多重PCR快速检测奶牛乳房炎3种主要病原体

奶牛乳房炎是引起奶牛业经济损失的一种重要疫病,目前还没有快速、特异检测奶牛乳房炎主要致病原的方法。本试验根据金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌各自保守的16S或23S rRNA基因序列,合成了3对特异性引物,建立了三重PCR检测方法。特异性试验表明,该方法对所有参与测试的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌都能扩增出各自的阳性条带,而对所有参与测试的对照菌株则不能扩增出任何条带。敏感性试验表明该方法能检测到4个菌的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和2个菌的大肠杆菌。对送检的乳房炎奶样36份直接进行PCR检测,金黄色葡萄球菌阳性7份,无乳链球菌阳性2份,大肠杆菌阳性6份。     

奶牛乳房炎3种主要病原多重PCR检测方法的建立

根据GenBank收录的序列,针对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌在16S rRNA与23S rRNA之间的序列设计2对引物,扩增的片段长度分别为420 bp和270 bp;酵母样真菌参照念珠菌和隐球菌的18S rRNA发表的序列设计引物,扩增的片段长度为730 bp左右。建立了用于检测奶牛乳房炎的多重PCR检测方法,并对PCR扩增的特异性和敏感性进行了优化。运用建立的多重PCR方法对从无锡市采集的34份样品进行病原菌检测,结果表明,本试验建立的多重PCR检测方法具有高效、快速和灵敏的特点,为进一步防控乳房炎奠定了基础。     

河北省奶牛乳房炎主要致病菌多重PCR检测方法的建立

为同时检测奶牛源金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和绿脓杆菌,本试验根据GenBank中3种病原菌的nuc、ef-tu和eta基因保守序列分别合成了3对特异性引物,通过对反应条件、反应体系优化,建立了多重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法与大肠杆菌、克雷伯杆菌、表皮葡萄球菌、巴氏杆菌无交叉反应,敏感性试验结果表明,多重PCR检测方法对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和绿脓杆菌的检出限为10~(-3) mg/L。应用该方法对150份临床样品进行检测,结果金黄色葡萄球菌与无乳链球菌混合感染检出率为28.7%(43/150),金黄色葡萄球菌与绿脓杆菌混合感染检出率为14%(21/150),无乳链球菌与绿脓杆菌混合感染检出率为11.3%(17/150),3种菌混合感染检出率为6%(9/150)。应用多重PCR检测结果与分离培养诊断方法结果进行比较,均能检测出样品中的病原菌,2种检测方法的总符合率分别为金黄色葡萄球菌92.6%,无乳链球菌91.3%,绿脓杆菌94.6%。该检测方法对奶牛乳房炎的防控、临床监测及疾病诊治具有重要意义。     

奶牛乳房炎常见致病菌多重PCR检测方法的建立

为建立同时快速检测奶牛奶样中无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌的方法,根据无乳链球菌sip基因、停乳链球菌isp基因、乳房链球菌pauA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因各设计1对特异性引物,建立多重PCR检测体系。结果显示,该检测方法具有高特异性,无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌敏感性分别为105、104、105、105 CFU/mL。对临床采集的460份奶样检测结果表明,建立的多重PCR体系可以用于临床上无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎的检测。     

奶牛乳房炎中大肠杆菌PCR检测方法的初步建立

大肠杆菌是引起奶牛乳房炎的一种主要细菌.为了建立PCR直接检测奶牛乳房炎致病菌的方法,本试验以大肠杆菌为主要研究对象,根据已发表的致病性大肠杆菌16-23S rRNA特异性序列设计并合成一对引物,对昆明市的某发生奶牛乳房炎的病牛的牛奶进行大肠杆菌PCR检测,并对扩增片段进行序列分析,建立一种直接从牛奶中检测大肠杆菌的PCR快速诊断方法.结果表明,该方法能够检测到乳样中的大肠杆菌,而且具有快速、准确和特异的优点.     

应用PCR方法检测奶牛乳房炎主要病原菌

为建立一种在分子水平快速检测乳房炎主要病原菌的方法,根据GenBank已发表的序列设计了3对特异性引物,结果可同时检测奶牛乳房炎的3种主要病原菌:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌。其特异性为100%,敏感性检测的最低浓度为:1.25×103cfu/mL。     

应用PCR方法检测奶牛乳房炎主要病原菌

为建立一种在分子水平快速检测乳房炎主要病原菌的方法,根据GenBank已发表的序列设计了3对特异性引物,结果可同时检测奶牛乳房炎的3种主要病原菌:金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌.其特异性为100%,敏感性检测的最低浓度为:1.25×103 cfu/mL.     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌8种毒力基因的PCR检测

