共表达O型口蹄疫病毒P12A+3C基因的重组杆状病毒的构建

构建共表达O型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白前体P12A和蛋白酶3C的重组杆状病毒,为进一步研究FMDV空衣壳抗原和基因工程亚单位疫苗奠定基础。从质粒T-OP1中扩增出编码O型FM-DV衣壳蛋白前体的P12A基因,并将其插入到杆状病毒转移载体pFastDual-3C的PH启动子之下,构建重组杆状病毒转移载体pD-P12A3C。通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒B-P12A3C,转染Sf9细胞,获得表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒。重组杆状病毒经增殖并感染Sf9细胞后,通过双抗体夹心ELISA方法及间接免疫荧光来检测目的蛋白的表达。结果表明,表达产物能被O型FMDV阳性血清识别,具有一定的反应原性,表明重组杆状病毒构建成功,该研究为O型FMDV空衣壳的体外组装及基因工程亚单位疫苗的研究提供了前期材料。     

COVID-19病毒N基因在昆虫细胞内的表达

为获得具有和天然蛋白质类似功能与活性的COVID-19核衣壳蛋白并应用于实际检测中,首先根据Bac-to-bac昆虫表达系统和人工合成的COVID-19核衣壳蛋白(N蛋白)序列,将pFastBac^TMHTB载体上的酶切位点BamHⅠ和XbaⅠ分别加入上下游引物,利用PCR技术对N基因进行扩增,先后连接T-Vector pMD19(simple)载体与pFastBac^TMHTB载体,并获得重组质粒pMD19-T(simple)-COV19-N和pFastBac^TMHTB-COV19-N,最终在DH10Bac细胞中构建重组杆粒DH10Bac-pFastBac^TMHTB-COV19-N并使其在昆虫细胞Sf9内进行表达,获得重组蛋白后进行SDS-PAGE和WB分析。通过PCR方法成功扩增N基因,构建的重组质粒pMD19-T(simple)-COV19-N经PCR和双酶切鉴定均证明正确,在DH10Bac细胞内构建的重组杆粒DH10Bac-pFastBac^TMHTB-COV19-N通过PC...     

具有荧光标签的猪瘟病毒Erns蛋白在杆状病毒表达系统中的表达

为了获得具有标记的猪瘟病毒Erns蛋白,通过基因工程操作,使猪瘟病毒Erns基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合,用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中高效表达了ErnsGFP融合蛋白,经Western Blot和荧光显微镜观察证实,表达产物分子量正确,且发出易于检测的绿色荧光,具有标记的Erns蛋白的获得...     

类猪圆环病毒P1 VP1蛋白在昆虫细胞中的表达及特性分析

为了鉴定类猪圆环病毒P1 VP1蛋白能否在体外自组装成病毒样颗粒(VLPs),首先PCR扩增P1 ORF1基因,利用p Fast BacTM1载体构建重组质粒,通过脂质体转染在Sf9细胞中表达P1 ORF1基因。然后通过RT-PCR技术及Western Blot分别从转录和蛋白质水平上鉴定该基因的表达,应用透射电镜观察该蛋白质是否形成了VLPs。结果显示,转染Sf9细胞后,第5天开始出现细胞病变;从接毒细胞中提取总RNA,经Recombinant DNaseⅠ处理除去基因组DNA后,RT-PCR能够扩增出362 bp的目的片段;收获接毒后72 h的细胞,Western Blot分析显示,P1 ORF1重组病毒样品能够与抗P1 VP1单抗发生特异性反应;电镜观察发现,该蛋白在Sf9细胞中形成了近椭圆形的包涵体。利用杆状病毒表达载体系统成功地在Sf9细胞中表达了类猪圆环病毒P1的ORF1基因,并证实在本试验条件下P1 VP1蛋白不能自组装成VLPs,为进一步研究P1 VP1蛋白的免疫学特性奠定基础。     

