微生物原生质体融合技术研究进展

原生质体融合技术在遗传学、动植物远缘杂交育种、生物学、免疫学、兽医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值,文章就原生质体制备、再生及其融合过程中的影响因素做了综述,另外还对原生质体融合方法和融合子的筛选方法进行了比较,为选择适宜有效的诱导融合方法和筛选方法提供依据。     

禾本科牧草及草坪草原生质体培养与融合技术研究进展

禾本科牧草与草坪草在可持续农业发展、城市绿化、生态保护等方面起着至关重要的作用。植物体细胞杂交是有性杂交的重要补充,在转移由多基因控制和尚未克隆目标基因控制的性状方面具有极大的潜力。本文综述了禾本科牧草及草坪草的原生质体培养与融合技术,包括原生质体分离材料的选择、培养基成分、培养密度及培养方式、融合的方法与方式。同时,对禾本科牧草及草坪草体原生质体培养与融合技术的应用前景作出展望。     

鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌双型融合菌株的构建

以耐药标记的鸭疫里默氏杆菌TXRA1(Chlr,Erys)和大肠杆菌ZBO78(Eryr,Chls)作为亲本菌株,在DnaseⅠ始终存在的条件下,采用Lysozyme-EDTA法制备2菌株的原生质体,原生质体制备率分别达到了92.00%和91.94%,再生率分别达到了38.77%和37.29%。通过PEG法进行2菌株原生质体融合,成功获得31株具有双亲本耐药性(Chlr,Eryr)的融合菌株,并应用双重PCR方法对融合株的部分外膜蛋白A(ompA)基因进行扩增,其中有11株融合菌株能够表达2亲本的ompA基因,有20株仅表达亲本大肠杆菌的ompA基因。融合菌株的形态、染色特性和生化特性等介于2亲本菌株之间,连续传15代后融合菌株的上述性状仍能够稳定遗传。     

细胞融合技术及其在生物医药中的应用

细胞融合技术正日益成为生物医药研究开发中的一项重要技术 ,利用它创建了一系列兼具亲本优良性状的生物和生物制品并产生了良好的经济效益 ,促进了生物医药的产业化。文章对细胞融合技术的遗传标记筛选 ,原生质体的制备、融合与再生 ,融合子的鉴定等的研究情况进行了概述。原生质体融合技术在生物医药上的应用 ,主要集中在抗生素生产菌种改良、植物病害防治以及动物疾病防治上。展望未来 ,其应用前景必将更加广泛     

禽多杀性巴氏杆菌与大肠杆菌科间原生质体融合的研究

以耐药标记的华农系禽多杀性巴氏杆菌５：Ａ弱毒菌株与禽大肠杆菌Ｏ２弱毒菌株作亲本，在ＤＮａｓｅ１始终存在的条件下，采用溶菌酶－ＥＤＴＡ法制备两亲本菌株原生质体后再生，原生质体形成率均９０％以上，原生质体再生率为３５．６３％，５０．９３％。通过聚乙二醇－钙离子促融合剂系统，进行质体后再生，原生质体融合，成功地获得３株具有双亲本耐药性和双菌体血清型的融合菌株。     

匍匐翦股颖和狗牙根原生质体融合研究

以匍匐翦股颖克罗米和狗牙根新农1号为材料,通过愈伤诱导、继代和悬浮培养,进而细胞融合来探讨草坪草品种改良的新方法.结果表明:(1)匍匐翦股颖和狗牙根原生质体融合时酶解液的最佳组合为:1.5%纤维素酶、0.1%果胶酶、0.7M甘露醇,10h酶解时间,且酶解前应用高渗溶液预处理效果更佳;(2)细胞融合时,原生质体密度2×106个/mL,融合剂由30%的PEG4000、15mmol/L CaCl2·2H2O、0.5mmol/L KH2PO4·H2O、0.5mol/L甘露醇组成,并调pH至7.5效果较好;(3)匍匐翦股颖和狗牙根细胞PEG融合率约为5%,以30min融合时间效果较好,产生的多核融合体少,杂种细胞多呈条形,具有较强的活力.     

