陆地棉低磷胁迫应答基因GhGDPD1的克隆与表达分析

【目的】基于前期陆地棉‘新陆早19’Gossypium hirsutum‘Xinluzao 19’根部低磷胁迫基因表达谱芯片差异表达序列数据分析,挖掘相关基因,并对其克隆与表达分析。【方法】克隆陆地棉‘新陆早19’GhGDPD1基因并进行基因组DNA与cDNA测序分析,借助生物信息学方法分析GhGDPD1的基因结构和进化关系;采用半定量RT-PCR技术与实时荧光定量PCR (RT-qPCR)的方法检测该基因于根、茎、叶、花等4个组织的基因表达量的变化以及低磷胁迫下的表达模式。【结果】成功克隆GhGDPD1基因,开放阅读框序列长度为1 149 bp,共编码382个氨基酸,属于GDPD家族,其中存在一个保守结构域,名为GDPD＿GDE5＿like＿1＿plant。半定量RT-PCR和RT-qPCR试验结果均显示：GhGDPD1基因主要表达于根,中量表达于花和茎,微量表达于叶。该基因在受到低磷胁迫的刺激后,立即会对低磷胁迫做出应答,胁迫4 h相对表达量达到最高值。【结论】首次成功克隆到陆地棉‘新陆早19’GhGDPD1基因,获得了GhGDPD1基因的组织表达以及低磷胁迫下的表达模式,为深入解...     

马尾松PmMYB169基因的克隆及表达分析

MYB基因家族在植物生长发育和应答逆境胁迫中有重要作用.通过RT-PCR和RACE技术从马尾松中克隆获得了PmMYB169全长cDNA序列,分析了其在低磷胁迫下的表达特性.PmMYB169全长为1 407bp,开放阅读框为927bp,编码308个氨基酸.生物信息学分析表明,PmMYB169蛋白序列中存在MYB家族结构区域,属于R2R3类MYB转录因子;同源性分析表明,PmMYB169在MYB家族保守区域上同源性较高,它与北美云杉亲缘关系最近.荧光定量PCR对低磷胁迫下PmMYB169的表达分析结果表明,PmMYB169的表达量随低磷胁迫时间延长呈上调趋势,说明PmMYB169参与了低磷胁迫应答;对不同组织的表达分析发现,PmMYB169为组成型表达,在马尾松根茎叶中均有表达,以叶的表达量最高.     

棉花3个脂肪酸碳链延长基因的cDNA克隆和表达分析

【目的】克隆棉花脂肪酸合成碳链延长的3个重要基因,分析它们的基因表达及其对逆境胁迫的反应,为棉花高油分育种和抗逆育种提供候选基因。【方法】采用同源克隆的方法,克隆陆地棉脂肪酸合成碳链延长3个重要基因GhKAR、GhHAD和GhENR的cDNA全长;应用生物信息学方法,分析克隆基因编码蛋白的特性;通过RT-PCR,分析目标基因的组织表达特征、时空表达水平和非生物胁迫条件下的表达特性。【结果】GhKAR和GhENR属于NADB Rosemann超基因家族,GhHAD属于hotdog超基因家族;GhKAR、GhHAD和GhENR的cDNA全长分别为1 119、906和1 318 bp,分别编码283、221、394个氨基酸;它们在根、茎、叶及胚珠发育不同时期均有表达。3个基因在高油材料中的基因表达水平都高于低油材料;20DPA（days post anthesis）到30DPA是高低油材料油分积累的主要时期,而30DPA到成熟期是高低油材料油分含量差距产生的关键时期。20DPA低油材料3个基因均有一个表达低值,高油材料基因表达量则持续升高;30DPA时表达量达到最高,其中,对于GhHAD和GhENR的表达量,棉花高油材料为低油材料2倍以上。不同非生物胁迫的诱导表达分析表明,GhKAR、GhHAD和GhENR都不同程度地受低温诱导,GhKAR和GhHAD在ABA诱导时上调表达,但都不受MeJA诱导表达;而GhENR在MeJA诱导2 h时上调表达,之后逐渐下调,受ABA诱导不明显。【结论】获得了GhKAR、GhHAD、GhENR 3个基因cDNA全长,通过基因表达特征分析,3个基因的表达可能对种子油分积累起着重要作用,同时在棉花抗逆方面也起一定的生理作用。     