H9N2亚型AIV HA基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

[研究目的]利用杆状病毒表达系统表达AIV H9N2亚型HA基因以获得可以利用的HA蛋白;[方法]应用DNAStar软件,参照Genbank中注册的AIV H9N2亚型HA基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR方法成功地扩增出带双酶切位点的H9亚型AIV的HA基因,通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切位点将H9HA基因插入转移质粒载体pFastbacHTa中,获得重组转移载体pFastbacHTa-H9HA并将其转化DH10 Bac细胞,与Bacmid发生位点特异性转座作用,得到重组穿梭载体Bacmid-H9HA,再将其转染昆虫细胞High Five,进行PCR鉴定、SDS-PAGE和Westem Blot检测;[结果]HA基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下游,HA基因在High Five细胞中得到了表达,H9HA大小约为67 KD,而且表达的产物具有特异免疫学反应性;[结论]HA基因在昆虫细胞获得表达,为进一步生产检测H9N2亚型流感病毒的检测试剂或者构建亚单位疫苗奠定了基础.     

新西兰白兔γ-干扰素在昆虫细胞中的表达及其活性测定

用RT-PCR方法对ConA刺激后的新西兰白兔外周血淋巴细胞(PBMC)扩增家兔γ-干扰素(IFN-γ)基因并进行测序,测序结果显示,与GenBank公布的序列核苷酸同源性达到99.4%～99.6%,氨基酸同源性为98.8%～99.4%;然后通过克隆、转化将家兔γ-干扰素基因转入转移载体pFastBacTM1,得到重组转移载体pFastBacTM1-IFN-γ,用pFastBacTM1-IFN-γ转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经筛选得到重组穿梭载体Bacmid-IFN-γ,用此质粒转染Sf9昆虫细胞,得到重组病毒rAcV-Bac-IFN-γ,经RT-PCR鉴定,结果显示重组IFN-γ在Sf9昆虫细胞中得到表达。用兔IFN-γELISA试剂盒测得重组兔IFN-γ的浓度为1 950 pg/mL。细胞病变抑制法结果显示,重组兔IFN-γ在MDCK上显示了较高的抗病毒活性,并测得重组兔IFN-γ的活性约为5.12×105 U/mg。     

pCB-zeolin-GFP表达载体的构建及瞬时表达

为利用荧光蛋白基因GFP检测外源基因在转基因植株中的表达和定位,构建含有GFP基因的植物表达载体pCB-zeolin-GFP。在目的基因的开放阅读框（ORF）两端设计引物,并引入酶切位点和保护碱基,用PCR方法从pDHA扩增得到zeolin基因的全长,克隆到中间载体pMD18-T,分别用NcoⅠ和BglⅡ2种限制性内切酶酶切重组质粒和经过改良的pCAMBIAI1302植物表达载体,经回收、连接、转化、鉴定后,利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞,通过共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白在洋葱表皮细胞中的瞬时表达。构建了zeolin基因与绿色荧光蛋白（GFP）融合的植物表达载体pCB-zeolin-GFP,并在洋葱中得到了表达。构建的融合植物表达载体pCB-zeolin-GFP正确,该载体的成功构建为今后进行基因转移、基因功能研究及培育新品种奠定了基础。     

含铁蛋白cyb5融合基因莱茵衣藻核转化表达载体的构建及转化

旨在构建并转化细胞色素cytb5基因的衣藻核转化表达载体,为其在衣藻叶绿体中对铁的利用情况研究奠定基础。将克隆的PsaD信号肽、细胞色素b5和增强型绿色荧光蛋白基因的基因融合,插入到pDBle载体中;采用玻璃珠法,将重组子导入莱茵衣藻(CW15)中;经博来霉素筛选获得转基因植株并鉴定。本项研究通过分子克隆技术获得了衣藻自身来源的PsaD信号肽、裂殖酵母来源的细胞色素b5和常用增强型绿色荧光蛋白基因片段;重组质粒pDBle-b5、pDBle-bG和pDBle-TbG测序完全正确;经博来霉素抗性筛选,获得转化衣藻单克隆;通过PCR检测转化衣藻基因组DNA,扩增片段与预期相符。实验结果表明,成功构建了pDBle-b5、pDBle-bG和pDBle-TbG衣藻核转化表达载体,重组质粒已整合到莱茵衣藻基因组中。     

