苹果MxIrt1基因的克隆与原核表达

根据植物IRT(Iron Regulated Transporter)家族的功能保守区设计引物,通过RACE法从缺铁胁迫处理的小金海棠根系cDNA文库中克隆得到了Fe²⁺转运蛋白基因cDNA全长,将其命名为MxIrt1(Malus xiaojinensis Iron regulated transporter 1)。将MxIrt1 cDNA片段与pET30a构建原核表达载体pEIrt,转化大肠杆菌BL21。SDS-PAGE电泳检测结果表明,以30℃、0.5mmol·L^-1 IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个40kD的蛋白。为进一步纯化和鉴定目的蛋白提供了试验基础。     

苹果己糖激酶基因MdHXK1的克隆与表达分析

从‘嘎啦’苹果中克隆了己糖激酶基因MdHXK1(基因序列号:MDP0000309677)全长,测序发现其包含长为1 497 bp完整的开放阅读框,编码499个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为54.05k D,等电点为5.76。系统进化树分析表明,HXK1在不同物种间具有高度的序列保守性;其中,苹果MdHXK1与中国白梨Pb HXK1亲缘关系最近。功能域分析表明,MdHXK1蛋白含有两个保守的激酶域。Southern blotting结果表明,MdHXK1在苹果基因组中有一个拷贝。亚细胞定位预测表明,MdHXK1主要定位于细胞质。分析MdHXK1基因启动子序列发现含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdHXK1在苹果的茎和花中表达量较高;在苹果果实发育期间,MdHXK1基因的表达、MdHXK1葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累水平都呈现先升高后降低的趋势,MdHXK1基因的表达明显受盐、低温和ABA的诱导。原核诱导并纯化了MdHXK1蛋白,为后续MdHXK1蛋白的功能鉴定奠定基础。     

新疆红肉苹果PGIP基因的克隆及原核表达

【目的】研究克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f.neidzwetzkyana(Dieck)Langenf]PGIP基因并进行原核表达,探讨其抗病机制。【方法】根据Genbank中已经发表的‘金冠’苹果PGIP保守区域设计1对特异引物,以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段连接到原核表达载体pET30a(+)中,构建融合表达质粒,转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达。【结果】序列分析表明,新疆红肉苹果PGIP基因cDNA编码区全长993 bp,编码330个氨基酸残基,命名为MsPgip,GenBank登录号为JQ001783。MsPgip分子质量为36.6 kD,等电点为7.05,有6个潜在的N-糖基化位点,信号肽为N端24个氨基酸残基。该蛋白质还具有2个连续的24个氨基酸残基大小的LRR基序(LSQLKNLTFLDLSFNNLTGAIPSSLSQ LPNLNALHLDRN-KLTGHIPIS)。与已克隆的‘澳洲青苹’、‘金冠’、‘富士’苹果PGIP氨基酸序列同源性均高达99%。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达蛋白的分子质量与预期一致。【结论】克隆了新疆红肉苹果PGIP基因,并可在大肠杆菌中表达。     

新疆红肉苹果转录因子MsMYBIO基因的克隆、序列分析及原核表达

目的：克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f．neiclzwet-zkyana（Dieck）Langenf]MYB10转录因子基因,进行序列分析和原核表达研究,为进一步探索红色发育机理及选育新的栽培红肉苹果奠定理论基础。     

扁桃AcSFB基因的克隆与原核表达分析

 利用RT-PCR和RACE技术, 从新疆栽培扁桃‘鹰嘴’花药中获得了一个全长的SFB ( S-hap-lotype-specific F-box gene) 基因(GenBank登录号为FJ362525) , 命名为AcSFBd。该基因全长1 125 bp, 编码374个氨基酸, 在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F2box基序, 含有两个高变区(Hva和Hvb)和两个可变区(V1和V2) 。生物信息学的方法成功预测了AcSFBd蛋白分子质量为43 kD, 为亲水性、非分泌型蛋白, 在基质内起连接酶(EC6. - . - . -) 的作用。成功构建了原核表达载体, 并转化大肠杆菌BL21 (DE3) , SDS2PAGE检测结果显示表达了一个约60 kD的蛋白。     

