过氧化物酶基因PagPRX19对银腺杨‘84K’耐盐性的影响

  目的  盐害作为影响植物生长发育的非生物胁迫因子,严重威胁林木生长。在受到盐胁迫时,植物内源活性氧(ROS)水平增加,造成氧化胁迫,影响植株正常生长发育。因此,可通过增强过氧化物酶PRX家族成员表达水平,改变ROS水平,以增强杨树Populus耐盐能力,揭示PRX成员参与调控杨树盐胁迫响应的机制。  方法  以银腺杨‘84K’ Populus alba × P. glandulosa ‘84K’为材料,生物信息学分析选取PRX家族成员PagPRX19进行克隆并构建过表达载体,农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导叶盘转化法获得过表达植株。以银腺杨‘84K’ PagPRX19过表达植株生长45 d的组培苗和生长2个月的土培苗为实验材料,进行盐胁迫处理,以非转基因植株为对照。观察植株表型,检测脯氨酸、丙二醛、电解质渗透率等生理指标并进行分析。  结果  ①克隆了PagPRX19基因,构建过表达载体,获得转基因阳性植株。经分子鉴定选取2个过表达株系OE#1和OE#2为实验材料做后续分析。②与对照相比,过表达植株株高下降,地径增加。③盐胁迫处理下,过表达植株相较于对照表现为叶片皱缩以及植株生长受到抑制程度低,组培苗的盐胁迫处理表现为相似结果。④转基因植株的ROS水平降低,而且在盐胁迫下过表达植株叶片和根的ROS仍保持较对照低的水平。盐胁迫下过表达植株较对照脯氨酸增加,叶片持水能力增强,丙二醛和电解质渗透率降低。从生理方面显示转基因植株具有较高的耐盐能力。  结论  过表达PagPRX19可降低盐胁迫下杨树转基因植株的ROS水平,缓解氧化胁迫,增强了植株耐盐性。图11参23     

‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3a的表达及功能分析

  目的  干旱、高盐等逆境胁迫严重影响了植物的生长发育。研究表明,组氨酸激酶在植物逆境响应中起重要作用。本研究对银腺杨‘84K’组氨酸激酶基因PaHK3a在不同组织的表达模式分析,检测了其对生长素、细胞分裂素等植物激素处理下及人工干旱、盐碱等非生物胁迫下的表达,结合干旱、盐碱条件下丙二醛（MDA）及保护酶活性等生化指标,对该基因的功能进行了初步鉴定,为杨树抗逆分子育种研究奠定基础。  方法  以‘84K’杨无菌苗为材料,通过实时定量PCR（qRT-PCR）技术分析PaHK3a基因在不同组织的表达模式。对‘84K’杨无菌苗进行浓度为10 mmol/L植物激素处理（ABA、6-BA、IBA、GA3及水杨酸（SA））及非生物胁迫处理（42 ℃高温、0 ℃低温、200 mmol/L NaCl和5% PEG6000）,采用qRT-PCR技术分析PaHK3a基因对不同植物激素及非生物胁迫的表达响应;进一步对温室‘84K’杨进行自然干旱处理（6、8、10 d）、200 mmol/L NaCl（2、4、6 d）处理,测定不同胁迫时间点叶片PaHK3a基因的表达,以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性及MDA含量,并分析PaHK3a基因表达与生理指标的相关性,初步鉴定杨树PaHK3a基因的功能。  结果  qRT-PCR结果显示,PaHK3a基因在叶片中表达量最高,根部中等,茎段最低。与正常条件下相比,在高温、低温、NaCl及PEG模拟干旱处理时,PaHK3a基因表达量与对照相比明显增高,分别为对照的2.63、1.49、1.54、1.58倍。用IBA诱导处理时,基因表达量与对照相比差异不大,而在6-BA、ABA、GA3及SA处理时,基因表达量与对照相比均呈现显著下调。在温室干旱、盐碱胁迫处理过程中,PaHK3a基因表达均显著高于对照,呈现先上升后下降的表达模式,MDA含量也呈现类似的趋势,而SOD活性则随处理时间的延长而持续升高,POD活性在干旱胁迫时先上升后下降,而高盐胁迫时呈上升趋势。生理指标与PaHK3a基因表达量相关系分析发现,在干旱和盐胁迫下,PaHK3a基因表达量与叶片MDA含量、SOD活性和POD活性均呈正相关。  结论  PaHK3a基因在‘84K’杨根茎叶中均有表达,且叶中表达量最高;PaHK3a基因表达受细胞分裂素6-BA、GA3及ABA及SA等植物激素的负调控,同时,受温度胁迫、盐胁迫、水分胁迫等非生物胁迫正调控;温室人工干旱盐碱胁迫过程中,PaHK3a基因表达量升高,且与叶片MDA含量、SOD活性、POD活性均具有正相关性。研究结果初步显示,杨树PaHK3a基因参与杨树植物激素激素信号响应,并在抗逆境胁迫过程中发挥重要调控作用。      

