嵌合猪圆环病毒对仔猪的免疫保护研究

为分析嵌合猪圆环病毒(PCV1-2)对仔猪的免疫效力,检测了PCV1-2免疫诱导仔猪产生抗猪圆环病毒II型(PCV2)感染的保护性免疫。将10头28日龄健康普通仔猪随机平均分成两组,一组肌注免疫106.05TCID50 PCV1-2作为免疫组;另一组不予免疫作为对照。到免疫后28天,免疫组仔猪血清中PCV2 ORF2蛋白抗体全部转为阳性。在免疫后28天,所有仔猪经口鼻予以106.95TCID50 PCV2攻击。攻毒后,免疫组仔猪全部保持临床健康,而对照组仔猪全部出现了PCV2疾病的临床症状;免疫组血清和淋巴组织中PCV2 DNA载量均显著(P<0.05)减少;对照组仔猪淋巴组织普遍出现中度到重度的淋巴细胞减少与组织细胞浸润,而免疫组没有。研究数据表明：PCV1-2免疫诱发了仔猪对PCV2感染的保护性免疫,有望成为候选PCV2弱毒疫苗。     

嵌合猪圆环病毒对仔猪的致病性与免疫原性

为分析嵌合猪圆环病毒(PCV1-2)对仔猪的致病性与免疫原性,检测了健康普通仔猪接种PCV1-2后的临床症状、病理变化、血清与组织中的病毒含量及血清学变化。结果显示,仔猪接种PCV1-2后增重和饲料转化效率未受影响,未出现可见的临床症状和大体病理变化,仅部分出现轻微的组织病理变化。血清中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2蛋白抗体在接种后第14天出现阳转,第28天时抗体阳性率达到100%,表明PCV1-2诱发仔猪快速产生了针对PCV2 ORF2蛋白抗原的特异性抗体反应。荧光定量PCR结果显示,血清中PCV1-2 DNA含量在接种后逐渐上升,第28天时达到最高,之后迅速下降;第35天宰杀时组织中病毒含量以肺门淋巴结中最高,心脏中最低;而常规PCR难以检出血清和组织中的PCV1-2 DNA,表明PCV1-2接种后只引起仔猪的轻微感染。研究数据表明,PCV1-2对仔猪具有良好的免疫原性,其致病性明显减弱。     

DNA免疫法制备猪圆环病毒2型ORF3抗体

为了制备猪圆环病毒2型(PCV2)开放阅读框3(ORF3)蛋白的抗体,并为ORF3功能研究奠定基础,用PCR方法扩增PCV2 ORF3基因,对其PCR产物用EcoR I与Xho I进行酶切,并对真核表达载体pCDNA3.1(+)进行同样酶切,连接2种目的酶切产物后转化E.coli DH5?感受态,菌落PCR和序列测定结果显示成功构建出重组质粒pCDNA3.1-PCV2 ORF3。将该重组质粒接种BALB/c小鼠,用间接免疫荧光(IFA)检测小鼠血清PCV2 ORF3抗体的特异性及其效价。IFA结果证实经PCV2 ORF3重组质粒接种所制备的小鼠血清是PCV2 ORF3的特异性抗体,小鼠血清PCV2 ORF3抗体效价在经过4次接种后均达到1:25以上,表明,成功制备了具有较高效价的PCV2 ORF3抗体。研究结果提示,可以通过质粒DNA免疫方法来快速、简便地制备PCV2 ORF3抗体,为PCV2 ORF3抗体制备提供了一种新的有效途径。     

猪圆环病毒2型和伪狂犬病弱毒疫苗体外共接种对猪外周血单个核细胞调节性细胞因子mRNA表达的影响

为分析猪圆环病毒2型（PCV2）对伪狂犬病弱毒苗（PRV）免疫反应的影响,用real-time PCR技术检测了仔猪外周血单个核细胞（PBMC）体外单接种和共接种PCV2与PRV后调节性细胞因子IL-4、IL-10、IL-12p40及IFN-γ的mRNA表达水平。结果表明,PRV能引起IL-4、IL-12p40与IFN-γ的mRNA表达上调,PCV2能引起IL-4、IL-10与IL-12p40的mRNA表达上调;而且,PCV2能抑制PRV诱导IL-4、IL-12p40及IFN-γ的mRNA表达上调,其中对IFN-γ mRNA表达的抑制效果最为显著（P<0.05）,提示PCV2可能会对PRV的细胞免疫反应产生不利影响。     