红肉苹果愈伤组织生长素信号相关基因MdARF3的克隆与表达分析

以红肉苹果‘紫红3号’(新疆红肉苹果与‘富士’F_1代)的红色幼嫩叶片为外植体诱导的红色愈伤组织为试材,初步探讨生长素调控苹果花青苷代谢机理。根据拟南芥AtARF3蛋白序列在苹果基因组中Blast比对得到一个生长素信号相关基因(MDP0000173151),暂命名为MdARF3。克隆测序发现该基因的开放阅读框长度为2 127 bp,编码708个氨基酸。进化树分析表明,MdARF3与AtARF3在同一进化支上,推测它们具有相似的功能。愈伤组织在含有0.3 mg·L~(-1) NAA的MS培养基培养2 h之后其MdARF3上调表达,表达量极显著高于无NAA培养基(对照),而CHS、CHI、F3H、DFR、UFGT及LDOX等花青苷合成结构基因的表达量均极显著低于对照,并且MdARF3表达量与培养基中NAA浓度呈显著正相关(相关系数为0.98),与愈伤组织花青苷含量呈显著负相关(相关系数为–0.89),推测MdARF3对培养基中生长素快速做出反应调控花青苷合成;通过原核诱导获得了MdARF3的重组蛋白,为进一步研究MdARF3蛋白在花青苷代谢途径中的功能奠定了基础。     

苹果属小金海棠转录因子MxMYB1基因的克隆及其原核表达

 MxMYB1是苹果属小金海棠MYB类转录因子。MxMYB1含1个重复序列及MYB蛋白特有的氨基酸组成。酶切、PCR扩增及测序分析表明构建的原核表达载体结构正确, 未出现碱基突变及移码现象。1 mmol/L IPTG诱导2 h后, 在预期的蛋白分子量38 kD处出现1条表达加强的蛋白条带, 而未经诱导的转化子没有此蛋白条带。为进一步目的蛋白的纯化和鉴定提供试验基础。     

桦褐孔菌纤维素酶基因的克隆与原核表达

成功获得了桦褐孔菌(Inonotus obliquus)JL 01菌株的内切葡聚糖酶(IO-EG)和β-葡萄糖苷酶(IO-BGL)的cDNA全长序列.eg2基因cDNA序列全长(ORF)为1149 bp,编码382个氨基酸,bgl2基因cDNA序列全长(ORF)为2583 bp,编码860个氨基酸;成功构建了30a-eg2和30a-bgl2大肠杆菌表达菌株,诱导培养后,SDS-PAGE电泳分析表明两个菌株均表达蛋白,且蛋白以包涵体形式存在,为桦褐孔菌高效外源基因表达系统的建立提供了基础.     

苹果属小金海棠MxIrt1基因特异性片段的原核表达及多克隆抗体的制备

 MxIrt1是从苹果属植物小金海棠中克隆出的二价阳离子转运膜蛋白基因。为进一步研究该基 因的功能, 利用MxIrt1基因位于第3和第4跨膜区之间的162 bp片段, 构建了原核表达载体pGEX-MxIrt1,经原核表达、亲和层析、获得GST2MxIRT1融合蛋白, 以融合蛋白为抗原, 制备多克隆抗体, ELISA方法检测抗体效价阳性, 蛋白质印迹检测植物体内总蛋白, 获得与预期大小一致的特异性条带。上述结果表明,表达的目的蛋白可用于免疫组织化学、蛋白质印迹检测。     

