71%±1.27%,畸形率越来越高,在冷冻70min时达到100%。本研究筛选出比较适宜的玻璃化液、低温耐受性较高的胚胎发育时期,为星斑川鲽胚胎低温冷冻保存技术的建立和种质的长期保存和应用提供了实验数据。     

玻璃化法冷冻保存牛体外受精胚胎

本研究探讨了玻璃化冷冻保存对牛体外受精胚胎冷冻后存活的影响。7日龄的胚胎在10％甘油＋20％丙二醇的玻璃化冷冻液中，室温下停温10min，其孵化率为86．6％，与对照的83．2％相比，无明显影响（P＞0．05）。然10％甘油＋20％乙二醇，25％甘油＋25％乙二醇及25％甘油＋25％丙二醇均明显降低胚胎的孵化率（P＜0．01）。7日龄胚胎经10％甘油及10％甘油＋20％乙二醇依次平衡5min后,再置于25％甘油＋25％乙二醇的冷冻液中，20s内投液氮玻璃化冷漠，冻后孵化率达80．8％，明显高于其它平衡方法。冷冻液为25％甘油＋25％乙二醇的胚胎冻后总孵化率为72．1％，明显高于25％甘油＋25％丙二醇的60．9％。这些结果表明：牛胚胎玻璃化冷冻保存的成功率在很大程度上取决于防冻剂的种类、浓度及平衡方法。     

用玻璃化冷冻保存山羊胚胎的研究

试验用下班化冷冻保存山羊胚胎１４２枚，其中３５枚移植受体１３只，妊娠率和产羔率分别为６１．５％（８／１３）和４０％（１４／３５）；１０７枚（桑椹胚４４枚和囊胚６３枚）在液氮中保存３和４．５年后解冻与培养。结果表明，桑椹胚形态和发育正常率分别为４７％（２１／４４）和３８．６％（１７／４４），囊胚分别为６３．５％（４０／６３）和４７．６％（３０／６３）。囊胚解冻后形态正常率和发育率显著高于桑椹胚     

小鼠胚胎直接投入液氮冷冻保存试验

室温下,将292枚小鼠胚胎在含128.9g/L甘油PBSS(含20％犊牛血清的磷酸盐缓冲液)和含193.2g/L甘油+85.6g/L蔗糖PBSS内分别孵育片刻,装管后直接投入液氮冷冻保存。冻胚快速解冻后,用含342.3g/L蔗糖PBSS脱去甘油,用PBSS清洗后镜下观察评定,胚胎回收率为86.9％(254/292),胚胎形态正常率为77.1％(196/254)。其中部分桑椹胚经体外培养,囊胚发育率为71.4％(20/28)。将110枚冻胚移植给7只受体,3只妊娠,产仔12只(5,7),妊娠率为43％(3/7),产仔率为10.9％(12/110),其中囊胚移植1只受体妊娠产仔3只,产仔率为25％(3/12)。     

小鼠胚胎冷冻保存试验

应用4～10周令的杂种 CB6/Han 和纯种 C57BL/Han 小鼠73只进行试验,共采胚胎523枚,将发育正常,形态完好的157枚胚胎低温冷冻保存。解冻后回收率为83.4％,其中45％(59枚)形态完好,(囊胚56％,桑椹胚20％)。将其培养24—48小时后,71.2％(42枚)继续发育到扩张囊胚(其中囊胚为76.5％,桑椹胚为37.5％)。应用3′6′—二乙酰基荧光素(FDA)染色进行胚胎质量评定,对胚胎无损害。     

秦川牛胚胎冷冻保存效果

为探明秦川牛胚胎冷冻保存技术的可行性,将48头秦川牛母牛进行多次超数排卵处理、人工授精,并于授精后第7天非手术法获得胚胎,把获得的A级胚用不同浓度甘油(1.0~5.0 mol/L)和乙二醇(1.0~5.0mol/L)进行处理,并采用常规冷冻法和快速冷冻法进行冷冻,解冻后进行体外培养和不同发育阶段胚胎(桑椹胚、囊胚和扩张囊胚)移植,统计其存活率、孵化率和妊娠率等。结果表明:秦川牛7日龄胚胎能耐受甘油的浓度为2.0~4.0mol/L,乙二醇为1.0~3.0mol/L;常规冷冻法解冻后胚胎的存活率和孵化率显著(P0.05)高于快速冷冻法,胚胎移植妊娠率和产犊率差异不显著(P0.05);常规冷冻桑椹胚的冻后存活率、孵化率极显著(P0.01)低于囊胚和扩张囊胚,移植妊娠率和产犊率显著(P0.05)低于囊胚和扩张囊胚。     

用玻璃化冷冻保存山羊胚胎的研究

试验用玻璃化冷冻保存山羊胚胎１４２枚，其中３５枚移植受体１３只，妊娠率和产羔率分别为６１．５％（８／１３）和４０％（１４／３５）；１０７枚（桑椹胚４４枚和囊胚６３枚）在液氮中保存３和４．５年后解冻与培养。结果表明，桑椹胚形态和发育正常率分别为４７％（２１／４４）和３８．６％（１７／４４），囊胚分别为６３．５％（４０／６３）和４７．６％（３０／６３）。囊胚解冻后形态正常率和发育率显著高于桑椹胚（Ｐ＜０．０５）。     

胚胎工程技术及其在畜牧业中的应用

胚胎工程技术研究的目的,是对哺乳动物的胚胎在体外进行人为控制操作,让其继续发育,进而获得优良或珍稀动物个体,并应用这类技术进行基础研究和应用开发性研究。文章主要叙述了胚胎移植、胚胎冷冻保存、胚胎分割、体外受精、性别鉴定及控制、转基因动物、细胞核移植、胚胎干细胞和胚胎嵌合等胚胎工程技术及其在畜牧业中的应用前景。     

奶牛胚胎直接投入液氮冷冻保存试验

将奶牛7日龄胚胎,常温下在含128.9g/L甘油PBSS肉孵育20min后移入193.2g/L甘油+85.6g/L蔗糖PBSS内孵育7min,装管后即投入液氮内冷冻保存。182d后解冻8枚,用含342.3g/L蔗糖PBSS脱去甘油,7枚可供移植用,胚胎可用率为87.5％(7/8),移植给7头受体牛,3头妊娠,妊娠率为42.9％。     

人胚胎成纤维细胞的冷冻保存

将6～14代的人胚胎成纤维细胞以0.5、0.62、0.89和1.12 ℃/min的降温速率用胚胎冷冻法进行超低温冷冻保存,解冻活率达到0.83～0.93.并证明平衡时间以2～2.5 h为宜,诱发结晶步骤可以省略.其饲养层寿命长达25～28 d,还可反复冷冻,长期应用于胚胎干细胞的分离与克隆研究.     

人胚胎干细胞不同冷冻保存方法的比较

【目的】比较人胚胎干细胞不同冷冻保存方法的复苏率,建立高效的冷冻保存方法。【方法】利用慢速冷冻、开放式和密闭式玻璃化冷冻3种方法保存人胚胎干细胞克隆,比较这3种方法的复苏效率,并通过免疫组化染色检测复苏后细胞的OCT-4表达。【结果】开放式快速冷冻方法的克隆复苏率为(97.5±5.0)%,密闭式快速冷冻方法的克隆复苏率为(96.7±5.8)%,均极显著高于慢速冻存方法(25.7±4.1)%。解冻后的胚胎干细胞克隆仍然保持胚胎干细胞的特性。【结论】开放式和密闭式玻璃化冻存方法能够高效保存人胚胎干细胞。