鸽I型副粘病毒的RT-PCR套式PCR检测方法的建立

对 3个中国广东的鸽I型副粘病毒分离株 (P4、P5和P7)基因组RNA以反转录 聚合酶链反应法 (RT_PCR)扩增了F基因 75 %的基因区域 ( 3 4 3～ 1673nt)。其中毒株P4和P7准确扩增出预期大小明亮的DNA片段 ,而P5扩增出片段很淡 ,用该RT_PCR产物作模板以相同引物再作PCR ,结果可以扩增出大小与预期一致的明亮条带。此方法可快速检测鸽I型副粘病毒(PPMV_1)。     

应用反转录—聚合酶链反应检测鸽Ⅰ型副粘病毒的研究

根据鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）和鸽副粘病毒Ｆ基因的保守序列，设计合成１对引物ＸＺ９、ＸＺ１０，用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）对３种株鸽Ⅰ型副粘病毒均扩增出与预期大小相符的ＲＴ－ＰＣＲ产物，而对鸡传染性支气管炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒、大肠埃希氏菌、禽腺病毒、禽巴氏杆菌扩增结果均为阴性；ＲＴ－ＰＣＲ最低能检出１ｐｇ的鸽Ⅰ型副粘病毒的核酸模板。     

RT-PCR检测和区分猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒的研究

根据猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪呼吸道冠状病毒（PRCV）的基因组核苷酸序列，在S基因（纤突蛋白基因）5′端保守区设计了一对引物P3／P4，该对引物在TGEV扩增跨幅约为2.4kb；而PRCV由于在此区域存在一约0.6kb碱基缺失，扩增跨幅约为1.8kb。用引物P3／P4对TGEV Miller株、Purdue株和PRCV AR310株分别进行RT－PCR，根据RT－PCR扩增片段大小可以直接区分TGEV和PRCV。用引物P3／P4与引物P1／P2作Nested-PCR,提高了该RT－PCR的特异性和敏感性，建立的RT－PCR可为临床上诊断TGEV及调查我国是否存在PRCV感染提供可靠的鉴别手段。     

重叠延伸PCR法体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ

本研究旨在体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ类分子（MHCⅠ）重链（α链）胞外区与轻链（β2m）成熟肽的重组嵌合分子。采用RT—PCR法分别扩增鸡MHCⅠ的重链胞外区和轻链的成熟肽序列；采用重叠延伸PCR（Splicing overlap extension PCR method，SOE-PCR）把通过45个碱基的链连接的鸡MHCⅠ重链胞外区基因和轻链成熟肽基因重组到可溶性表达质粒pMAL-p2X进行可溶性表达。经琼脂糖凝胶电泳证明RT—PCR可分别扩增出鸡MHCⅠα链胞外区基因和β2m成熟肽基因，大小符合预期。采用MHCⅠα链胞外区序列的反义引物与β2m成熟肽基因正义引物有15个碱基重叠的两对引物，以MHCⅠα链胞外区序列与β2m成熟肽序列PCR产物的混合物作为模板，进行重叠延伸获得了预期大小的连接片段；测序显示重组质粒上MHCⅠα链胞外区序列与轻链β2m成熟肽基因的靶序列由一柔性的linker相连，阅读框正确且无移码。本研究表明SOE-PCR是体外重构鸡MHCⅠ的一种简捷可行方法。     

快速诊断鸽瘟方法的研究

从疑似鸽瘟的6例临床病例中分离到5株鸽Ⅰ型副黏病毒（SCP1-SCP5），经本实验室建立的检测中、强毒力新城疫（NDV）病毒的SYBR GREENⅠRT—PCR（RRT—PCR）方法诊断，确诊为中、强毒力新城疫毒感染，用常规RT—PCR扩增SCP1包括F蛋白裂解位点的基因片段，并进行克隆、序列测定。分析表明，SCP1编码F蛋白的基因片段裂解位点处的序列为^112K-R-^114Q—K—R-^117F，与新城疫强毒在这一区域的序列相符；与21株已报道的NDV进行核苷酸同源性比较，并建立进化树，聚类为基因Ⅵ型。     

RT-PCR方法快速诊断猪传染性胃肠炎

根据猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）标准毒株（Purdue-115）的ORF6（N基因）的基因序列，设计俣成了一对引物Li01/Li02用反转录聚俣酶链反应（RT－PCR）技术对发病猪的粪便进行检测。结果得到与预期大小相一致的约1174bp(N基因）的PCR产物，与从参照毒株TGEV TH－98扩增出的片段大小相一致。进一步用限制性内切酶进行分析，发现从发病猪火花名扩增出的N基因与参照毒株TH－98株具有相同的限制性内切酶图谱，从而证实本病例致病病毒为TGEV。     

RT—PCR检测猪传染性胃肠炎病毒

根据猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）纤突蛋白S基因的5′端核酸序列设计了1对引物。该对引物扩增的目的片段长度为886bp。在优化RT－PCR反应条件的基础上，建立了检测TGEV的RT－PCR方法。用此RT－PCR方法检测56份猪腹泻粪样，同时用夹心ELISA法作对照。结果显示，RT－PCR法检测的20份阳类粪样，用夹心ELISA法检测有14份呈阳性，两者的符合率为89％。RT－PCR法比夹心ELISA法敏感性更高，可用于TGEV的诊断和流行病学调查。     

广西猪源I型副粘病毒F基因测序分析

对广西猪源I型副粘病毒F基因测序分析,为今后开展猪源副粘病毒的相关研究提供参考,也为有效防控副粘病毒感染奠定基础。参考GenBank发表的相关禽副粘病毒I型（Avian paramyxovirus serotypeI,APMVx）基因组序列,设计了1对特异性引物,用RT—PCR法分别扩增出病毒各F基因片段,并将目的基因片段回收纯化。测定得F基因的序列结果表明,从猪组织中分离获得1株猪源禽I型副粘病毒,分离株F基因112～117住裂解住点的氨基酸组成为R—R—Q－R—R-F,与强毒株DQ417113、AF458012的裂解位点一致。同源性分析结果表明,分离株与标准强毒株的核苷酸同源性分别为87．5％和87．4％。猪源禽I型副粘病毒分离株为强毒株,属于基因I型是传统型毒株,广西地区禽I型副粘病毒宿主范围呈不断扩大趋势。     

一株新的鸽源基因Ⅵ型新城疫病毒的分离鉴定

从进口鸽中分离到1株鸽Ⅰ型副黏病毒，经测定，其鸡胚平均死亡时间（MDT）为59．2h，鸡脑内接种致病指数（ICPI）为1．92，属于速发型新城疫病毒。通过RT—PCR，扩增出了该分离毒株F基因的重要功能区片段，经测序分析，其裂解位点的氨基酸序列为112RRQKR^117，符合新城疫强毒裂解位点特征。用blastn和blastx分别搜索GenBank的核酸和蛋白数据库，发现它与2株鸽Ⅰ型副黏病毒具有99％的同源性，系统发育进化树分析为基因Ⅵ型。表明，该病毒为1株新的强毒力鸽源基因Ⅵ型新城疫病毒。     

D型产气荚膜梭菌主要毒素基因的PCR检测

为了研究产气荚膜梭菌主要毒素基因,试验采用生物软件以NCBI上登录的产气荚膜梭菌α毒素、ε毒素作为参考,设计扩增D型产气荚膜梭菌α毒素与ε毒素的特异性引物,预期基因片段大小分别为1 110 bp、888 bp,进行PCR扩增。结果表明:设计的引物可以良好地扩增α毒素基因与ε毒素基因,基因片段大小与预期一致。