利用CRISPR/Cas9系统编辑银腺杨84K LAZY基因

LAZY1基因隶属于IGT基因家族,与植物分枝角度调控相关。为敲除84K杨中的LAZY1基因,获得转基因株系开展功能研究,以银腺杨84K为材料,克隆84K杨LAZY1基因的3个同源基因,设计基因编辑靶点,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,运用农杆菌介导法转化84K杨并成功获得13个基因编辑株系,经测序分析发现,有3个转基因株系的靶标位点发生碱基缺失或插入,表明这3个株系基因编辑成功,编辑效率为23.07%。本研究结果丰富了IGT基因家族的功能研究,为IGT基因家族的分子育种应用和研究奠定了基础,为CRISPR/Cas9系统在银腺杨84K中的应用做出了初步探索。     

转AtDME1基因‘84K’杨的获得及目的基因诱导表达分析

目的DNA甲基化是一种重要的表观遗传标记，在植物生长发育、环境响应等过程中发挥重要作用。本研究将拟南芥去甲基化基因AtDME1导‘84K’杨基因组中，通过化学诱导表达实验，研究AtDME1基因在转基因杨树中的诱导表达特性，为建立杨树甲基化诱导变异体系，进而实现杨树品种改良等奠定良好基础。方法以白杨派优良品种84K杨无菌苗叶片为受体材料，采用农杆菌介导法将化学诱导启动子与AtDME1基因导入‘84K’杨；经过潮霉素筛选、常规PCR检测及DNA测序等方法对抗性植株进行鉴定。通过化学诱导剂17-β-雌二醇对随机挑选的1个转基因株系离体叶片进行诱导处理，处理时间为0、3、6、12、24、48、96、144 h，采用qRT-PCR检测处理叶片中外源基因AtDME1的表达量变化。结果本研究中，潮霉素分化筛选共获得了抗性芽224个，经生根筛选获得6株抗性植株，经分子检测证实这6株抗性植株均为转AtDME1基因植株，扩繁后分别标号为转基因AD-1 ~ 6。qRT-PCR检测结果显示，化学诱导剂17-β-雌二醇处理3 h时，目的基因AtDME1的表达量基本达到最大值，效果持续至12 h后逐渐减弱。结论化学诱导剂17-β-雌二醇能迅速有效地调控转基因杨树中AtDME1基因的表达，为进一步研究DME1基因在杨树基因组甲基化调控方面的作用机制奠定基础，也为杨树化学诱导表达特性的研究做好了铺垫。      

玉米DNA拓扑异构酶Ⅰ基因片段的克隆

采用同源克隆结合cDNA末端快速扩增反应策略,对玉米DNA拓扑异构酶基因Top1片段进行克隆。结果表明:所克隆基因片段编码的氨基酸序列与水稻DNA拓扑异构酶序列具有较高的相似性。Top1在玉米胚乳中表达量最高,在玉米其他组织中也有表达。对玉米自交系1145 BAC文库进行筛选,获得了Top1基因的阳性BAC克隆。     

