双癸甲溴铵洗消剂对常见病毒消毒试验观察

１　材料与方法１１　动物　３～４日龄ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ乳鼠,公母各半。１２　双链季铵盐洗消剂　由徐州法尔达日用化工公司赠送,有效成分双癸甲溴铵含量为１０％。１３　ＨＢｓＡｇＫｉｔ　用于常规ＥＩＡ检测ＨＢｓＡｇ,从上海科华生物技术公司购买。１４　病毒　口蹄疫０型乳鼠组织毒（ＦＭＤＶ）,滴度为１０－７ＬＤ５０／ｍｌ;猪水泡病乳鼠组织毒（ＳＶＤＶ）,滴度为１０－８ＬＤ５０／ｍｌ;鸡新城疫Ⅰ系病毒（ＮＣＶⅠ）,ＥＩＤ５０＞１０８３／ｍｌ。上述病毒均由南京农业大学提供。１５　中和剂…     

衣原体单克隆抗体在牛羊血清诊断上的应用

采用淋巴细胞亲交瘤技术，研制出的抗衣原体单克隆抗体，应用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）方法，对本地区所采集的１２８份羊血清、９０份牛血清进行检测，结果，羊血清阳性检出率为２５．８％，牛血清阳性检出率为３２．２％，选择５０份羊血清、５０份牛血清用已建立的检测衣原体抗体ＥＬＩＳＡ与间接血凝试验（ＩＨＡ）进行比较，牛血清ＥＬＩＳＡ阳性检出率为３２．０％，ＩＨＡ为２４．０％，ＥＬＩＳＡ比ＩＨＡ试验高出８个百分点；羊血清ＥＬＩＳＡ阳性检出率为２６．０％，ＩＨＡ为２２．０％，ＥＬＩＳＡ比ＩＨＡ高出４个百分点。     

斑点酶联免疫吸附试验检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体方法的建立

首次建立了斑点－酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ，美洲株）抗体的方法。特异性鉴定表明，ＰＲＲＳＶ不与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒阳性血清反应；与美国进口的ＰＲＲＳＶ抗体ＥＬＩＳＡ诊断试验盒检测结果比较，３５份猪血清的阴、阳性检出总符合率为８２．９％（２９／３５），其中Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ的阳性检出率略高于进口试剂盒的检出率。     

禽流感病毒重组核蛋白ELISA诊断技术的研究

用表达禽流感病毒（ＡＩＶ）核蛋白基因的杆状病毒感染Ｓｆ９昆虫细胞。以其表达产物制备抗原,建立了以杆状病毒系统表达的ＡＩＶ核蛋白为抗原的禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断技术（ｒＮＰ－ＥＬＩＳＡ）。其抗原最适包被量为０．６μｇ／孔,等检血清最适稀释度为１：２００,酶标抗体使用浓度为１：１０００。根据对１４０份ＳＰＦ鸡血清检测结果的统计分析,确定其判定标准为ＯＤ均为阴性;检测Ａ型ＡＩＶ１５个不同亚型（Ｈ１￣Ｈ１５）毒株的特异性血清均为阳性;对人工接种ＡＩＶ的ＳＰＦ鸡第３天即能检出抗体,到第１６２天试验结束时检测仍为阳性。其批内和批间重复试验的变异系数分别在２．９％￣７．２％和３．４％￣９．８％之间。对３１３８份鸡血清进行监测,ｒＮＰ－ＥＬＩＳＡ与全病毒间接ＥＬＩＳＡ与全病毒间接ＥＬＩＳＡ（ＡＩＶ－ＥＬＩＳＡ）、琼脂扩散     

鸡传染性法氏囊病双抗体夹心Dot─ELISA诊断法的建立及应用

以醋酸纤维素膜作为固相载体，辣根过氧化物酶标记鸡抗传染性法氏囊病病毒抗体（ＩＢＤ—ＩｇＧ），饱和二氨基联苯胺为底物显色，建立了鸡传染性法氏囊病双抗体夹心Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ诊断法。经方阵实验确定最佳反应条件为：ＩｇＧ的包被液为０．０５ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ９．６）碳酸盐缓冲液，包被浓度为１：５０；酶标抗体的工作浓度为１：１００；洗涤液为含０．０５％吐温—８０的０．０２ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．４）磷酸盐缓冲液；封闭液为含０．２％明胶的洗涤液；封闭时间、抗原及酶标抗体的作用时间均为３７℃３０ｍｉｎ。应用本方法和琼扩试验同步检测２０份已知阳性病料、１２０份待检病料和胚毒尿囊液、１０份正常鸡样品，结果表明，Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ阳性率为９０％，而琼扩试验为４０％；凡琼扩试验阳性者，Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ均呈强阳性，而在Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ阳性样品中，只有４４％呈琼扩试验阳性，Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ的敏感度为琼扩试验的１００倍。     