切花月季ACC合成酶基因的克隆和原核表达

克隆了与伤害诱导相关的Rh-ACS1和与花朵开放进程及乙烯诱导相关的Rh-ACS3基因全长。结果表明,Rh-ACS1基因全长为2 132 bp,开放阅读框（ORF）长度为1 476 bp,推定编码491个氨基酸。Rh-ACS3基因的全长1 734 bp,ORF长度为1 545 bp,推定编码514个氨基酸。对这两个基因编码的蛋白进行原核表达分析,结果显示,在37 ℃条件下,0.6 mmol · L-1 IPTG诱导3 h后,携带Rh-ACS1 ORF和Rh-ACS3 ORF的原核表达载体分别在大肠杆菌中诱导生成了大量分子量约为70和60 kD的蛋白质,其大小与根据基因序列预测的理论值相一致。     

独行菜LaSPS基因的克隆与生物信息学分析及原核表达

以独行菜(Lepidium apetalum)幼苗叶片为试材,采用PCR方法,扩增得到LaSPS基因的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建pET-32a-LaSPS原核表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达LaSPS重组蛋白。结果表明:LaSPS基因ORF长1 269bp,编码422个氨基酸,包含茄呢醇焦磷酸合酶结构域,是异戊烯基合成酶家族的成员;序列分析发现,LaSPS蛋白定位于叶绿体中,不含信号肽没有跨膜区;通过序列比对和系统进化分析,显示LaSPS蛋白与拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtSPS2蛋白相似度为91%,亲缘关系最近;在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达LaSPS重组蛋白,为研究LaSPS基因在独行菜质体醌生物合成途径中的功能奠定了基础。     

葡萄A病毒四川分离物的外壳蛋白基因克隆与原核表达

葡萄A病毒（Grapevine Virus A,GVA）是葡萄病毒属（Vitivirus）的典型种,在世界葡萄产区广泛分布。采集10株“藤稔”葡萄成熟枝条,使用6种葡萄病毒ELISA试剂盒检测发现10个样本中有6个感染4种不同的葡萄病毒。以GVA的ELISA阳性植株为材料进行RT-PCR扩增,首次获得了GVA四川分离物SL10的完整外壳蛋白基因（CP）。该基因全长597 bp,将其与GeneBank收录的15个GVA分离物的CP序列进行比对和构建系统进化树。把不同地理起源的GVA分离物分成2个变异组;其中Ⅰ组包括3个分离物(与Ⅱ组的其他分离物只有75.9%～80.1%的序列同一性);其余的13个分离物组成Ⅱ组（组内分离物具有84.4%～99.5%的序列同一性）。构建了GVA CP的原核表达质粒PET-30-GVAcp并转化BL21菌株,经IPTG诱导,目的基因得到了大量表达。     

龙眼14-3-3基因的克隆与原核表达

 以龙眼(Dimocarpus longan Lour. ) 为试材, 应用同源克隆和RACE方法从花芽中获得了调控 蛋白14-3-3的全长cDNA序列, GenBank登录号为FJ479618 (GI: 218202931) 。该cDNA全长1 121 bp, 包括一个783 bp的开放阅读框, 编码261个氨基酸, 序列比较分析显示14-3-3 cDNA具有较高的保守性。半定量RT-PCR分析结果表明, 14-3-3 mRNA在龙眼叶芽、叶片、花芽和成熟的花中都有表达, 但在花芽中表达量最大。构建了pET14-3-3原核表达系统, 将14-3-3全长cDNA在大肠杆菌中表达, 获得一个分子量约为34 kD的可溶性融合蛋白, 经Western blotting验证, 该蛋白为14-3-3蛋白。     

