禽流感病毒和新城疫病毒二联RT-PCR检测方法的建立

参照国内外已发表的禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)的基因序列及其相关的RT-PCR检测方法,根据禽流感病毒M蛋白基因和新城疫病毒NP基因各设计一套特异性通用引物,扩增目的带分别为600bp和340 bp。通过对相关病毒检测,建立了AIV和NDV通用型二联RT-PCR检测方法。该方法具有快速、敏感、特异等优点,可为AIV和NDV的检测、流行病学调查及疫苗使用等奠定基础。     

新城疫病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种新城疫病毒(NDV)的简便、快速、高灵敏度的检测方法,本研究根据NDV融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,在恒温水浴中进行核酸扩增反应,对反应温度、反应时间以及反应液中Mg2+浓度进行优化,获得最佳反应条件,结果经凝胶电泳分析并在可见光下直接观察.整个RT-LAMP检测用时0.5 h,检测敏感度比RT-PCR高100倍,对禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒无交叉反应.本研究建立的NDV RT-LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强,操作简单等特点,有望在核酸扩增检测方法中取代RT-PCR技术.     

禽副黏病毒4型荧光RT-PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank发表的禽副黏病毒4型（APMV-4）基因组序列,在保守区域分别设计了特异性RT-PCR引物和荧光探针,初步建立了可用于检测APMV-4的荧光RT-PCR方法。特异性试验表明本方法特异性强,与新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、减蛋综合征病毒（EDSV）等没有交叉反应。灵敏度试验表明本方法的检测下限为1EID50,比常规RT-PCR的敏感度高100倍左右。本研究所建立的荧光RT-PCR方法具有快速、准确、灵敏等优点,可用于APMV-4样品的检测。     

Differential detection of Newcastle disease virus strains by degenerate primers based RT-PCR

Degenerate primers based RT-PCR (previously described by [Avian Dis 26 (1997) 837]) has been used for the detection and differentiation of Newcastle disease (ND) viruses. Two sets of primers (A+B and A+C), with common forward primer and distinct reverse degenerate primers, designed from fusion protein gene encoding for cleavage site, could differentiate virulent and avirulent Newcastle disease viruses (NDV). Both sets of primers amplified "F" gene sequence of virulent (velogenic and mesogenic) viruses, whereas in avirulent strains, amplification was only with primer set A+C. Total 10 NDV isolates and two clinical samples including both known and unknown pathotypes, were checked. Based on amplification results 5 viruses were found to be virulent type and 6 as avirulent with one of the two clinical samples, earlier positive by RT-PCR using non-degenerate "F" gene specific primers was found negative in this study. The technique has been found to be a simple and quick for the detection and differentiation of virulent and avirulent NDV, which is important for control of the disease in the events of the outbreaks.     

一步法多重RT-PCR检测新城疫、禽流感、传染性支气管炎病毒试验的研究

为了提高检测鸡肉中新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV)，禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)，传染性支气管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus,IBV)的效率和敏感性，利用引物设计软件Primer Primer5.0设计了NDV的F基因片段，AIV的M基因片段，IBV的M基因片段的引物，在以前一步法RT-PCR扩增各种病毒RNA的基础上，进行了两种病毒和三种病毒的一步法多重RT-PCR的试验。结果确定了两种病毒的一步法多种RT-PCR的试验条件。三种病毒的一步法多重RT-PCR的试验条件基本确立，本试验初步建立了检测NDV，AIV，IBV一步法多重RT-PCR技术。     

禽肉产品中禽流感与新城疫多重PCR-DHPLC检测方法的建立

应用多重RT-PCR反应(mRT-PCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立禽产品中禽流感病毒和新城疫病毒的快速检测方法。以禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单相RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感和新城疫,其PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测分析后,检测极限分别达10-0.5ELD50/0.1mL和10-1.5ELD50/0.1mL。与普通凝胶电泳比较,敏感性高2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR-DHPLC仅检测到禽流感病毒与新城疫病毒,而对其他5种禽类病原体和SPF鸡胚尿囊液均未检测到阳性吸收峰。所建立的方法检测不同亚型禽流感病毒29株、不同来源及不同毒力的新城疫病毒16株,结果与实时荧光定量PCR检测结果完全一致;与病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,两种方法检测禽流感的符合率为94.4%(34/36),检测新城疫的符合率为95.4%(21/22)。病原分离法的检出率虽高于DHPLC方法,但经统计学分析两者差异不显著,两种方法同时对27份进口鸡胗样品与90份棉拭子样品进行检测,阴性符合率为100%,可适用于进出口禽肉产品的检测。     