禽流感RT-PCR诊断法的建立

根据禽流感病毒（ＡＩＶ）Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｂｒｅｓｌｉｎ／１９０２（Ｈ７Ｎ７）株的血凝素（ＨＡ）基因参考序列设计合成一对Ｈ７ＨＡ特异引物,并应用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取病毒ＲＮＡ,建立了逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测ＡＩＶＲＮＡ的方法。应用此法对鸡胚培养的ＡＩＶ尿囊液、ＳＰＦ感染鸡粪便进行了检测,并与琼脂扩散试验和电镜技术作了对比。特异性试验以新城疫病毒（ＮＤＶ）、传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）、传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、减蛋综合征病毒（ＥＤＳ－７６Ｖ）等的感染鸡胚尿囊液作为对照。结果表明,ＡＩＶ尿囊液ＲＴ－ＰＣＲ全部阳性,ＳＰＦ感染鸡粪便８７份,ＲＴ－ＰＣＲ检出６９份阳性,样品处理浓缩后琼脂扩散检出１１份,电镜检测了２３份样品,仅检出２份阳性。非特异性对照样品经ＲＴ－ＰＣＲ检测全部阴性。将ＡＩＶ感染鸡胚尿囊液作１０倍系列连续稀释,可检出稀释度为１０－２的病毒尿囊液。ＲＴ－ＰＣＲ最早检出时间为感染后第３天,而琼扩和电镜均是７天。该法具有高度的特异性和灵敏性,且节约时间（只需８小时左右）,可从分子水平上对ＡＩＶ进行早期快速诊断和流行病学调查     

猪流行性腹泻病毒适应Vero细胞培养及以传代细胞毒制备氢氧化铝灭活疫苗免疫效力试验

采用在病毒培养液中加５～１０μｇ／ｍｌ胰酶的培养方法，将猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）ＣＶ＿（７７７）适应于Ｖｅｒｏ细胞，并传４５代．细胞病变规律．经免疫荧光检查阳性，电镜观察可见典型冠状病毒粒子，猪传染性胃肠炎（ＴＧＥ）免疾荧光检查阴性，猪流行性腹泻（ＰＥＤ）血清可抑制细胞病变（ＣＰＥ）．ＰＥＤＶＣＶ＿（７７７）毒株１１、２５、２８、４０及４４代传代毒的毒价分别为１０￣（３．５）、１０￣（５．５）、１０￣（６．５）、１０￣（７．０）和１０￣（７．０）ＴＣＩＤ＿（５０）／０．３ｍｌ。以１１、２１及２２代的毒１０ｍｌ头口服接种未吃初乳仔猪，可使之典型发病，免疫荧光及电镜观察均呈阳性．分别以２５、２８及３１代毒０．５ｍｌ／头、１ｍｌ／头、２ｍｌ／头口服接种３日龄仔猪１８头．除０．５ｍｌ组有１头反应外，均未发病，攻毒试验的总保护率为８７．５％，对照组１００％发病．以２８代毒制备氢氧化铝灭活苗，后海穴位接种，主动免疫组８５．１９％保护，被动免疫组８５％保护，对照组１００％及９２．３％发病．     

左旋咪唑,丙硫咪唑对猪瘟免疫效果影响的比较试验

在给５０～６０日龄仔猪接种ＨＣ疫苗的同时，分别加服左旋咪唑，丙硫咪唑，于免疫后１０，３１，８５，１３６，１８２ｄ用１ＨＡ法５次检测ＨＣ血清抗体效价，结果试验１组ＩＨＡ抗体价每次都显著高于试验２组（Ｐ〈０．０１），试验２组与对照组间的ＩＨＡ抗体效价每次均无显著差异（Ｐ〉０．０５），表明左旋咪唑对ＨＣ疫苗免疫猪有明显的免疫增强作用，能明显提高ＨＣ免疫效果；丙硫咪唑对ＨＣ疫苗免疫猪无免疫增强作用。     

口蹄疫(续)

①乳鼠中和试验１用已知血清鉴定未知病毒法将病畜水泡皮或肌肉、脏器等组织以生理盐水或磷酸盐缓冲液制成１．５～１：１０的悬液，于４℃冰箱浸毒过夜，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，上清液为被检病毒液。用ＦＭＤＶ和Ｏ、Ａ、Ｃ、ＡｓｉａⅠ型标准毒株制备豚鼠抗血清，以１：５稀释，与等量被检病毒液混合，３７℃孵育１ｈ。后分别接种３～４日龄乳鼠，颈背皮下注射０．２ｍｌ／只。每组接种４只，同时设健康乳鼠、生理盐水和血清对照组。每窝鼠以１只母鼠哺乳。接种后观察７ｄ，每天记录２次。结果判定：先检查对照组，健康鼠…     