鱼腥草糖基转移酶基因UGT75C1 的克隆及原核#br# 表达

 根据已经获得的鱼腥草UGT75C1 转录本序列设计1 对引物,采用RT-PCR 方法获得UGT75C1 基因cDNA 序列,并对UGT75C1 蛋白进行理化性质分析,并预测该蛋白功能;利用实时荧光定量PCR 方法检测了UGT75C1 基因在鱼腥草的地下茎、地上茎、叶、花中的表达情况,将克隆得到的UGT75C1 基因完整开放阅读框连接到原核表达载体pGEX4T-1 上,转化大肠杆菌E. coli BL21（DE3）,通过IPTG 诱导表达,SDS-PAGE 检测表达产物。克隆获得的UGT75C1 基因长为1 787 bp,开放阅读框1 461 bp, 编码486 个氨基酸。生物信息学预测UGT75C1 蛋白含跨膜区,不含信号肽,具有糖基转移酶的PSPG motif。 UGT75C1 在鱼腥草的叶片中表达丰度最高,其他器官中表达量相对较低,花中表达量最低;该基因原核 表达产物与预期大小一致,显示原核表达成功,为下一步研究其功能奠定了基础。     

刺激植物响应蛋白基因TatEpl1的克隆及原核表达载体构建

以深绿木霉(Trichoderma atroviride)ACCC30153为试材,采用PCR技术克隆到刺激植物响应蛋白基因TatEpl1,并构建TatEpl1的原核表达载体。结果表明:经测序得到的cDNA和DNA序列长度分别为417bp和487bp,接受号分别为JN695780和JN695781。以cDNA为模板进行PCR获得TatEpl1基因片段,并将目的片段插入原核表达载体pGEX-4T-2的相应位置,获得重组表达载体pGEX-TatEpl1,并将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中获得重组菌株BL21-TatEpl1,经检测均呈阳性。     

番茄转录因子基因SlWRKY16的克隆及原核表达分析

从栽培番茄(Solanumlycopersicum)‘M82’中克隆到1个WRKY家族基因SlWRKY16。研究结果显示:SlWRKY16包含1 497 bp的完整开放读码框,编码498个氨基酸,理论分子量为55.5 kD,含有1个WRKYGQK保守结构域和C2H2锌指结构域,属于Ⅱb类WRKY转录因子基因,且定位于细胞膜上;栽培番茄Sl WRKY16与潘那利番茄Sp WRKY6(XP₀15064265.1)、马铃薯St WRKY6(XP₀06350473.1)同源性最高。qRT-PCR结果显示SlWRKY16在番茄不同组织中均有表达,叶片中的表达量最高;短时间非生物胁迫下该基因的表达量显著降低。此外,重组菌pET-30a-SlWRKY16在NaCl、甘露醇胁迫下生长均明显低于对照菌pET-30a。综上,番茄SlWRKY16基因可能在响应非生物胁迫过程中具有负调控效应。     

龙眼转醛醇酶基因的克隆与原核表达

转醛醇酶作为磷酸戊糖途径非氧化阶段的关键酶,在调节植物PPP对环境胁迫的应答中起重要作用.该研究应用RACE方法克隆了龙眼(Dimocarpus longan Lour.)花芽中转醛醇酶的基因,获得一段长度为1 655 bp的cDNA,其中包括一个1 320 bp的开放阅读框,已登陆GenBank,登陆号为FJ472991(GI:217795375).将转醛醇酶全长cDNA在大肠杆菌中表达,获得一个约55 kD带有组氨酸标签的外源蛋白.RT-PCR结果显示,TAL mRNA在龙眼成花逆转花芽中有较明显的表达量上调,说明TAL在一定程度上影响了龙眼正常成花.     

拟南芥热激转录因子HSFA2基因克隆与原核表达

为了进一步阐明HSFA2功能,现采用Trizol法分离拟南芥叶片总RNA,用RT-PCR方法得到拟南芥HSFA2基因,经过连接、转化和蛋白诱导对其进行了原核表达研究。结果表明:从拟南芥叶片中分离到了高质量的总RNA,进而扩增到了目的基因,将其连入表达载体PGEX-KG,且转入大肠杆菌BL21中。不同温度条件下的诱导结果表明,16℃下蛋白诱导效果较好。采用这套系统,可以使AtHSFA2得以较好的表达。