鸭新城疫病毒与番鸭细小病毒二重PCR方法的建立

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)L基因和番鸭细小病毒(MDPV)Vp3基因的保守序列,采用Primer Premier 5.0软件设计并合成了2对引物。通过优化反应条件及特异性、敏感性评价,建立了能同时检测鸭源NDV和MDPV的二重PCR方法。该方法对鸭源NDV和MDPV的检测敏感性分别为30和16 fg。同时使用该方法对鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭圆环病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭黄病毒、沙门氏菌、大肠杆菌和禽多杀性巴氏杆菌进行检测,结果显示全为阴性。本研究建立的鸭源NDV和MDPV的二重PCR检测方法,具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于鸭源NDV和MDPV感染的快速鉴别检测。     

新城疫病毒通用型实时RT-PCR检测方法的建立与应用

采用TaqMan方法,经引物和探针的设计、筛选及反应条件优化,研究了检测活禽和禽产品中新城疫病毒的通用型实时RT-PCR(RRT-PCR)方法。结果显示,对12株分别为速发型、中发型、缓发型和疫苗株新城疫病毒的尿囊液倍比稀释液的检测极限在10-5~10-7之间;建立的方法与常见禽类病毒无交叉反应,特异性良好;在检测人工感染肉鸡的脏器组织、咽喉、泄殖腔拭子中病毒的灵敏度同鸡胚分离试验基本一致;弱毒疫苗免疫鸡群在免疫后14 d,应用本方法不能从咽喉、泄殖腔拭子中检测到病毒;临床样品检测表明,该方法不仅可以检出中强毒力新城疫毒株,也可检出缓发型野毒株和疫苗毒株。     

鸭坦布苏病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立

The study was conducted to establish the duplex Real-time PCR assay for detecting both duck tembusu virus (DTMUV) and duck plague virus (DPV). According to the sequences of DTMUV E gene and DPV UL6 gene in GenBank, two sets of specific oligonucleotide primers for DTMUV and DPV along with two TaqMan probes were designed. The duplex Real-time PCR assay was developed through optimization of reaction conditions and validation of specificity, sensitivity and repetitiveness of the method. The sensitivity of the assay were both 100 template copies for DTMUV and DPV. There was no specific bands of the same sizes were amplified from other duck pathogens, such as duck Newcastle disease virus, duck hepatitis virus, muscovy duck parvovirus, duck circovirus, H9 subtype avian influenza virus, egg drop syndrome virus. This duplex Real-time RT-PCR assay is a sensitive, quick, specific and quantitative test for detection of DTMUV and DPV, and will be useful for the control of these viruses in ducks.     

新城疫病毒广西分离株M基因的克隆与序列分析

根据基因库中新城疫病毒M基因核苷酸序列,设计一对特异性引物,对2000年-2003年期间广西分离的11个NDV毒株的M基因进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定.结果表明,11个NDV广西分离株的M基因都为1 223个核苷酸,含有1个1 095 bp核苷酸阅读框(ORF),编码364个氨基酸.序列分析结果表明,这11个NDV分离株核苷酸的同源性在86%～99.9%之间,推导氨基酸的同源性在89.3%～99.7%之间;11个毒株与国内外其他7个NDV毒株比较核苷酸的同源性在83.3%～98.5%之间,推导氨基酸的同源性在87.4%～98.6%之间.     

鸭坦布苏病毒RT-PCR诊断方法的建立与应用

为建立一种快速的鸭坦布苏病毒病原检测方法,本研究根据GenBank上登录的鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)基因组序列,设计1对引物,建立了检测DTMUV的RT-PCR诊断方法。该方法对Ⅰ型鸭肝炎病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、鸭肠炎病毒等常见鸭病的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1 ng RNA。该RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确快速检测出极低含量的DTMUV,将为DTMUV的病原检测及分子流行病学调查等提供一种快速、灵敏、特异、准确的分子生物学检测方法。     

3种新城疫病毒核酸扩增检测方法的比较研究

本研究利用3种方法对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)进行检测,并对这3种检测方法的灵敏度和特异性作出比较。根据新城疫病毒的融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,利用水浴LAMP法、PCR及LAMP实时浊度仪进行检测。通过对恒温水浴中的反应温度、反应时间及反应液中Mg^2＋浓度进行优化获得最佳反应条件,结果用凝胶电泳分析;用优化的温度进行LAMP实时浊度仪检测,同时都与PCR方法进行比较。结果显示,获得了最佳反应条件,水浴LAMP方法最低检测限是1.58 pg,比PCR高100倍,而LAMP实时浊度仪检测灵敏度比水浴LAMP方法高10倍,最低检测限是0.158 pg。3种方法对其他非新城疫病毒均无检出。结果表明,新城疫病毒水浴LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强、操作简单等特点,有望在核酸扩增领域取代PCR技术,LAMP浊度仪法检测灵敏度更高,但是所需仪器和试剂比较昂贵。