为研究奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)主要毒力因子的分布情况,本试验利用PCR对70株临床型乳房炎、55株隐性乳房炎金黄色葡萄球菌的8种主要毒力基因进行检测。结果显示,nuc、ClfA、TSST-1、PVL、Hla、Hlb、FnBPA和FnBPB 8种毒力基因在临床型乳房炎SA菌株中的检出率分别为:100.0%(70株)、100.0%(70株)、0(0株)、5.7%(4株)、100.0%(70株)、11.4%(8株)、97.1%(68株)和100.0%(70株);在隐性乳房炎SA菌株中的检出率分别为:100.0%(55株)、100.0%(55株)、0(0株)、70.9%(39株)、98.2%(54株)、9.1%(5株)、100.0%(55株)和100.0%(55株)。结果表明,nuc、ClfA、Hla、Hlb和FnBPA 5种毒力基因是引起奶牛乳房炎的SA的最主要毒力基因;PVL基因可能是引起隐性乳房炎的重要致病基因。     

奶牛乳房炎相关链球菌PCR检测方法的建立

利用编码3-磷酸甘油醛脱氢酶的gapC基因具有高度特异性的特点,建立PCR方法鉴定与奶牛乳房炎相关的链球菌。根据已有gapC基因序列设计1对引物,以分离自患乳房炎奶牛乳样的10株革兰阳性球菌、10株革兰阳性杆菌、10株革兰阴性杆菌作为待检菌株,进行PCR扩增。结果表明,在10株革兰阳性球菌中,有8株球菌可以扩增出约1011bp的目的条带,而其他2株革兰阳性球菌及20株杆菌均无相应PCR产物出现。通过传统的生化鉴定与16S rDNA序列分析相结合证实,能扩出gapC基因的8株革兰阳性球菌分别为乳房链球菌(Streptococcus uberis)、牛链球菌(S.bovis)与猪链球菌(S.suis)。说明基于gapC基因的PCR方法,用于鉴定奶牛乳房炎相关链球菌具有较强的特异性。     

3种鼠源致病菌多重PCR检测方法的建立

本研究以沙门菌组氨酸转运操纵子hut基因、肺炎克雷伯菌外膜蛋白Pho E基因以及金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因作为靶基因,建立了同时检测这3种致病菌的多重PCR方法,并对混有3种致病菌的盲肠内容物分别采用传统细菌分离培养法和PCR方法进行检测,同时对混有3种致病菌的粪便样品进行PCR检测。该方法能扩增出目的片段分别为495 bp、333 bp、279 bp。在优化条件下,多重PCR同时检测沙门菌、肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌的敏感度分别为1.23 pg、1.9 pg、1.185 ng DNA。分离培养法对沙门菌、肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌的最低检出限分别为1×10~2CFU、1×10~0CFU和1×10~2CFU。混合有3种致病菌的盲肠内容物和粪便,经增菌培养后,PCR法的最低检出量均为1×10~0CFU。本研究建立的多重PCR检测方法具有特异性及灵敏度高、操作简单、周期短的优点,适用于实验小鼠多种致病菌的快速检测和监控。     

牛源胎儿弯曲菌PCR检测方法的建立

根据胎儿弯曲菌的16S rRNA基因序列设计引物,以微需氧培养的胎儿弯曲菌标准株菌体裂解物为模板,进行PCR扩增目的片段。同法检测了胎儿弯曲菌的10个参考菌株,结果均为阳性。采用异硫氰酸胍快速提取流产牛阴道分泌物中胎儿弯曲菌的DNA,然后用PCR方法检测,5份样品阳性,该试验可在24 h内完成,比病原分离法快5~7 d;而检测空肠弯曲菌、大肠杆菌、布氏杆菌、葡萄球菌、链球菌等相关病原时,均无特异性扩增产物,表明该检测方法具有快速、特异、实用性强的特点。     

多重荧光PCR检测水产品致病菌方法的建立与应用研究

根据沙门氏菌invA基因、副溶血性弧菌toxR基因和大肠杆菌O157：H7 RFBE基因的保守序列,设计引物和探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度和特异性,建立了可同时检测上述三种致病菌的多重实时荧光PCR方法。该方法对纯茵的检测灵敏度均低于1O cfu／PCR反应体系。人工染菌样品经6h增菌,检测的灵敏度可低于10c...     

