香石竹切花水孔蛋白基因DcPIP2的克隆及特征分析

 采用RT-PCR和RACE技术从香石竹（Dianthus caryophyllus L.）叶片中获得质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic protein,PIP）类水孔蛋白（aquaporins,AQP）基因的cDNA全长序列,命名为DcPIP2,GenBank登录号为GU989036。该cDNA全序列长983 bp,包含有858 bp的完整阅读框（ORF）,编码285个氨基酸,分子量约为30.6 kD。克隆相应的DcPIP2基因组全长序列得知,该基因长2 635 bp（GenBank登录号为JF706350?）,包含由3个外显子和2个内含子组成的编码区序列。同源性分析显示,DcPIP2氨基酸序列与陆地棉（Gossypium hirsutum）PIP2;3（ACB42440）、麻疯树（Jatropha curcas）AQP（ABM54183）和巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）PIP2（ACV66986）氨基酸的同源性分别为89%、88%和87%。利用实时荧光定量PCR技术研究表明,DcPIP2基因在香石竹切花的叶片、茎颈部、花瓣、雌蕊、雄蕊和萼片中均有表达,表达量为雌蕊 > 花瓣 > 雄蕊 > 萼片 > 茎颈部 > 叶片。     

梨矮化砧木‘中矮1号’生长素氢转运体基因PcAHS及其启动子的克隆与表达分析

以梨（Pyrus communis L.）紧凑型矮化砧木‘中矮1号’及其母本‘锦香’新梢韧皮部为试材,根据转录组测序结果设计特异性引物,克隆到1个长1 239 bp的基因序列。该序列在两个品种间不存在差异,均编码412个氨基酸,其氨基酸序列与苹果（np_001280772.1）、梅（xp_008242099.1）、毛果杨（xp_002306421.2）、草莓（xp_00428771.1）的生长素氢转运体基因（AHS）编码的氨基酸序列的相似性在67% ~ 99%之间,命名为PcAHS。qRT-PCR分析发现,‘中矮1号’新梢韧皮部中PcAHS的表达量均低于母本‘锦香’,推测其启动子序列存在差异。‘中矮1号’及其母本‘锦香’PcAHS 基因上游启动子长度分别为828 bp和888 bp,二者相似性89.1%。序列分析发现‘中矮1号’PcAHS基因启动子有一段58 bp（–496 bp ~–553 bp）的缺失;利用植物顺式作用元件数据库PLACE和PLANTCARE分析表明,‘中矮1号’启动子含有一个‘锦香’没有的BPBF转录因子结合元件P-box。推测‘中矮1号’PcAHS基因启动子特有的片段缺失和P-box转录因子结合元件可能是导致其表达量低并通过影响生长素的运输最终引起矮化的原因。     

唐菖蒲质膜水孔蛋白基因GhPIP1;1 的克隆及表达分析

 采用RT-PCR和RACE技术从唐菖蒲（Gladiolus hybridus‘Eerde’）花瓣中克隆得到1个质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins,PIPs）类的水孔蛋白基因,命名为GhPIP1;1。该基因cDNA 全长1 130 bp,包含867 bp完整开放阅读框（ORF）,编码288个氨基酸。克隆和分析相应的gDNA序列（2 098 bp）表明,其包含由4个外显子和3个内含子组成的编码区序列。氨基酸序列分析表明GhPIP1;1具有水孔蛋白家族高度保守的2个NPA（Asn-Pro-Ala）基序。同源性分析显示GhPIP1;1氨基酸序列与同科的荷兰鸢尾（Iris hollandica）PIP1氨基酸序列的同源性达94%。半定量RT-PCR分析表明,GhPIP1;1在唐菖蒲花瓣、雄蕊、雌蕊、茎、苞片和叶片等均有表达,但表达量以花瓣中最高,叶片中最低;GhPIP1;1在花蕾至花朵盛开期间的表达水平较高且变化不明显,但在花朵盛开后的萎蔫过程中表达水平明显降低。     