陆地棉LTP家族基因的克隆与表达分析

长链脂肪酸能够通过调节胚珠内源乙烯信号变化来促进棉花的起始和伸长发育,为深入了解棉花脂肪酸的转运过程及参与基因,对棉花全基因组进行了分析,克隆了11个脂质转运蛋白。实时荧光定量PCR证实:LTP6, LTP7, LTP9, LTP11 4个基因在纤维起始时期（野生型与突变体之间）的表达存在差异,这4个基因可能与纤维起始发育有关。通过基因组步移技术克隆了Gh-LTP6基因的启动子,并对其结构进行分析,发现其具有多个MYB结合位点。这些结果为深入研究LTP基因在纤维起始过程中的角色奠定了基础。     

陆地棉小GTP结合蛋白基因GhROP1和GhROP8的克隆及表达分析

为探究棉花ROP基因在非生物逆境胁迫及外源激素处理下的表达模式,利用同源克隆的方法获得2个陆地棉(Gossypium hirsutum L.)ROP基因GhROP1和GhROP8,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对其组织表达的特异性及不同逆境胁迫和外源激素处理下的表达模式进行分析。结果表明：1)GhROP1和GhROP8基因的开放阅读框(ORF)分别为591和630 bp,各编码197和210个氨基酸,均含有1个保守的RHO结构域。2)多序列比对显示2个GhROPs蛋白均符合ROP蛋白结构特征且与其他物种ROP蛋白具有高度的相似性,聚类分析表明,GhROP1蛋白属于Ⅰ类ROP蛋白,GhROP8蛋白属于Ⅱ类。3)2个GhROPs基因在不同组织中均有表达且存在组织特异性：GhROP1基因在真叶中表达量最高,在根部和茎部表达量较低;GhROP8基因在根部表达量最高,其他组织中均为低表达量。2个GhROPs基因对于干旱、高盐、低温及高温等非生物逆境胁迫和外源脱落酸(ABA)、生长素(IAA)的处理均有响应：2个GhROPs基因表达均受...     

玉米低磷胁迫诱导的ZmABI5基因的克隆及表达分析

通过已建立的稳定、高效、低成本的转录组分析体系c DNA-SRAP获得一个与玉米低磷胁迫反应有关的转录因子Zm ABI5基因。该基因编码355个氨基酸,其蛋白具有明显的碱性亮氨酸拉链结构。系统进化树分析结果表明,Zm ABI5与高粱Sb ABI5进化关系最近。c DNA-SRAP表达分析显示,在磷饥饿第5天时,Zm ABI5表达量在叶中达到最大,然后开始下降;而在根中,Zm ABI5基因的表达在未经磷饥饿处理时表达量最高,随着低磷处理时间的延长,基因表达量下降。定量PCR结果进一步证实了c DNA-SRAP的表达模式。     

大豆阴蔽响应基因GmIF-3的克隆与表达分析

【目的】对大豆阴蔽响应基因GmIF-3进行克隆与表达分析。【方法】前期采用蛋白磷酸化组学分析了大豆全蛋白组在白光及阴蔽胁迫下的磷酸化水平,筛选到1个受阴蔽诱导磷酸化水平显著升高的IF-3 (translation initiation factor)蛋白,将其基因命名为GmIF-3 (Glyma.17G072300)。利用生物信息学分析其启动子序列、蛋白结构、蛋白疏水性等生化特性;采用Gateway^?克隆方法克隆该基因的cDNA序列;采用实时荧光定量PCR检测该基因的组织表达模式及阴蔽处理下的表达情况。【结果】生物信息学分析表明:GmIF-3位于大豆第17号染色体上,可编码274个氨基酸残基的蛋白质,其蛋白等电点为9.11,分子量为30.83 ku,启动子含有多个与光信号响应和激素响应的顺式作用元件。实时荧光定量PCR显示:GmIF-3基因在真叶中的相对表达量最高,在三出复叶、茎尖分生组织、根、茎、叶柄、子叶、花和荚等多种器官中也均有表达。对大豆幼苗阴蔽处理0、1、2、4和6 h后,GmIF-3的表达量显著升高,阴蔽6 h的相对表达量最高,约为对照(阴蔽0 h)的...     