牛传染性鼻气管炎病毒套式PCR检测方法的建立

利用套式PCR技术建立一种快速检测牛传染病鼻气管炎病毒(bovine infectious rhinotracheitis virus,IBRV)并能区分野毒株和gB基因缺失疫苗的方法。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒的gB和gE基因序列,应用pri mer5.0软件设计了gB/BN和gE/EN的2套套式PCR引物,分别对IBRV标准株进行PCR扩增,结果表明,这2套引物均能扩增出与设计目的片段大小一致的特异性条带;用此引物对同属的伪狂犬病毒、马立克氏病毒、鸭瘟病毒进行扩增,具有良好的特异性。引物gB/BN和gE/EN的检测灵敏度分别为0.01TCID50和0.1TCID50。     

猪呼吸和繁殖障碍类病毒性疫病多重PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中PRRSV ORF6、PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、SIV M、JEV NS1、CSFV E2等基因的部分片段,分别设计特异性引物,用实验室已保存的病毒及阳性病料,通过对7个病毒单一PCR的退火温度和敏感性进行优化和检测,再选择合适的多重PCR缓冲体系及酶,优化退火温度、模板及引物浓度,最后检测多重PCR的敏感性、特异性及重复性,建立一种能够同时且快速鉴别PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV这7种常见猪呼吸道和繁殖障碍类病毒的多重PCR检测方法,并用其对2017-2019年贵州部分地区的150份临床病料进行检测。多重PCR特异性检测结果表明:从混合病毒基因组中分别扩增出大小为224,353,424,549,684,831,1 137 bp的特异性片段,未扩增出E.coli、APP、PEDV及正常组织的DNA/RNA;敏感性试验表明,该方法对病毒的最低检测量分别为PRRSV 94 pg、PCV2 66 pg、PPV 68 pg、PRV 20 pg、SIV 35 pg、JEV 17 pg、CSFV 14 pg;重复性试验表明:相同条件下的6次重复试验均能扩增出7个病毒的目的条带;应用试验表明:150份临床病料中二重感染阳性率高达66.00%(99/150);三重感染阳性率达11.33%(17/150);四重感染阳性率达2.00%(3/150);五重感染阳性率达0.67%(1/150);六重感染阳性率为0,七重感染阳性率为0,阳性PRRSV、PCV2、PPV、JEV、SIV的多重PCR与单一PCR的符合率均为100.00%,阳性CSFV和PRV的符合率为90.00%以上,研究建立的多重PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,对猪场猪呼吸和繁殖障碍类病毒病混合感染的快速诊断具有十分重要的意义。     

鸡胚胎性病原茵多重PCR检测方法的建立

为建立同时检测禽波氏杆菌(Bordetella avium)、沙门氏茵(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)4种导致鸡胚死亡病原菌的多重PCR方法,本研究根据B.aviun的ompA基因、Salmonella的invA基因、E.coli的phoA基因和P.aeruginosa的toxR基因序列,各设计一对特异性引物进行多重PCR反应,并对反应体系和条件进行优化.结果显示,4对引物分别扩增出597bp、724bp、372bp和278bp的目的条带;并且特异性强不与其他非目的茵发生反应.经优化B.aviun、P.aeruginosa和E.coli多重PCR检测灵敏度达到104cfu/mL,而Salmonella为103cfu/mL.本研究建立的多重PCR方法为相关病原茵的快速检测提供方法.     

5种脑炎人兽共患病病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测流行性乙型脑炎病毒(JEV)、森林脑炎病毒(TBEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)5种人兽共患脑炎病病毒的多重RT-PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列设计特异引物,通过优化引物组合及PCR反应条件,建立可同时检测5种病毒的方法,扩增片段长度分别为411 bp(JEV)、945 bp(TBEV)、193 bp(EEEV)、545 bp(WEEV)和769 bp(CHIKV);该方法具有良好的特异性,对病毒核酸最低检测拷贝数分别为7.1×103、3.6×103、2.2×103、5.6×103和5.1×103.该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点,为以上5种人兽共患脑炎病病毒提供快速检测手段.     

动物产品中牛、羊源性成分多重PCR检测方法的建立

以肉骨粉、鱼粉、猪肉干和鱼肉干为研究对象,异硫氰酸胍法提取总DNA,18S rDNA片段的扩增结果表明提取到的DNA中不存在抑制PCR的物质。应用梯度PCR技术对牛、羊源性成分检测的退火温度进行了优化,在单一PCR检测技术的基础上分别进行了18S rDNA片段和牛、羊源性成分的多重PCR分析,得到了预期的结果。试验表明,本文建立的多重PCR方法具有快速、简便、准确等特点,对动物产品牛、羊源性成分检测具有重要意义。     

仔猪致泻性大肠杆菌毒力因子多重PCR检测方法的建立与应用

本研究以致泻性大肠杆菌(DEC)的4种毒力因子EAST1、LT、STa和STb为模板设计特异性引物并优化各项反应条件,以建立仔猪DEC的多重PCR检测方法.该方法具有较好的特异性,只对DEC产生特异性条带,对非DEC及其他病菌则呈阴性.利用所建立的多重PCR方法对吉林省各猪场采集的样本进行检测,结果表明,在测定的猪场中...