84K杨基因转化受体系统的建立

以84K杨为研究对象,通过建立叶片再生系统及卡那霉素敏感性试验,确立了稳定高效的基因转化受体系统。结果表明,以MS培养基为基本培养基,0.5～1.0mg/L6-BA+0.01～0.1mg/LNAA组合时,叶片出芽率不到50%,每叶平均生芽数5～6个;1.0～1.5mg/L6-BA+0.02mg/L2,4-D组合时,叶片出芽率达90%～100%,每叶平均生芽数约20个。用后者附加不同质量浓度梯度卡那霉素,确定叶片外植体芽诱导卡那霉素临界筛选质量浓度为20mg/L。利用对84K杨芽生根效果较好的培养基GMS+0.01mg/LNAA+0.25mg/LIBA,附加不同质量浓度梯度卡那霉素,筛选出芽生根卡那霉素临界质量浓度亦为20mg/L。     

聚乙二醇处理对‘717’杂交杨组培苗的影响

以‘717’杂交杨(‘INRA 717-1B4’杨)组培苗为试验材料,采用0、2.5%、5.0%、10.0%聚乙二醇(PEG)6000模拟干旱胁迫,研究PEG对‘717’杂交杨膜脂过氧化和抗氧化保护系统的影响。结果表明:(1)2.5%PEG处理促进了‘717’杂交杨的生长,而10.0%PEG显著抑制其生长。(2)PEG处理显著增加‘717’杂交杨幼苗体内H2O2和丙二醛(MDA)含量,其中10.0%PEG处理最显著。(3)3个PEG浓度处理都降低了‘717’杂交杨超氧歧化酶(SOD)的活性,浓度越大下降越大;而PEG处理后过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性4种酶活性都较对照显著提高,其中POD、APX活性都随着浓度增加和时间的延长而增强,而2.5%PEG处理10 d和5.0%PEG处理20 d后CAT活性最高,5.0%~10.0%PEG处理GR活性增加明显,但10.0%PEG处理后CAT与GR活性比5.0%处理的有所降低。(4)3个浓度PEG处理均能显著促进抗坏血酸(As A)和谷胱甘肽(GSH)含量的积累,As A含量在5.0%和10.0%PEG处理10 d时上升较显著,GSH含量在2.5%PEG处理10 d时含量显著高于对照,在10.0%PEG处理时GSH含量出现下降。结果表明,低浓度(2.5%)PEG处理刺激了‘717’杂交杨的生长状态,通过提高体内抗氧化酶活性和抗氧化剂的含量以维持其生长,而高浓度(10.0%)PEG处理时,细胞的ROS清除平衡被打破,细胞受到伤害。     

不同授粉品种对‘福丽’苹果生长发育和果实品质的影响

为了筛选‘福丽’苹果适宜的授粉树,探究其果实品质性状的花粉直感效应,本试验以‘福丽’自然授粉果实为对照,研究‘福九红’‘福蕾’和‘红丹’3个不同类型品种授粉对‘福丽’果实生长发育动态、坐果率、内在外在品质、香气成分的影响。结果表明,不同授粉品种对‘福丽’苹果果实生长发育及果实品质都有一定影响,存在着明显的花粉直感现象。与自然授粉相比,人工授粉显著提高苹果坐果率和单果重,坐果率均在55%及以上,‘福九红’授粉坐果率最高,为77%,自然授粉坐果率仅为44%。在提高单果重方面,‘福九红’和‘福蕾’授粉果实尤为突出,分别提高42.16 g和26.93 g。人工授粉均降低果实的固酸比。高桩‘福九红’授粉果实的果形指数最大,为0.80,而扁圆形‘福蕾’授粉果实的果形指数最小,为0.74。高类黄酮含量红肉苹果‘红丹’授粉果实着色较好,类黄酮含量升高。‘福九红’和‘福蕾’授粉果实香气成分及其含量明显提高,尤其是乙酸己酯,相对含量分别增加26.2%和24.2%。综上所述,3个品种给‘福丽’人工授粉后均能够提高果实坐果率,改善果实品质和香气成分,以‘福九红’授粉改善效果最佳,因此‘福九红’可作为‘福丽’的...     