金针菇产植酸酶菌株的筛选及植酸酶基因区域的克隆

从金针菇（Flammulina velutipes）7个菌株中筛选出1株高产植酸酶菌株.根据GenBank中植酸酶基因的保守区设计并合成一对特异性引物,以金针菇菌丝的总DNA为模板,通过PCR扩增,获得了一条长约790bp的片段.DNA序列测定结果表明,该片段长度为788bp,采用Blast软件进行序列比对发现,该片段与平田头菇（Agrocybe pediades）的植酸酶基因phy（GenBankAccession：CAC48160）编码的氨基酸具有64%的序列同源性.该片段含有2个内含子,含有植酸酶基因的活性位点高度保守序列（Active-site sequence）-RHGXRXPT.     

茄子花青素合成中SmTTG1、SmGL3和SmTT8的表达及其蛋白质间的相互作用

采用同源克隆方法从茄子（Solanum melongena L.）中分离得到3个基因,分别命名为SmTTG1、SmGL3和SmTT8。序列分析表明,SmTTG1的cDNA全长1 220 bp,开放阅读框为1 029 bp,编码342个氨基酸,与马铃薯（S. tuberosum L.）TTG1基因序列同源性达到94%,成熟蛋白等电点为4.90,具有典型的WD结构域;SmGL3的cDNA全长2 329 bp,开放阅读框为1 887 bp,编码628个氨基酸,与马铃薯GL3基因序列相似性达到94%,蛋白等电点为5.61,有典型的HLH结构域;SmTT8的cDNA全长2 242 bp,开放阅读框为1 896 bp,编码631个氨基酸,与马铃薯TT8基因序列同源性为85%,蛋白等电点为5.18,有典型的HLH结构域。荧光定量检测结果表明,SmTTG1、SmGL3和SmTT8在茄子根、茎、叶、花、果皮和果肉中均有表达,但表达水平具有组织特异性。酵母双杂交结果表明,SmTTG1与SmTT8、SmGL3之间有相互作用,并且SmTTG1、SmGL3和SmTT8都与SmMYB之间发生作用。推测SmTTG1为WD40转录因子,SmGL3和SmTT8为bHLH转录因子,它们都参与调控茄子花青素的合成。     

南方根结线虫Mi-flp-16基因的克隆及原位杂交分析

以南方根结线虫2龄幼虫为材料,根据已知南方根结线虫flp基因的EST序列设计引物,利用末端快速扩增法（RACE）获得FLP基因Mi-flp-16的cDNA全长(GenBank登录号为EU549831)。该基因全长690 bp,包括一个528 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码一条176个氨基酸残基的多肽。序列分析表明Mi-flp-16编码3个FLP肽,即2个AQTFVRF和1个GQTFVRF。原位杂交结果显示此基因表达位置在围喉神经环。     

杧果低分子量热激蛋白基因MiHSP17.6的克隆及表达分析

采用RT-PCR与RACE相结合的方法获得了杧果低分子量热激蛋白基因的cDNA全长序列,命名为MiHSP17.6,GenBank登录号为KJ459857。序列分析显示,该基因序列全长为680 bp,其中开放阅读框为462 bp,编码154个氨基酸,5′非编码区和3′非编码区长度分别为80 bp和135 bp。杧果MiHSP17.6与其他物种的低分子量热激蛋白同源性介于74% ~ 82%。实时荧光定量分析表明,MiHSP17.6在‘四季杧’不同组织器官中均表达,在果实发育的中期表达水平持续上升。高温（44 ℃）、低温（4 ℃）、盐（NaCl）、聚乙二醇（PEG）、脱落酸（ABA）、双氧水（H2O2）和水杨酸（SA）处理均诱导该基因表达,因此推测MiHSP17.6的功能可能与杧果果实发育和抵御逆境胁迫相关。     