陆地棉干旱胁迫响应基因GhGR的克隆及特征分析

【目的】克隆陆地棉干旱胁迫谷胱甘肽还原酶基因（GhGR）,并对其序列进行生物信息学分析和表达分析。【方法】利用RACE和RT-PCR技术克隆陆地棉谷胱甘肽还原酶基因的全长序列,应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过基因枪转化和实时荧光定量PCR表达对该基因表达部位和表达模式进行分析。【结果】从陆地棉（Gossypium hirsutum L.）中克隆了谷胱甘肽还原酶基因GhGR,cDNA全长1 035 bp,其中,ORF为792 bp,编码263个氨基酸。氨基酸序列比对和同源性分析显示该基因与杨树（XP_002299276.1）、蓖麻（XP_002518118.1）、葡萄（CAN74593.1）同源性最高,分别为90%、91%和91%。系统发育树结果显示,GhGR与葡萄中该蛋白的亲缘关系最近。基因枪转化和实时荧光定量PCR分析表明GhGR定位于洋葱的细胞膜和细胞核膜,并且其表达量受干旱胁迫诱导上调表达。【结论】从陆地棉克隆得到谷胱甘肽还原酶基因GhGR,初步认为该基因对干旱胁迫有一定响应。     

陆地棉钾吸收相关基因GhHAK1的克隆与功能分析

棉花是一种典型的喜钾经济作物,其产量和品质形成与钾含量密切相关。克隆获得棉花高亲和性钾转运体基因GhHAK1框,系统进化树表明该GhHAK1基因属于第Ⅰ亚族,此分支被认为介导高亲和性K+。膜结构预测显示该基因编码的蛋白跨膜螺旋区域(TMS)有12个,且在第2和第3 TMS之间有一个较长的胞质质环。洋葱表皮亚细胞定位表明,该基因编码蛋白定位在细胞质膜上;继而对部分转GhHAK1基因拟南芥纯合系进行K+营养试验,发现在低钾(0.05 mmol/L)条件下,野生型拟南芥表现明显的缺钾症状,叶片黄化,植株抽薹明显受抑制,而转基因材料则表现植株叶片生长正常,抽薹未受影响,同时转基因拟南芥叶片中K+含量约为野生型拟南芥的2倍左右,根中K+含量约为1.5倍左右。该结果初步表明GhHAK1基因具有介导植株钾高效吸收的功能,为进一步培育适应土壤钾素匮乏及盐渍化环境下生长的棉花新品种提供重要的基因资源。     

棉花茉莉酸羧基甲基转移酶基因克隆及其表达分析

根据亚洲棉石系亚1号的转录组测序结果,克隆获得陆地棉品种"新陆早17号"的茉莉酸羧基甲基转移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT)全长cDNA,命名为GhJMT(GenBank登录号KJ856913)。序列分析表明,GhJMT基因开放阅读框为1 116bp,编码371个氨基酸。保守结构域分析显示,该基因编码的蛋白具有甲基转移酶-7保守结构域。系统进化树分析显示,GhJMT与可可的茉莉酸甲基转移酶在同一分支,可能定位于细胞质,为不稳定亲水性蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,2.5%PEG6000胁迫处理12h时,根中GhJMT基因的表达迅速上调并达到最大值,约为对照的2.6倍,在茎中GhJMT的表达量在9h达到最高,约为对照的2.3倍,而在叶中GhJMT表达量在3h达到最高,约为对照组的2.1倍,说明GhJMT基因表达受干旱胁迫的诱导。研究结果有助于阐明GhJMT基因表达与植物抗旱的相关性。     

陆地棉盐胁迫应答基因GhWRKY41的克隆与分析

为研究转录因子GhWRKY41在陆地棉盐胁迫应答过程中的作用,基于差减文库分析结果,利用RT-PCR和RACE技术,克隆了GhWRKY41基因(GenBank登录号为HM002635)。该基因cDNA长度为1 630bp,含有ORF(Open reading frame)为1 068bp,编码355个氨基酸的多肽,包含2个内含子。通过瞬时表达分析亚细胞定位,结果表明,转录因子GhWRKY41定位于细胞核,符合转录因子特性。转基因株系发芽试验结果表明,过量表达GhWRKY41基因,可显著提高转基因棉花在干旱、盐和低温胁迫下的发芽率;利用Real-time PCR技术,证明在盐和干旱胁迫条件下,转基因株系中GhWRKY41基因的表达量显著上升。GhWRKY41基因在根、茎和叶片中表达存在差异,根系中胁迫6h上调达到最高,茎中则胁迫48h达到最高,而叶片中仅6和24h上调表达。进一步比较转基因棉花与野生型棉花的纤维品质性状,结果表明GhWRKY41的过表达可以提高转基因棉花的衣分。因此,GhWRKY41参与了棉花响应盐和干旱胁迫应答过程,且过表达可提高转基因棉花耐盐性和耐旱性。     