禽流感病毒H9N2亚型HA蛋白在水稻胚乳中的稳定、高效表达及活性鉴定

为了在体外获得表达量高、储存容易、成本低且免疫活性高的H9N2亚型HA蛋白,利用水稻胚乳表达系统表达HA蛋白。首先,将HA基因根据水稻偏好密码子进行优化,合成到pUC57载体上,通过双酶切、连接将HA基因先后构建到中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300上;再通过电极法将pCAMBIA1300-HA导入到根癌农杆菌EHA105中;然后用农杆菌侵染TP309水稻愈伤组织;最后经潮霉素筛选、分化、生根、移栽至田间种植。利用CTAB法提取叶片基因组DNA,PCR鉴定T_0阳性植株;利用Dot Blot和Western Blot检测HA蛋白在水稻胚乳中的表达;提取阳性的T_1叶片DNA,通过荧光定量PCR方法筛选纯合植株;利用温汤杀雄剪颖授粉法,将含有HA蛋白的TP309与低谷蛋白水稻杂交;利用Western Blot检测杂交后的T_3植株蛋白表达量;利用双抗夹心ELISA方法比较水稻源和昆虫表达HA蛋白的活性。结果显示,成功构建了中间载体pMP3-HA和植物表达载体pCAMBIA1300-HA,且pCAMBIA1300-HA成功导入到根癌农杆菌EHA105中;PCR检测到有66株植株的HA基因成功整合到水稻基因组;Dot Blot和Western Blot检测结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达;利用荧光定量PCR方法,107株T_1中筛选到31株纯合植株;Western Blot检测结果表明,杂交后的HA蛋白表达量大幅度提高;双抗夹心ELISA结果证实,水稻胚乳表达的HA蛋白的活性高于杆状病毒-昆虫细胞。     

湖羊myogenin重组基因表达及其亚细胞定位的研究

摘 要： [目的]构建湖羊肌细胞生成素（myogenin,MyoG）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白真核表达载体,分析EGFP-MyoG融合蛋白在NIH-3T3细胞的表达及亚细胞定位。[方法]利用PCR技术扩增出MyoG基因完整的CDS,克隆至真核表达载体pEGFP-C1,转染NIH-3T3细胞,荧光显微镜下观察EGFP-MyoG融合蛋白的亚细胞定位,并通过RT-PCR、western blot检测蛋白的表达。[结果]酶切鉴定和DNA序列分析均证实,MyoG基因已正确插入pEGFP-C1中,获得融合蛋白表达载体pEGFP-C1-MyoG,转染NIH-3T3细胞48h后,RT-PCR检测到约680bp的特异性条带,western blot检测出相对分子量约为53kD的融合蛋白,荧光显微镜分析表明,MyoG蛋白定位于细胞核。[结论]融合蛋白EGFP-MyoG在NIH-3T3细胞中成功表达,并定位于细胞核。     

草地贪夜蛾Sf9细胞对饥饿诱导自噬的响应

为研究草地贪夜蛾对饥饿诱导自噬的响应。从草地贪夜蛾EST数据库中筛选到一段核苷酸序列,设计特异性引物,RT-PCR技术从草地贪夜蛾Sf9细胞中扩增该核苷酸序列,经过生物信息学分析该序列与昆虫自噬相关基因ATG8同源性最高,命名为SfATG8基因,并构建了pIEX-4-mCherry-EGFP-SfATG8载体转染Sf9细胞。Sf9细胞经饥饿(PBS)诱导4 h后,Lyso-Tracker染色、Western Blotting、共聚焦显微镜检测细胞对自噬的响应程度。结果表明,经饥饿(PBS)诱导4 h的Sf9细胞中出现Sf Atg8-PE的表达,共聚焦显微镜检测到Sf9细胞膜上的自噬小体。以上证据证实饥饿(PBS)能诱导Sf9细胞发生自噬,为深入研究Sf9细胞对自噬的响应奠定了基础。     

牛结核杆菌MPB64蛋白的真核表达

利用PCR技术扩增出牛结核杆菌mpb64基因片段,克隆到真核载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pCM64,将该重组质粒转染SP2/0细胞,间接免疫荧光试验和Western blotting检测目的基因的表达情况.结果表明,在转染了重组质粒pCM64的SP2/0细胞中出现绿色荧光,转染的SP2/0细胞泳道23 kDa处出现特异条带,说明mpb64基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达.     