应用间接免疫荧光法检测狂犬病病毒

取０．５ｍｌ兔ＢＨＫ－２１新鲜健康细胞液和０．１ｍｌ狂犬病病毒细胞液在含小飞片青瓶中混合，培养２４小时后制片，加抗狂犬病病毒兔抗体感作，用驴抗兔荧光抗体染色，通过荧光显微镜观察细胞浆内黄绿色结构判定病毒是否在细胞内增殖，从而建立了检测狂犬病病毒的间接免疫荧光法（ＲＦＡＴ）。用ＲＦＡＴ检测５批Ｆｌｕｎｇ－ＬＥＰ株培养液，５批ＥＲＡ株培养液和５批鹿毒８２０２株培养液，ＴＣＩＤ５０平均滴度分别为５．６８、６６０５、４．８６；对小鼠脑内接种，ＭＬＤ５０平均滴度分别为５．５、５．５６、４．２５。从试验结果看，ＲＦＡＴ是取代ＭＬＤ５０测定法的理想方法。     

乙型脑炎病毒HW1克隆纯化株的鉴定及外源性污染的鉴定

应用病毒蚀斑技术，将乙型脑炎病毒ＨＷ１株在鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）单层培养上连续挑斑纯化３次，对纯化后的克隆株进行血清学，免疫生物学鉴定及外源性污染检定。毒株对ＢＨＤ－２１细胞感染滴度≥１０＾６．１５ＴＣＩＤ５０；对８－９ｇ小鼠脑内感染的毒力≥１０＾７．１０ＬＤ５０／０．０４ｍＬ；与ＪＥＶＰ３株阳性参考血清的中和指数≥２０００；克隆株对猪有较好的的性，无外源性污染。     

阉牛不同日粮的纤维消化,瘤胃内VFA对甲烷产生量的影响

装有瘤胃和真胃瘘管的成年阉牛４头，体重（５００±５０）ｋｇ，采用４×４完全拉丁方试验设计，在呼吸代谢室内就不同日粮的纤维消化、瘤胃内ＶＦＡ对甲烷产生量的影响进行了研究。结果表明：（１）可消化中性洗涤纤维（ＤＮＤＦ）和可消化酸性洗涤纤维（ＤＡＤＦ）的甲烷产生量，在不同加工细度羊草之间（７．５ｍｍ，１５ｍｍ，３５ｍｍ和长草）无显著差异（Ｐ＞０．０５）。（２）不同精粗比日粮（０∶１００，２５∶７５，５０∶５０，７５∶２５）的ＮＤＦ或ＡＤＦ降解量（ｋｇ／ｄ）与甲烷产生量呈较高的线性正相关（ｒ＝０．８６８９或ｒ＝０．９７７５），乙酸、丙酸、乙酸＋丙酸产量（ｍｏｌ／ｄ）以及乙酸／丙酸与ＣＨ４产生量（Ｌ／ｄ）之间均存在较高的线性相关（ｒ依次为０．９６９１，－０．９６８３，０．９７８９，０．８８３３）。     

二花脸猪乳中生长因子的动态及其与大约克猪的比较

通过２个系列实验,分析了二花脸猪乳中生长因子（ＩＧＦ－Ⅰ、ＥＧＦ和胰岛素）在泌乳早期（１￣２１ｄ）的含量及其变化规律,并与大约克猪进行了比较研究。结果表明,二花脸和大约克猪乳中ＩＧＦ－Ⅰ在初乳中浓度很高,分娩１周后迅速下降,泌乳第７￣２１天变化不大。在泌乳第１￣７天,二花脸猪乳中ＩＧＦ－Ⅰ低于大约克猪,泌乳第７天以后又高于大约克,但２种猪的差别不显著（Ｐ〉０．０５）。猪乳中的ＥＧＦ变化规律基本上和     

PCR检测鸡减蛋综合征病毒

根据已报道的鸡减蛋综合征（ＥＤＳ－７６）病毒ＤＮＡ序列，设计合成了１对引物，建立了ＥＤＳ－７６病毒的双温式聚合酶链反应（ＰＣＲ）诊断方法。该方法对ＥＤＳ－７６病毒长春株、河南株和广东株扩增结果均为阳性；而对致死鸡胚孤儿病毒（ＣＥＬＯＶ）、鸡病毒性关节炎病毒（ＶＡＶ）、鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）和鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）的扩增结果均为阴性。可检测ＥＤＳ－７６病毒ＤＮＡ为０．３×１０－４ｐｇ。结果表明该方法特异且敏感。此外，将常规的三温式ＰＣＲ的操作规程改为双温式，反应体积由常规５０～１００μＬ改为２０μＬ，使其更加快速、简便、经济     

治疗母畜产后闭乳

治疗母畜产后闭乳红花（牛１５ｇ、猪７ｇ）、当归（牛３０ｇ、猪１０ｇ）、益母草（牛５０ｇ、猪１５ｇ）、穿山甲（牛１５ｇ、猪７ｇ）等水煎灌服，每日一剂，２－３剂见效。治疗母畜产后闭乳...     