陆地棉转录因子GhWRKY91基因的原核表达及鉴定

为了筛选出高表达棉花GhWRKY91可溶性蛋白的原核表达载体。以中棉所10号叶片的cDNA为模板PCR扩增GhWRKY91基因,扩增产物分别构建到4个不同的原核表达载体pET-22b(+)、pET-32a(+)、pMAL-c5x和pGEX-4T-1。将重组载体pET-22b(+)-GhWRKY91、pET-32a(+)-GhWRKY91、pMAL-c5x-GhWRKY91和pGEX-4T-1-GhWRKY91转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)或Arctic-Express?(DE3)RP中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析不同原核表达载体的蛋白表达情况。结果显示,pET-22b(+)-GhWRKY91 和pET-32a(+)-GhWRKY91在BL21(DE3)中以及pMAL-c5x-GhWRKY91在Arctic-Express?(DE3)RP中均未见明显蛋白表达,而pGEX-4T-1- GhWRKY91在Arctic-Express?(DE3)RP中表达的蛋白基本存在于上清中,可获得可溶性蛋白。因此,将GhWRKY91基因构建到pGEX-4T-1原核表达载体上可成功获得可溶性蛋白。     

陆地棉GhSAMDC基因家族的全基因组分析

以已报道的SAMDC为探针序列,从异源四倍体陆地棉基因组数据库中筛选获得14个GhSAMDC家族基因。GhSAMDC家族基因的氨基酸多重序列比对发现该家族成员序列相似性约为50%,家族成员均具有GhSAMDC家族特有的保守结构域:酶原剪切位点结构域(LSESSLF)和PEST(TIHVTPEDGFSYAS)结构域。染色体定位分析发现14个基因均匀地分布在A和D基因组,A和D上各含7个GhSAMDC成员,无家族成员构成基因簇的现象。转录组测序结果发现 GhSAMDC1、 GhSAMDC7和 GhSAMDC8对黄萎病菌的胁迫有明显的响应,暗示这些在棉花抵御黄萎病菌胁迫过程中发挥一定的作用。试验为进一步研究GhSAMDC家族基因的功能及解析棉花抗黄萎病分子机制奠定了一定基础。     

棉花多胺氧化酶基因( GhPAO3)的克隆及表达分析

根据拟南芥AtPAO5的cDNA序列在雷蒙德氏棉数据库中Blastn比对获得同源PAO基因,设计特异性引物并利用RT-PCR技术克隆获得1个陆地棉PAO基因,命名为GhPAO3。对GhPAO3的cDNA序列进行生物信息学分析,结果显示:该基因cDNA全长为1 736bp,开放阅读框为1 530bp,编码506个氨基酸,预测蛋白大小为56.88ku,等电点为5.77,编码蛋白为亲水性蛋白。Real-time PCR结果表明,GhPAO3在不同组织中的表达情况不同,表达量依次是叶茎根花瓣子房雄蕊种子雌蕊。不同诱导处理下GhPAO3基因表达量也存在差异,其中低温处理和ABA处理后该基因在6h时表达量达到最大值,PEG处理后在24h时表达量达到最大值,NaCl则在处理后3h时表达量最高。表明GhPAO3基因受非生物胁迫诱导表达,可能以不同的角色参与棉花抗逆过程,结果为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

