猪圆环病毒1型天津株全基因组的克隆与序列分析

摘要：【目的】从天津地区分离和克隆出1株PCV1,并进行基因组序列分析。【方法】参照GenBank上猪圆环病毒1型（PCV1）全基因组序列设计1对引物,用PCR技术从天津一猪场的临床发病猪病变组织中扩增和克隆获得1株PCV1全基因组序列,并进行序列测定和分析。【结果】全基因组序列结果显示,该株PCV1基因组全长1759 bp,与国内外其他各株PCV1的核苷酸同源性达98.2%以上。主要开放阅读框（ORF）序列结果显示,该分离株与国内外其他PCV1毒株间的ORF1与ORF2的核苷酸同源性分别为97.5%~99.8%和92.7%~99.9%。【结论】虽然各个PCV1分离株之间的全基因组与主要ORF的核苷酸同源性均很高,但还是呈现出一定的地域相关性。     

火鸡传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆和序列比较

参考GenBank发表的传染性法氏囊病毒(IBDV)基因组序列,设计并合成了一对特异扩增IB-DVVP2基因的引物。以广西玉林发病火鸡群分离的IBDV野毒YL株为材料,以其基因组为模板利用RT-PCR技术扩增出了1.5kb的cDNA产物,将VP2基因克隆于PUC119质粒上,得到重组PUC119质粒。并对VP2基因全序列测定、分析和聚类表明,YL株与欧洲超强毒株非常相似,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

传染性支气管炎病毒S1基因的遗传多样性

为全面分析传染性支气管炎(IBV)流行株S1基因的遗传变异,结合1992-2008年间从山东乃至全国分离鉴定的IBV毒株,在进行抗原性研究的基础上,对17株IBV毒株分别进行了S1基因的克隆测序,并与GenBank中具有代表性的参考株进行同源比较,同时对其高变区HVRⅠ氨基酸基序进行分析.根据系统发育树,结合病毒发生的年代、地域和临床病理,将58株IBV国内外毒株初步分为6个基因型,其中,国内流行株主要涵盖5种基因型,大部分流行株属于基因Ⅴ型(北方株为主)和基因Ⅳ型(南方株为主),两种类型毒株相互交织,呈现复杂的流行形式.对IBV高变区HVRⅠ氨基酸基序分析表明,多数毒株存在不同程度的点突变,尚有4株分离株在33位和34位之间有氨基酸残基的插入.S1基因的遗传变异具有多样性,与常规疫苗株和国外参考株相比,无论是核苷酸还是氨基酸均发生了较大的变异.不同IBV毒株S1基因片段与其全长之间遗传变异高度相关(r=0.968),但IBV流行株与疫苗株的遗传距离愈来愈远,彰显出IBV流行株在H120的免疫压力下,已经发生了较大程度的变异.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HN-HW株的分离与鉴定

用细胞传代的方法从湖南省宁乡县发病猪所采病料中分离到一株猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株.该毒株能在Marc-145细胞上增殖并产生特征性的细胞病变,RT-PCR检测可扩增出670 bp的特异性的ORF5基因片段,经美洲型PRRSV荧光抗体染色呈阳性反应,电镜观察其超微结构显示,病毒粒子大小为50～60 nm.命名该分离毒株为HN-HW株.     

牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因克隆及序列分析

【目的】对牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株NS2-3区基因进行克隆及序列分析，为阐明本病致病机理，更好的控制BVDV感染、流行提供理论依据。【方法】以牛病毒性腹泻病毒河北分离株（HB-DCZ）基因组RNA为模板，扩增BVDV HB-DCZ株基因组NS2-3片段cDNA。将PCR产物克隆后进行PCR及双酶切鉴定。克隆产物进行序列测定及分析。【结果】HB-DCZ cDNA体外扩增获得特异性条带，大小约为665bp，表明该分离毒株基因组中无插入序列。PCR产物克隆，提取重组质粒，扩增获得特异性的DNA条带，长度约为665bp，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，获得两条DNA片段，长度分别为2600bp和702bp左右，与理论值相符。序列测定结果表明，克隆得到的NS2-3重要区扩增片段共665核苷酸，NS2-3重要区的蛋白质由208个氨基酸残基组成。HB-DCZ毒株NS2-3重要区核苷酸序列与已公开发表的BVDV其他毒株相比的同源性依次为184株99.1%，ZM195株97.4%，Osloss株92.3%，C24V株77%，NADL株76.4%。HB-DCZ在NS2-3扩增区域中既没有外源序列的插入，也没有基因重组、重排或缺失，但存在某些核苷酸的替换。【结论】HB-DCZ与Osloss株、国内的184株、ZM195株遗传距离较近，与C24V株、NADL株遗传距离较远。HB-DCZ株应为BVDV Ib基因亚型。     