莲藕GBSS基因cDNA全长的克隆与序列分析

采用RT-PCR结合RACE技术,扩增得到全长为2265bp的莲藕＂美人红＂品种的GBSS基因的cDNA序列（GenBank登录号EU938541）,其中开放阅读框（ORF）长为1848bp,共编码615个氨基酸。用DNAman软件比对,莲藕GBSS基因cDNA与金鱼草（AJ006293）、马铃薯（EU403426）、大豆（EF153101）、水稻（EU735072）Wx基因cDNA序列的同源性分别达61.2%、59.6%、64.2%、50.6%。对该基因编码的氨基酸序列进行Blastp分析发现,该序列与金鱼草的序列同源性最高,达到77%,与马铃薯、甘薯的同源性达到75%,与豆科植物的同源性在70%～75%,与禾本科植物的同源性在65%～70%。     

猕猴桃病毒A和B的RT-PCR检测及分子变异初步研究

为明确猕猴桃病毒A（Actinidia virus A,AcVA）和猕猴桃病毒B（Actinidia virus B,AcVB）在中国猕猴桃（Actinidia sp.）上的侵染状况和分子特性,采用RT-PCR技术对151份猕猴桃样品的AcVA和AcVB进行检测,检出率分别为15.2%和17.9%,所收集的6种猕猴桃样品中均检测到一种或两种病毒。发现AcVA的ORF1、ORF4和ORF5扩增片段序列存在较大分子变异,不同分离物的269 bp片段（ORF1）核苷酸序列相似性为77.3% ~ 99.3%。在基于各扩增片段核苷酸序列的系统进化树中,AcVA分离物聚为2 ~ 3组。采用引物AcVB5F/5R扩增获得20个AcVB分离物的342 bp或338 bp的ORF5片段,核苷酸序列相似性为81% ~ 100%,与新西兰AcVB分离物TP7-93B相应片段的核苷酸序列相似性为83.9% ~ 99.7%,在系统进化树中聚为3组。     

茄子花青素合成相关基因SmMYB 的克隆与表达分析

 以茄子（Solanum melongena L.）‘YZ14’（紫茄）和‘YZ3’（白茄）为试验材料,采用 同源克隆与RACE（rapid amplification of cDNA ends）相结合的方法克隆了茄子MYB 基因cDNA 及gDNA 全长序列,命名为SmMYB。序列分析结果表明：该基因cDNA 全长1 035 bp,开放阅读框837 bp,编码 278 个氨基酸,与辣椒（Capsicum annuum L.）MYB 转录因子氨基酸序列相似性达71%;成熟蛋白的等电 点为8.47,具有2 个典型的DNA-binding 结构域且亚细胞定位于细胞核;gDNA 全长3 834 bp,包含3 个 外显子及2 个内含子。荧光半定量检测结果表明：SmMYB 在茄子根、茎、叶、花瓣、果皮中均有表达, 但表达水平具有组织特异性;遮光处理后紫色茄子果皮中该基因表达量变化与花青素合成量变化趋势相 似。推测SmMYB 为一个MYB 转录因子基因,正向调控茄子花青素的合成。     

早熟砂梨‘翠冠’hmgr基因家族两成员的表达与货架期黑皮病关系的研究

 以砂梨黑皮病易感品种‘翠冠’果实为材料,克隆获得了调控α-法尼烯合成的关键限速酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）基因家族中的两个成员Pphmgr1和Pphmgr2。Pphmgr1开放阅读框为1 827 bp,编码由609个氨基酸残基组成的蛋白;Pphmgr2开放阅读框为1 707 bp,编码由569个氨基酸残基组成的蛋白。序列比对结果显示：‘翠冠’PpHMGR1和PpHMGR2与苹果果实的MdHMGR1和MdHMGR2蛋白的同源性分别达到90%和98%。在采后货架期28~32 ℃条件下,乙烯受体抑制剂1-MCP 可明显抑制果实呼吸率,减缓乙烯释放,显著降低果皮中α-法尼烯及其氧化产物共轭三烯的含量,减少黑皮病发病率并减轻发病程度。半定量RT-PCR结果显示1-MCP处理后果皮中Pphmgr2的表达受到显著抑制,但是Pphmgr1的表达几乎不受影响。     