CO2浓度增高对盆栽牡丹品种‘凤丹白’生长及光合特性的影响

在开顶式塑料薄膜气室设施条件下,通过LI-6400便携式光合测定系统测定,研究4年生盆栽牡丹品种‘凤丹白’生长和叶片净光合速率对高CO2浓度的响应。结果表明：在各自生长环境下,处理组OTC1[（1000±100）μmol/mol CO2]和OTC2[（700±100）μmol/mol CO2]的净光合速率在整个处理期间均高于对照组CK[（400±50）μmol/mol CO2]。处理30d时日平均净光合速率,OTC1和OTC2分别比CK高125.78%、73.29%;处理60 d时,OTC1和OTC2分别比CK高135.34%、117.71%;处理90 d时,OTC1和OTC2分别比CK高261.10%、71.01%;处理120 d时,OTC1和OTC2分别比CK高239.49%、73.02%。生长量方面,处理60 d时,OTC1和OTC2的株高、单叶面积、基茎、株鲜质量、株干质量分别比CK增加8.61%、16.68%、2.56%、9.48%、9.63%和4.12%、6.35%、0.64%、5.56%、7.08%;处理120 d时,OTC1和OTC2的分别比CK增加8.41%、9.64%、2.50%、14.76%、9.20%和5.88%、12.90%、1.87%、10.52%、7.78%。CO2浓度增加,导致牡丹品种‘凤丹白’叶片气孔导度、蒸腾速率降低,水分利用率显著提高。     

1-MCP对‘绿宝石’梨采后成熟衰老期间H2O2含量及其相关酶活性的影响

为探讨1-甲基环丙烯(1-MCP)对梨果实采后成熟衰老过程中过氧化氢(H2O2)代谢的作用,试验以‘绿宝石’梨为材料,用1.0 μL/L 1-MCP密封处理24 h,空气密封为对照,研究1-MCP对‘绿宝石’梨室温(25±2)℃贮藏过程中果实硬度、可溶性同形物含量(SSC)、呼吸速率、H2O2含量、抗氧化酶活性[超氧化...     

CO2浓度增高对盆栽牡丹品种‘凤丹白’生长及光合特性的影响

在开顶式塑料薄膜气室设施条件下,通过LI-6400便携式光合测定系统测定,研究4年生盆栽牡丹品种‘凤丹白’生长和叶片净光合速率对高CO2浓度的响应。结果表明:在各自生长环境下,处理组OTC1[(1000±100)μmol/mol CO2]和OTC2[(700±100)μmol/mol CO2]的净光合速率在整个处理期间均高于对照组CK[(400±50)μmol/mol CO2]。处理30d时日平均净光合速率,OTC1和OTC2分别比CK高125.78%、73.29%;处理60 d时,OTC1和OTC2分别比CK高135.34%、117.71%;处理90 d时,OTC1和OTC2分别比CK高261.10%、71.01%;处理120 d时,OTC1和OTC2分别比CK高239.49%、73.02%。生长量方面,处理60 d时,OTC1和OTC2的株高、单叶面积、基茎、株鲜质量、株干质量分别比CK增加8.61%、16.68%、2.56%、9.48%、9.63%和4.12%、6.35%、0.64%、5.56%、7.08%;处理120 d时,OTC1和OTC2的分别比CK增加8.41%、9.64%、2.50%、14.76%、9.20%和5.88%、12.90%、1.87%、10.52%、7.78%。CO2浓度增加,导致牡丹品种‘凤丹白’叶片气孔导度、蒸腾速率降低,水分利用率显著提高。     