猪瘟病毒E2基因的哺乳动物细胞表达

利用PCR技术扩增出猪瘟病毒主要结构蛋白E2基因的全序列,将其克隆到真核表达载体PEGPF-C1中,获得重组质粒PEGPF-E2,经PCR,酶切鉴定和序列分析证明目的基因的大小、插入位置和读码框完全正确。利用脂质体将阳性质粒PEGFP-E2转染入猪肾来源的细胞PK-15中,G418筛选出阳性的细胞克隆,通过PCR证明E2基因存在于筛选出的阳性细胞克隆中。利用荧光倒置显微观察阳性细胞发现有融合蛋白的表达,利用夹心ELISA猪瘟病毒抗原检测试剂盒检测证明表达的融合蛋白为猪瘟病毒E2基因编码蛋白。     

猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2的克隆表达

为了研究不同时间段细胞MHC分子表达的变化情况,从分子水平上说明E2基因与NHC之间的关系,本研究克隆了中国猪瘟病毒强毒石门毒株E2基因,构建了pcDNA3.0真核表达质粒P-E2基因。限制性内切酶进行双酶切和序列分析鉴定E2基因插入位置、方向和读码框架的正确性。构建成功的真核表达质粒P-E2,用脂质体转染方法瞬时转染进行体外细胞表达,转染后24,48 h后用Western-blot和间接免疫荧光技术检测P-E2基因质粒在PK-15细胞内的表达情况。结果表明：用His抗体进行间接免疫荧光检测发现E2基因得到表达,并定位于细胞浆,同时Western-blot检测后发现重组质粒P-E2转染后也在PK-15细胞中得到了表达。为进一步研究猪瘟病毒与宿主细胞之间的关系,病毒的致病机理提供了基础材料。     

PRRS病毒E基因的克隆及表达载体的构建

分别以质粒pBV221和pPIC9K为表达载体,成功构建了PRRS病毒E基因克隆载体,转化后经抗性筛选、PCR扩增、双酶切鉴定,确认得到了含有目的基因的阳性克隆。对含有E蛋白原核表达载体的阳性克隆进行诱导表达,经过酶联免疫鉴定,结果显示外源蛋白在宿主菌中有表达,成功实现了在大肠杆菌细胞中的克隆。本研究成功构建了PRRSV BJ-4毒株E基因的原核表达载体和真核表达载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro 中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒表达载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFV E2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,用流式细胞仪检测证明,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。为下一步利用细胞免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

长白猪甘露聚糖结合凝集素A基因的 克隆与原核表达

从长白猪肝脏细胞中提取总RNA,通过RT-PCR法扩增pMBL-A基因,与pMD18-T载体连接进行TA克隆,得到猪甘露聚糖结合凝集素A（porcine mannan-binding lectin A,pMBL-A）基因。再亚克隆到pPROEXHTb表达载体上,构建重组表达质粒。将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌中诱导表达重组pMBL-A蛋白,通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。结果成功扩增得到包括完整开放读码框长为875bp的全长cDNA片段,并原核表达了重组蛋白,为进一步研究该蛋白的遗传特征以及为猪遗传育种方面的研究提供依据。     

海马齿Spmet基因表达产物的亚细胞定位

为研究从海马齿(Sesuvium portulacastrumand L.)中克隆的Spmet基因在植株体内亚细胞水平上的分布情况及组织表达的特异性,将Spmet基因的编码区定向克隆至植物表达载体pCAMBIA-1304上,使其与mgfp（绿色荧光蛋白）基因融合,构建Spmet基因植物瞬时表达载体,使用基因枪法将该表达载体导入洋葱表皮细胞,通过荧光激发,在荧光显微镜下观察洋葱表皮细胞中的绿色荧光部位,确定其在细胞中的表达部位。同时利用半定量PCR的方法对其在根、茎、叶中的表达特性进行分析。结果表明,该基因在海马齿植物的根、茎、叶中均有表达,表达量为叶>茎>根,融合蛋白主要分布在洋葱表皮细胞的细胞核上,细胞膜上也有微量表达。说明海马齿2型金属硫蛋白基因在海马齿植物中属于组成型表达,同时是一个核表达的基因,该结果为进一步研究Spmet基因在抗重金属方面发挥的作用打下了基础。