狄高辛标记DNA探针对鸡马立克氏病的流行病学研究

用狄高辛标记的Ⅰ型马立克氏病病毒特异性ＤＮＡ探针，对自然感染鸡羽囊、人工感染鸡羽囊和脏器、同居感染鸡羽囊进行了检测。结果表明，自然感染鸡，其羽囊最早出现阳性的日龄为４２日龄，随日龄增大，羽囊阳性检出率升高，１５０日龄达最高峰（２６．７％）。以后则阳性率显著下降（６月龄为０．４８％，１年以上为０．２４％）。鸡人工感染马立克氏病国际标准强毒（ＭＤＶ－ＧＡ强毒）后３ｄ，就可从５只鸡中３只的心、肝、肺、肾、法氏囊、胸腺、肌胃等脏器检出Ⅰ型ＭＤＶ－ＤＮＡ；２５ｄ，５只鸡的脏器均能检出ＭＤＶ－ＤＮＡ；同时，感染后１０ｄ，就可从羽囊检出ＭＤＶ－ＤＮＡ，１５ｄ羽囊检出阳性率达１００％。同居感染鸡从羽囊排毒的最早时间为同居后３１ｄ，即接触强毒２１ｄ后开始持续排毒，直至死亡。     

用ELISA和PCR对猪,牛血清中HBV抗原,抗体及DNA的检测

用三个家生产的乙型肝炎（ＨＢ）ＥＬＩＳＡ试剂盒及聚合酶反应（ＰＣＲ）对牛、猪和羊血清分别进行了乙型肝炎病毒抗原（ＨＢＶ－Ａｇ）、抗体（Ａｎｔｉ－ＨＢＶ－Ａｂ）及ＤＮＡ的检测。ＥＬＩＳＡ共检出阳性牛血清１３份（１３／１３６），其中ＨＢ４Ａｇ阳性８份，ＨＢｅＡｇ阳性５份；阳性猪血清４份（４／３６），其中有ＨＢｅＡｇ阳性３份，ＨＢｅＡｇ阳性１份。全部阳性血清和部分阴性血清共１２０份经用ＰＣＲ检测ＨＢＶＤ     

左旋咪唑增强猪瘟免疫效果的试验

在给５０－６０日龄仔猪接种猪瘟疫苗的同时，加服左旋咪唑。分别于免疫后１０，３１，８５，１３６，１８２天检测血清抗体效价。试验组ＩＨＡ抗体效价都显著高于对照组（Ｐ＜０．０１），试验组抗体下降至有效效价以下的时间亦显著迟丁对照组。表明左旋咪唑能明显提高猪疫苗免疫猪的体液免疫应答，对猪瘟疫苗免疫猪有明显的增强作用。     

猪对传播流行性出血热作用的研究

应用ＩＦＡ和免疫酶染色法（ＩＥＡ）分别对家猪屠宰工人和饲养员及其猪肺组织和血清检测流行性出血热（ＥＨＦ）病毒抗原与抗体（抗－ＥＨＦ），结果屠宰工人和饲养员ＥＨＦ隐性感染率随着工龄和接触时间的增加而上升，呈正相关关系（ｒ＝０．９５；０．９８）。特别是从ＥＨＦ病毒抗原阳性猪的饲养员抗－ＥＨＦ率高达２０％（２／１０），而ＥＨＦ病毒抗原阴性猪饲养员未见感染（０／５０），不同疫区猪带毒率和抗－ＥＨＦ阳性率均     

牦牛病毒性腹泻—粘膜病病毒的分离及鉴定

一九八三年从四川某地区一牦牛分离到牛病毒性腹泻－粘膜病（ＢＶＤ／ＭＤ）病毒，定名为牦牛Ⅰ号毒株。该病毒可在牛肾或牛睾丸原代细胞上繁殖继代，但均不产生可见病变（ＣＰＥ），用荧光抗体染色检查，可见到ＢＶＤ／ＭＤ特异性荧光，其滴度在１Ｏ￣（－３）－１０￣（－５）之间。用细胞培养第１５代病毒做系列试验表明，该病毒为ＲＮＡ病毒，对乙醚敏感，不耐酸，对胰蛋白酶有一定抗力；回归黄牛，血清中和抗体呈ＢＶＤ／ＭＤ阳性。