1-MCP对柿果实软化及果胶物质代谢的影响

以扁花柿为试材,研究了20℃下10μL/L的1-甲基环丙烯(1-MCP)处理对柿果实成熟软化及其果胶物质代谢的影响。结果表明:1-MCP处理不仅可推迟柿果实呼吸高峰和乙烯高峰的出现,而且还推迟了柿果实PE、PG和β-Gal酶活性的增加,从而延缓原果胶降解以及水溶性果胶含量增加,保持果肉硬度,延长贮藏期限。     

柿果实采后软化中PG酶活性及其基因DkPG1的表达

为了进一步探索多聚半乳糖醛酸酶（PG）在柿（Diospyros kaki L.）采后软化中的分子调控机制,应用实时荧光定量PCR技术和DNS比色法检测常温下丙烯和1–甲基环丙烯（1-MCP）处理‘富平尖柿’果实中PG基因DkPG1的表达量和PG酶活性的变化。结果显示,随着柿果实成熟软化,DkPG1基因转录水平呈先上升后下降的趋势,其中丙烯处理4 d出现表达高峰,比对照提前12 d且峰值极显著高于对照,而1-MCP处理的果实中的表达高峰出现在处理后28 d,比对照推迟12 d峰值极显著低于对照。丙烯处理果实PG酶活性迅速增加,活性峰与DkPG1表达高峰出现在同一天,1-MCP处理的果实PG酶活性明显降低,活性峰出现在DkPG1表达高峰前4 d。此外,对不同处理下乙烯释放量和果胶组分变化分析的结果显示DkPG1基因的表达受乙烯调控,进而影响果胶组分代谢。     

柿采后丙烯和1–甲基环丙烯处理对两个扩展蛋白基因表达的影响

为进一步了解扩展蛋白（Expansin,EXP）在柿果实采后软化过程中的作用,以丙烯和1–甲基环丙烯（1-methylcyclopropene,1-MCP）处理‘富平尖柿’采后果实,采用实时荧光定量PCR技术检测果实中EXP基因表达量的变化。结果显示,丙烯促进柿果实成熟软化,使乙烯释放高峰升高并提前到来,提高ACC合成酶（ACS）、ACC氧化酶（ACO）活性;1-MCP减缓柿果实的成熟软化,推迟并降低乙烯释放高峰,抑制ACS和ACO活性。随着贮藏时间的延长,柿果实逐渐软化,对照果实DkEXP3和DkEXP4的相对表达量均表现为先上升后下降的趋势。丙烯处理促进了DkEXP3和DkEXP4的表达,使表达高峰升高且提早到来;1-MCP处理抑制了DkEXP3和DkEXP4的表达,推迟且降低了表达高峰。对照和1-MCP处理的果实的DkEXP3和DkEXP4的相对表达量高峰均较乙烯释放高峰早。DkEXP3和DkEXP4在果皮、果肉、果心中表达水平不同。本结果说明EXP可能在采后柿果实成熟软化前期起作用,其表达有组织特异性,且受到乙烯的调控。     

1-甲基环丙烯延缓果实衰老作用机制研究综述

 综述了1-甲基环丙烯(1-MCP)延迟果实衰老的作用效果和作用机理。1-MCP是一种乙烯作用抑制剂，可以延缓采后果实衰老，提高果实的贮藏品质和货架寿命，调节果实衰老相关基因的表达和酶的活性，并对果实风味和采后病害有一定影响。     

延长黄熟香蕉货架期的研究

实验研究了热水处理、包装自发气调(MAP)、乙烯吸收剂、1-甲基环丙烯(1-MCP)、贮藏温度、多菌灵等对黄熟香蕉货架期的影响。对香蕉的有机酸和总可溶性固形物含量、色差值、包装袋内的CO2浓度进行了测定。结果显示:在(28±2)℃贮藏条件下,黄熟香蕉的货架期只有1d。1-MCP延长黄熟香蕉货架期效果最好,可以延长4d;10%CO2和2%O2的MAP气调和乙烯吸收剂可延长货架期1d;500mg/kg多菌灵48℃热处理浸泡香蕉30s,延长货架期1d。50℃以上高温预处理15min,引起黄熟香蕉热害;pH4.5酸性溶液48℃浸15min,也有明显伤害。48℃高温预处理15min,没有引起伤害。黄熟香蕉对冷害敏感。应用500mg/kg多菌灵浸果30s,晾干后放入0.04mm厚聚乙烯袋内,放入0.8%乙烯吸收剂,换气后初始CO2为10%,O2为2%,袋内注射1-MCP,使最终浓度达0.13mmol/L,可使黄熟香蕉货架期由原来的1d延长到6d。     