鸡贫血病毒VP1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据鸡贫血病毒Cux_1株基因组序列设计了一对引物,通过PCR扩增出VP1基因。将扩增出的片段克隆到pGM_T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux_1株的VP1基因序列一致。然后将克隆化VP1基因亚克隆到PET_32a( )载体上并进行原核表达。SDS_PAGE和Western Blot分析表明,一个分子质量为70.4 kDa的重组蛋白获得了成功表达,并且鸡贫血病毒阳性血清能和重组蛋白发生反应。     

猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型（PCV1）ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）的仔猪组织病料中分别扩增出PCV1 ORF2全基因（702bp）。将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-PCV1-ORF2并对其测序,结果表明：所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与Genbank上发表的PCV1 ORF2基因的同源性介于97.3% ~ 99.9%,与PCV2-ORF2基因同源性介于67.9% ~ 68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区域比较保守;抗原表位预测表明PCV1 ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性     

猪圆环病毒Ⅱ型ZZ株ORF1基因的扩增测序与序列分析

合成一对猪Ⅱ型圆环病毒（PCV-2）ORF1基因特异性引物,对分离到的郑州分离株（ZZ株）猪圆环病毒PCV-2型的ORF1 基因进行了扩增,经测序后,将所测序列与已公布的35株PCV-2 ORF1序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。结果显示,所测毒株间的ORF1基因核苷酸同源性为97.3～100％;进化树分析表明各分离毒株ORF1基因在进化上比较保守。同时对PCV-2 OFR1部分功能进行分析,发现该基因蛋白具有良好的抗原性     

犬瘟热病毒疫苗免疫逃逸株的血凝素基因变异研究

为了弄清是否有新基因型犬瘟热病毒出现,对山东省不同地区的免疫水貂、狐狸和犬进行了犬瘟热病毒检测,扩增了病毒核衣壳基因和血凝素基因(H),并对13个犬瘟热病毒山东株(8株貂源,2株狐狸源,3株犬源)血凝素基因进行了测序。结果表明,13个犬瘟热病毒山东株之间H基因核苷酸同源性为99.1%~100.0%,均为Asia-1型,这也是我国目前水貂犬瘟热病毒唯一的基因型。与2012年之前的犬瘟热病毒中国分离株及疫苗株相比,13个毒株H基因有4个氨基酸的一致性变异,即P200S、M263I、I542N和Y549H,N-糖基化位点比Onderstepoort株多6或7个,比CDV3株多3或4个。抗原性分析表明,与疫苗株相比,13株山东株在540-549位氨基酸出现一个新的抗原区域,210-230,327-347位的抗原区域也与疫苗株不同,这些变异可能是我国貂狐犬瘟热免疫失败的原因。     

猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出PCV1ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-PCV1-ORF2并对其测序,结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与Genbank上发表的PCV1ORF2基因的同源性介于97.3%～99.9%,与PCV2-ORF2基因同源性介于67.9%～68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区域比较保守;抗原表位预测表明PCV1ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。     

鸡传染性法氏囊病病毒J1C7株全基因组的克隆与分子系统进化树分析

为了获得鸡传染性法氏囊病病毒J1C7株的全基因组cDNA,确定其分子进化关系。以IBDV J1C7株细胞培养液为材料,用蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提法提取IBDV基因组dsRNA,利用特异性引物将基因组A、B节段分两段进行RT-PCR并通过融合PCR方法将具有部分重叠序列的A、B节段的上、下游基因组进行拼接,从而构建出完整的A、B节段基因组,利用pMD-18T载体快速克隆PCR产物。结果表明：获得了3260 bp的A节段全长（Genbank登录号EF646854）和2827 bp的B节段全长（Genbank登录号EF646853）。氨基酸同源性比对结果表明：J1C7株与弱毒疫苗株CEF94（芬兰）、P2（德国）、JD1（中国）、HZ2（中国）的亲缘关系最近（蛋白同源性为VP5：99.3%;VP2：99.3%~100%;VP4：97.9%~99.2%;VP3：96.4%~98.1%;VP1：99.2%~99.9%）。BDV J1C7株属于弱毒疫苗株,且与欧洲和中国的弱毒疫苗株有密切的亲缘关系,在进化树上归为一簇。本研究为构建IBDV的感染性cDNA,了解IBDV基因组的结构与功能打下了基础。     

鸡新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

研究旨在从分子生物学角度研究新城疫病原F基因,探究NDV F基因的遗传变异情况及其蛋白结构。提取新城疫病毒基因组RNA,根据GenBank中已知的NDV La Sota株序列设计引物扩增F基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒pMD-NDV-F进行测序分析。应用生物信息学软件对新城疫病毒F基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、蛋白结构跨膜区分析及F蛋白三级结构的预测。核苷酸序列测定结果表明：F基因为1792 bp,共编码553个氨基酸;生物信息学分析结果表明：F基因在种属间具有较高的保守性,试验获得的F基因与NDV La Sota、Clone30、V4、B1等弱毒株的一致性较高,具有典型的弱毒株特性,F基因的氨基酸序列与新城疫病毒La Sota株F基因的序列同源性最高可达100%;F蛋白的三级结构预测结果显示：F蛋白部分片段与新城疫病毒F蛋白融合片段的相似性为96%。研究为新城疫病毒的分子病毒学研究奠定了基础。     