陆地棉与金花葵花朵差异代谢物筛选与分析

为挖掘棉花花朵中具有药用和食用价值的代谢物,以开花当天的陆地棉和金花葵的花朵为材料开展代谢组学检测,结果共检测到465个代谢物。利用差异倍数(Fold change)和VIP值(Variable importance in projection)相结合的方法筛选差异代谢物。结果表明,在陆地棉和金花葵的花朵中共筛选出差异显著代谢物269个,196个代谢物在陆地棉和金花葵中含量差异不显著。有29个代谢物仅在金花葵中检测到,包括氨基酸及衍生物、酚酸类、黄酮、木脂素和香豆素等,有41个代谢物仅在陆地棉中检测到,主要包括黄酮类、酚酸类和鞣质等次生代谢物。综上,陆地棉中富含黄酮、氨基酸及其衍生物、酚酸、生物碱、有机酸、脂质、核苷酸及其衍生物、鞣质和香豆素等物质。     

新陆早33号体细胞植株再生技术研究

以模式品种Coker 312为对照研究新疆主栽陆地棉品种新陆早33号的体细胞胚胎发生和植株再生。研究表明,2个品种的下胚轴均能在0.05mg·L-1 2,4-D+0.1mg·L-1 KT的激素组合诱导下获得初生愈伤组织,然后在无激素诱导条件下获得胚性愈伤和体细胞胚。新陆早33号与Coker 312在MSB3培养基上最早体细胞胚胎发生时间分别为60d和87d,胚胎分化率分别为67.2%和61.4%。新陆早33号在180d获得根系发育良好的再生幼苗,而Coker 312需要210d。应用此法,成功获得新陆早33号的体细胞胚和再生植株,且其胚胎发生能力和再生效率均优于对照材料。     

海岛棉GbHCT14基因启动子克隆及上游调控因子筛选

为探究GbHCT14基因CDS区及启动子序列在棉花纤维发育中的作用,通过中国农业科学院棉花研究所数据库检索到GbHCT14基因CDS区及上游非编码区-2 000 bp片段序列,克隆CDS区及启动子,并检测启动子活性。构建cDNA文库,利用酵母单杂交技术筛选阳性克隆,获得候选转录因子,并进行生物信息学分析。结果表明:1)GbHCT14基因的CDS区全长1 144 bp,其翻译产物为亲水性稳定蛋白,预测定位在叶绿体,没有信号肽以及跨膜结构域。2)GbHCT14基因启动子预测到5个MYB结合位点参与植物苯丙烷代谢途径的调节,1个TCA-element参与水杨酸调节,6个ABA响应元件。3)GbHCT14启动子能够驱动GUS蛋白表达,具有启动活性。4)酵母单杂交初步筛选出16个候选基因,包括Gbar_D01G020710、Gbar_A09G017360、Gbar_A09G009680、Gbar_A11G003660、Gbar_A12G004430、Gbar_D04G021210、GbM_D09G1212、GbM_A11G0186、GbM_A03G0171、GbM_A09G1247、GbM_D10G0411、GbM_D10G1024、GbM_D02G1379、GbM_A11G1190、GbM_D12G0471和genome_Gbar-ZJU_D08。利用生物信息学分析预测表明,上述候选基因参与棉花纤维细胞壁的伸长、泛素化反应、细胞分裂、花发育以及果实成熟的过程,其中GbM_A09G1247与WAK2为相似基因,WAK2功能蛋白与果胶结合后促进细胞壁的伸长,而HCT家族基因则是影响果胶合成的关键因素之一。5)GbHCT14和WAK2基因在棉花开花后25 d内高表达,两者在棉花纤维发育调控存在相关性。综上,GbHCT14基因CDS区及启动子序列为首次获得,GbHCT14基因启动子具有启动活性,并且筛选到与裂合酶、转移酶、植物激素、质子泵和功能蛋白相关的16个上游调控的候选转录因子。     

陆地棉ARF与LAV家族成员鉴定及表达模式分析

为了了解B3超家族在棉花纤维发育及色素代谢过程中的作用,应用生物信息学的方法,对陆地棉B3超家族中的ARF和LAV亚族成员的序列特征、染色体定位、保守基序、基因结构、系统进化以及表达模式进行分析。结果表明,在陆地棉基因组中鉴定出49个GhARF和8个GhLAV,通过表达模式分析表明,GhARF17、GhARF18、GhARF20、GhARF21、GhARF43、GhARF44、GhARF45、GhARF47、GhARF49以及GhLAV1、GhLAV3和GhLAV6在纤维不同发育时期的表达模式和纤维中原花青素含量变化趋势相符,推测可能参与纤维成色过程。