1-MCP处理对不同成熟度番茄果实Le-ETR4表达的影响

 以樱桃番茄(Lycopersicon esculentum ) 品种‘卡罗’果实为材料, 研究了1-MCP处理对不同成熟度果实采后20℃贮藏过程中乙烯受体Le2ETR4表达和乙烯释放水平的影响。结果表明: 1-MCP处理可以抑制跃变上升期(破色期) 番茄果实乙烯释放及Le2ETR4表达; 对跃变前期(绿熟) 和跃变高峰期(粉红期) 果实Le2ETR4表达也有抑制作用, 但对乙烯释放无明显影响; 对跃变下降期(红熟期) 果实Le2ETR4表达不仅无明显影响, 反而促进了乙烯释放。     

Influence of 1-methylcyclopropene on pectic enzyme activities,gene expression,and cell wall modification in papaya (Carica papaya cv. ‘Sunrise’) fruit

SUMMARY

‘Sunrise’ papaya fruit harvested at two stages of maturity [colour break (< 10% yellow peel colour) and 25% yellow peel colour] were treated with 100 nl l^–1 1-methylcyclopropene (1-MCP) to determine its effects on ripening, on the activities and levels of gene expression of polygalacturonase (PG), pectin methyl esterase (PME), and βgalactosidase ( βGal), and on the degradation of cell wall components. 1-MCP delayed ripening and the onset of the climacteric, although the peak in the respiration rate was almost the same as that in untreated control fruit. Colour-break fruit treated with 1-MCP exhibited a continuous increase in ethylene production, but at a lower rate than in control fruit. Consequently, 1-MCP-treated fruit ripened with a concomitant reduction in firmness, which was accompanied by an increase in PG and βGal enzyme activities and gene expression. On the other hand, fruit treated with 1-MCP at the 25% yellow stage exhibited lower levels of ethylene production and developed pulp with a rubbery texture at the ripe stage which was attributed to reduced PG, βGal, and PME enzyme activities and gene expression. This was consistent with the higher level of cell wall polysaccharides measured in 1-MCP-treated fruit. The above results indicated that ‘Sunrise’ papaya fruit can be treated with 1-MCP at the colour break stage since they have a greater capacity to recover from the effects of 1-MCP than fruit treated at the 25% yellow stage.     

常温贮藏条件下1-MCP处理对欧洲李子采后生理及品质的影响

以欧洲李子(Prunus domestica‘Hanita’and‘Elena’)为试材,研究了1-甲基环丙烯(1-methlcyclopropene)对欧洲李子果实采后生理和贮藏品质的影响。结果表明:在低温(3℃)下采用浓度为1.25μL/L的1-MCP对欧洲李子果实进行处理18h后,在常温贮藏过程中,‘Hanita’属于呼吸跃变型果实,而‘Elena’呼吸速率变化不大,属于非呼吸跃变型果实。1-MCP处理可以降低‘Hanita’果实呼吸高峰的峰值,有效地抑制乙烯释放量。但1-MCP处理对欧洲李子‘Hanita’和‘Elena’果实的可溶性固形物含量及可滴定酸含量的变化无影响。     

1-甲基环丙烯在柿果实贮藏保鲜中的应用进展

从乙烯、呼吸、软化、抗氧化性、脱涩、病害、细胞超微结构等几方面综述了1-甲基环丙烯(1-Methylcyclopropene,1-MCP)处理对柿果实采后生理生化变化的影响,同时介绍了1-MCP结合其它处理对柿果实贮藏的作用效果,以期为1-MCP在柿果实贮藏保鲜中的应用和研究提供参考。