The potential for breeding an improved lucerne-rhizobium symbiosis. 1. Assessment of genetic variation

Summary Six cultivars of lucerne (Medicago sativa L.) were grown in all possible combinations with eight strains of Rhizobium meliloti in order to assess genetic variation in symbiotic nitrogen fixation. Host genotype and Rhizobium genotype effects on nitrogen fixation were respectively 4.8% and 21.0% of total phenotypic variance. Genetic variation due to host cultivar × Rhizobium strain interactions accounted for a further 6.0% of phenotypic variance. The results indicated low heritability of general symbiotic effectiveness in the host with interaction effects being large enough to suggest that plant performance may be unpredictable with populations of R. meliloti in field soils. Joint regression analysis showed that about 50% of the interactive variation could be explained by generalized differences in the sensitivity of cultivars to alterations in the genotype of Rhizobium strains. One cultivar, Siriver, was relatively insentitive to changes in the Rhizobium genotype whilst still maintaining high average yield. The implications of the results for lucerne breeding are discussed.     

玉米核DNA导入小麦获得矮秆优质和早熟二个新品系

用浸胚法将玉米核DNA导入小麦,从转化后的D2代和D3代10多种变异中筛选出矮秆(株高55cm)优质(籽粒蛋白质含量比对照提高2%、赖氨酸含量提高0.05%)和早熟〔比对照早熟5-8天)两个新品系,并能稳定遗传。经对供体、受体和转化后代进行RAPD和POD同工酶分析,证明供体DNA片段已进人受体并导致DNA重组,使后代基因组发生了变异。     

马铃薯卷叶病毒(PLRV)内蒙古分离物基因间隔区(IS)的克隆与序列分析

根据Genbank已报道马铃薯卷叶病毒(PLRV)基因组序列,分析其基因间隔区(IS)两端的保守区,自行设计、合成一对特异性引物,以PLRV内蒙古分离物总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到含PLRVIS的一段369 bp的cDNA,克隆于载体pBS-T中。重组质粒经PCR鉴定、酶切分析和核苷酸序列测定,并进一步与PLRV其他分离物的同源序列作比对。结果表明:克隆的PLRV内蒙古分离物的IS序列与其他全部已发表的13个全基因组中的IS核苷酸序列有很高的同源性,最高达到100%,平均为97.90%,高于这13个PLRV全基因组序列96.81%的同源性,说明IS序列不仅在PLRV的不同株系间比较保守,而且在PLRV的全基因组序列中也是相对保守的。研究结果预示,将IS构建成RNA干扰型结构导入马铃薯,将有可能获得抗PLRV多种株系且抗性更高的转基因植株。     

猪细环病毒k2型福建株ORF2基因克隆

为丰富福建省猪细环病毒的分子流行病学数据,本研究根据猪细环病毒1a型、1b型和k2型特异性检测引物对临床顽固性腹泻仔猪病料组织进行PCR检测,结果从1例病料中检测到猪细环病毒k2型阳性。并通过设计猪细环病毒k2型ORF2基因特异性引物对阳性病料扩增后进行克隆测序,获得猪细环病毒k2型ORF2基因完整编码区序列。分析发现所克隆的猪细环病毒k2型福建株ORF2基因全长为203 bp,编码有67个氨基酸。本实验株ORF2基因和猪细环病毒k2型代表株德国家猪分离株2p株(Gen Bank登录号AY823991)核苷酸同源性高达97.5%;和猪细环病毒1a型(Sd_TTV31株)和1b型(1p株)代表株核苷酸同源性均低于50.0%,分别为43.9%和47.3%。从遗传进化关系上看,本实验株ORF2基因和Gen Bank中猪细环病毒k2型处于同一遗传进化分支,而猪细环病毒1a型和猪细环病毒1b型均处于其他遗传分支。本研究首次在福建猪群中检测到猪细环病毒k2型感染。     

TMGMV完整基因组的统计特征

提取TMGMV完整基因组的统计特征,并且对它进行聚类分析.在TMGMV完整基因组的碱基序列上,用每个碱基及其随后二个碱基所构成的三碱基组,排列成一个新的序列S;计算所有64种不同三碱基组在S上出现的概率,得到一个64维向量L;比较各个基因组的L向量,我们得到6个三碱基组,它们的概率有明显地差异。结论:6个三碱基组（AAG;AGA;TGA;GAC;GAG;GTT）的出现概率与TMGMV基因组的遗传变异有着重要关联;4个不同来源的TMGMV完整基因组,按其遗传变异结果,形成2个大类。