套袋和外源5-氨基乙酰丙酸处理对‘云红梨2号’果皮着色的影响

以‘云红梨2号’为试材,研究套袋、外源5-氨基乙酰丙酸(ALA)处理对果皮花色素苷含量、花色苷合成关键酶活性、可溶性总糖含量以及内源ALA含量变化的影响,并探讨果皮花色素苷含量与酶活性及可溶性总糖含量的关系。结果表明:在果实着色初期,套袋和外源ALA处理均有明显的促进果皮着色的效果,且两者共同处理促进作用更为显著;随着果实接近成熟,花色素苷含量有所下降。在正常光照情况下,果实摘袋后5 d左右对促进着色效果较好。相关性分析表明,套袋处理的果皮花色素苷含量与苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性显著相关;不同处理及对照果皮花色素苷含量均与类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶(UFGT)活性显著相关,但与果实可溶性总糖含量无显著相关性。     

低O2/高CO2气调结合1-MCP对‘玉露香’梨贮藏品质的影响

目的 明确低O₂/高CO₂对玉露香梨贮藏期保绿效果及品质维持的效果,为生产上延长‘玉露香’梨贮藏寿命提供理论依据与技术支撑。方法 分别将商业成熟的‘玉露香’梨进行1.0 μL·L^-1 1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene,1-MCP）处理,1% O₂、3% CO₂气调（controlled atmosphere,CA）贮藏以及1.0 μL·L^-1 1-MCP结合1% O₂、3% CO₂气调贮藏,以普通冷藏为对照,分别于贮藏210和240 d及货架7 d时,测定果皮颜色、叶绿素含量、果实硬度、可溶性固形物、可滴定酸、抗坏血酸等果实外观和内在品质指标,采用气相色谱法检测果实乙醇、乙醛含量以及乙烯释放量和呼吸强度,调查并计算果柄、果心褐变指数。结果 与普通冷藏相比,1-MCP、CA以及CA+1-MCP均可使‘玉露香’梨果实外观保持较好的绿色,有效减轻果面油腻化程度,在冷藏240 d及240+7 d货架时,CA+1-MCP对果皮绿色维持及油腻化控制效果更明显。1-MCP和CA均可抑制果实硬度、可溶性固形物和可滴定酸的下降,CA可抑制果心和果柄褐变,但CA降低了果实抗坏血酸含量,CA+1-MCP减缓了CA对果实抗坏血酸的破坏作用。CA+1-MCP对乙醇和乙醛的抑制作用在贮藏240 d时效果更明显,且20 mg·L^-1的乙醇含量在‘玉露香’梨耐受阈值以下。CA+1-MCP和1-MCP对果实乙烯释放量具有较好的抑制效果;240 d时,CA+1-MCP和CA对果实呼吸强度的抑制效果好于1-MCP。结论 ‘玉露香’梨较耐低O₂和高CO₂,CA+1-MCP对‘玉露香’梨的保鲜效果体现在210 d以后。因此,冷藏期在210 d以内,采用1.0 μL·L^-1的1-MCP处理;而冷藏期210 d以上,则需1% O₂、3% CO₂的低O₂/高CO₂的CA结合1.0 μL·L^-1的1-MCP处理,可保持果实较好的外观和内在品质。     

外施不同浓度KH2PO4营养液对4年生‘中红杨’叶色的影响

为了研究KH₂PO₄营养液对4年生‘中红杨’叶色的影响,测定了不同间隔天数、不同浓度KH₂PO₄营养液处理后叶片及对照叶片中叶绿素、类胡萝卜素、花色素苷和可溶性糖等含量。结果表明:间隔15 d叶面喷施7‰KH₂PO₄营养液能够显著提高‘中红杨’叶片中花色素苷、可溶性糖含量,而叶绿素、类胡萝卜素含量显著降低,有效提高了4年生‘中红杨’叶色的观赏价值。