不同佐剂对猪传染性胃肠炎病毒S蛋白和猪流行性腹泻病毒S蛋白免疫原性的影响

本研究旨在探究不同佐剂对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白和猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白免疫原性的影响。IPGT诱导重组表达菌株Rosetta(DE3)-pET28a-TGEV-S2/3和BL21(DE3)-pET28a-PEDV-S1/2/3,制备重组蛋白TGEV-S2、TGEV-S3、PEDV-S1、PEDV-S2和PEDV-S3,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,将重组蛋白等量混匀分别与3种佐剂ISA 71VG、ISA 201VG和ISA 15AVG进行乳化制备免疫原免疫蛋鸡;Western blot检测蛋鸡血清抗体效价,免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体与病原的反应活性;监测鸡群平均日增重。结果显示,重组蛋白TGEV-S2、TGEV-S3、PEDV-S1、PEDV-S2和PEDV-S3的分子量依次为25 ku、28 ku、26 ku、24 ku和21 ku。Western blot分析显示,5种蛋白均具有良好的免疫原性;疫苗二次免疫后7天抗体效价达到高峰,ISA 201VG佐剂组、ISA 71VG佐剂和ISA 15AVG佐剂组组最高抗体效价依次为64000倍、32000倍和8000倍,对照组未检测到特异性抗体;ISA 71VG和ISA 201VG组对产蛋率下降相对较大,ISA15AVG 佐剂疫苗免疫组对产蛋率影响相对较小,免疫后7天后试验组产蛋率恢复正常。ISA 71VG佐剂组蛋鸡平均日增重显著降低,ISA 201VG和ISA 15AVG佐剂组蛋鸡平均日增重与对照组无显著差异;ISA 201VG佐剂组血清抗体与病毒反应活性良好,中和效价可达1:256。ISA 201VG佐剂配伍的疫苗免疫效果优于其他两种佐剂疫苗。     

坦布苏病毒囊膜蛋白诱导的小鼠免疫应答

为了研究坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)的免疫原性,利用大肠杆菌表达系统高效表达坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)并对其诱导小鼠免疫应答进行了研究。结果表明,E蛋白免疫BALB/c小鼠后,免疫组小鼠血清中抗体效价均可达1∶51 200以上;同时,E蛋白可显著诱导血清中细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ的表达,免疫组小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量均极显著高于对照组(P0.01),IFN-γ含量则显著高于对照组(P0.05);此外,与对照组相比,E蛋白还可极显著刺激小鼠脾脏淋巴细胞的增殖,上述结果表明,E蛋白免疫后,小鼠机体可产生显著的体液免疫和细胞免疫反应。攻毒保护性试验结果显示,攻毒后,经荧光定量RT-PCR检测,E蛋白免疫组小鼠脑、肝脏、脾脏、卵巢、肾脏中坦布苏病毒载量均显著低于对照组,表明免疫E蛋白可有效抑制坦布苏病毒在小鼠各个组织中的增殖。结果表明,大肠杆菌表达的坦布苏病毒E蛋白可作为坦布苏病毒亚单位疫苗的候选抗原,为进一步预防和控制坦布苏病毒病奠定理论基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型Cap、Rep基因原核表达质粒的构建与表达

为进一步建立猪圆环病毒Ⅱ型(PCVⅡ)的有效检测方法,以及制备结构蛋白Cap和非结构蛋白Rep的单克隆抗体。根据GenBank中登录的PCVⅡ序列,设计2对特异性引物,PCR扩增出Cap、Rep蛋白基因,连接到pMD18-T simple质粒上,测序正确的Cap和Rep基因双酶切后分别插入到pACYCDuet-1上,构建成原核表达质粒pACYCDuet-1-Cap、pACYCDuet-1-Rep和pACYCDuet-1-Rep-Cap,然后将上述原核表达质粒转化BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达。结果表明：成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了猪圆环病毒Ⅱ型的Cap、Rep蛋白,且Rep、Cap蛋白共表达质粒pACYCDuet-1-Cap-Rep的表达效果优于其他2种质粒。     

鸭病毒性肝炎间接血凝诊断抗原的制备

【研究目的】建立一种便于检测鸭病毒性肝炎抗体的方法。【研究方法】将纯化的鸭病毒性肝炎I型病毒(DHV-I)致敏双醛化红细胞,制备检测DHV抗体的间接血凝诊断抗原。【研究结果】使用该抗原对9种常见的禽传染病阳性血清、15只随机抽样的非免疫鸭血清进行检测,抗体均为阴性;检测被鸭病毒性肝炎I型病毒阻断后的阳性血清,抗体为阴性;用不同批次的诊断抗原检测同一血清样品结果显示一致;敏感性是琼脂扩散试验的32～64倍;对15只随机抽样的免疫鸭进行检测,阳性率达93%。【结论】该方法敏感性较高、特异性强、重复性好,可用于疫苗免疫后抗体水平的检测及鸭病毒性肝炎的流行病学调查。     

猪圆环病毒II型ORF4真核表达载体构建及其抗体制备

为构建猪圆环病毒II型(PCV2) ORF4基因的真核表达载体,并制备ORF4抗体。用PCR方法扩增PCV2 ORF4基因,将其克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+)或pEGFP-C1,成功构建出重组质粒pCDNA-ORF4、pEGFP-ORF4。重组质粒pEGFP-ORF4转染PK15细胞后,pEGFP-ORF4蛋白在细胞中明显表达,荧光信号主要定位于细胞核内。重组质粒pCDNA-ORF4接种BALB/c小鼠后,接种小鼠血清能与PCV2发生特异性免疫反应,经4次接种后抗体效价均达到1:26以上,表明诱导产生了PCV2 ORF4抗体。研究结果表明,构建了2种PCV2 ORF4真核表达载体,并制备了PCV2 ORF4抗体,为PCV2 ORF4基因功能研究奠定了基础。     

仔猪感染PRRSV-FJ04A毒株的组织病理学及病毒在体内分布研究

旨在研究猪繁殖与呼吸综合征病毒福建04A(PRRSV-FJ04A)株感染仔猪后的组织病理变化和病毒在仔猪体内各器官的分布情况。采用PRRSV-FJ04A株人工接种30日龄PRRSV抗体阴性仔猪,通过组织学观察与荧光定量RT-PCR技术,对呼吸道、消化道、泌尿道主要器官及免疫器官等组织进行了病理和病毒抗原定量分析。结果表明,PRRSV-FJ04A毒株接种猪群10天,肺脏中有大量肺泡细胞变性、坏死,巨噬细胞增生;淋巴结淋巴细胞坏死;脑神经元变性、坏死,脾小体有大量细胞碎片,肝脏有颗粒变性,扁桃体隐窝上皮脱落等;PRRS病毒在猪群体内各器官含量分布含量以最高为肺脏,其次为淋巴结、脑、扁桃体、血液等,而在肾脏中病毒含量最低。     

鸡传染性囊病二价活疫苗攻击保护滴度的测定

使用ＳＰＦ雏鸡进行鸡传染性囊病二价活疫苗的攻击保护滴度的测定。ＳＰＦ雏鸡１４日龄免疫，于免疫后７ｄ、８ｄ、９ｄ、１０ｄ、１２ｄ、１４ｄ采血进行ＩＢＤ中和抗体的测定，同量分别进行标准Ｉ型强毒ＣＪ８０１株和标准变异株强毒１０８４Ａ株的攻击，建立抗体滴度与攻击保护率之间的直线回归方程。二价苗免疫后１４ｄＩＢＤ中和抗体滴度达到２９６８（ＧＭＴ），其对ＣＪ８０１株和１０８４株的攻击保护率分别为８９．２１％和     

仔猪感染猪等孢球虫后T细胞亚群的动态变化

为了研究仔猪感染猪等孢球虫后T细胞亚群的变化规律,应用纯种猪等孢球虫孢子化卵囊人工感染9头6日龄仔猪,分别检测了感染前1d和感染后1、3、6、9、11d(DPI)外周血中CD3 、CD4 、CD8 T细胞。结果显示,DPI3,CD3 、CD4 T细胞增加,之后下降,但差异均不显著(p>0.05);CD8 T细胞在DPI6增加,DPI 9达峰值(P<0.05)。CD4 /CD8 值在DPI 6下降,DPI 11达到最低点。表明DPI 3感染仔猪的免疫功能有所增强,而DPI 8后仔猪免疫功能受到抑制。     

猪伪狂犬病毒Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究根据猪伪狂犬病病毒gE基因序列,设计一对特异引物和探针,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬野毒株及基因缺失疫苗株的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。结果表明：TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法灵敏度可达2.23×101拷贝/μL,比常规PCR检测方法高100倍;同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒（PPV）、均为阴性,无交叉反应;对30份疑似病料的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR检测阳性率分别为40%和33%,两者符合率90%。表明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测大量样品,可适合于PRV的临床诊断和流行病学调查。     

CSFV,SIV,PCV2,PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)基因序列,设计了5对引物分别用于扩增CSFVE2、SIV、PCV2ORF2、PRVgB、PRRSVN基因的目的片段。通过对反应条件进行优化,建立了检测CSFV、SIV、PCV2、PRV和PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法。敏感性和特异性结果显示,该mPCR对5种病毒的最低核酸检测量为10pg。而对大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、猪细小病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒的多重PCR的扩增结果均为阴性。临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对SIV、CSFV、PCV2、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。     

猪血清免疫球蛋白对新生仔猪生产性能的影响

为了考察在仔猪出生24h内外补免疫球蛋白对其生产性能的影响,对不同试验组的仔猪在出生24h内分别灌服0.5g、0.8g、1.0g,观察14d内猪只的发病与日增重的情况,结果表明,在仔猪出生24h内补喂0.8g的免疫球蛋白,14d后日增重效果最明显;外补免疫球蛋白1.0g试验组的在预防仔猪腹泻发病率效果最好。