大肠杆菌灭活苗的免疫试验

用甘肃省大肠杆菌的代表血清型和筛选的大肠杆菌菌株原生质体融合菌株及大肠杆菌菌株与沙门氏菌菌株原生质体融合菌株研制的大肠杆菌菌苗进行大肠杆菌灭活苗免疫学试验,试验结果表明菌苗免疫性能好,菌苗的免疫高峰期在30 d左右,凝集抗体滴度在28左右,对动物的保护期在4个月以上,而且稳定性能和安全性能均良好,是一种效果较好的菌苗。     

利用菊芋一步法生产酒精工程菌构建的研究

为了构建一种能够直接利用菊芋（Helianthus tuberosus）来进行酒精发酵的融合菌株，选择适宜的原生质体制备与融合条件，将自行筛选所得的一种能高产菊粉酶的青霉菌与酿酒酵母进行原生质体融合，选择性地检出融合子，对其产酶能力、产酒精能力进行测定，并对其遗传稳定性进行研究，最终确定筛选出一株各项性能较优的融合菌株R8。酒精发酵试验结果显示，菌株R8发酵菊粉的酒精得率为41.16%，原料糖分利用率为75.52%。     

不同荧光染料对苜蓿原生质体染色效果的研究

以紫花苜蓿品种甘农4号(Madicago sativa L.‘Gannong No. 4’)愈伤组织酶解的原生质体为材料,采用FDA、罗丹明B、罗丹明6G、吖啶橙和DAPI共5种荧光染料对原生质体进行染色效果比较,以期为原生质体活力测定、细胞核计数及原生质体融合过程的观察提供参考。结果表明:FDA、罗丹明B、罗丹明6G和吖啶橙均可使紫花苜蓿原生质体清晰染色,可用于细胞融合时亲本原生质体的标识。FDA是检测原生质体活力的理想染料;吖啶橙和DAPI可对细胞核进行特异性染色,可用于融合时细胞核的观察和计数,前者还可用于检测融合细胞的活力。通过对异源融合体的鉴别及其活力的测定,为摸索融合条件和融合细胞的培养提供了理论依据。     

匍匐翦股颖和狗牙根原生质体融合研究

以匍匐翦股颖克罗米和狗牙根新农1号为材料，通过愈伤诱导、继代和悬浮培养，进而细胞融合来探讨草坪草品种改良的新方法。结果表明：（1）匍匐翦股颖和狗牙根原生质体融合时酶解液的最佳组合为：1．5％纤维素酶、0．1％果胶酶、0．7M甘露醇，10h酶解时间，且酶解前应用高渗溶液预处理效果更佳；（2）细胞融合时，原生质体密度2×10^5个／mL，融合剂由30％的PEG4000、15mmol／LCaCl2·2H20、0．5mmol／L KH2PO4·H2O、0．5mol／L甘露醇组成，并调pH至7．5效果较好；（3）匍匐翦股颖和狗牙根细胞PEG融合率约为5％，以30min融合时间效果较好，产生的多核融合体少，杂种细胞多呈条形，具有较强的活力。     

鸡大肠杆菌异型外膜蛋白原生质体融合菌株的构建

以鸡大肠杆菌Ww1株(O78,OMP-3,AmpR,KS)和WD2株(O2,OMP-1,AmpS,KR)作为亲本菌株,采用溶菌酶-EDTA法制备原生质体,以PEG作为助溶剂,进行原生质体融合,得到4株双耐药融合菌株,融合菌株的形态、染色特性和生化特性均符合大肠杆菌的特性,且均能同时表达两个亲本菌株的外膜蛋白(OMP)抗原(OMP-3,OMP-1)和O抗原(O78,O2),表明两个亲本菌株发生了融合和染色体重组。经多次传代证明融合菌株是稳定的。     

草地早熟禾种间原生质体电融合条件的研究

为改良培育草地早熟禾(Poa pratensis)新品种,拟建立草地早熟禾商用品种与具有优良性状的野生早地早熟禾种间原生质体融合体系。采用电融合法,研究了电融合仪的电场条件和原生质体密度对草地早熟禾种间原生质体融合的影响。结果表明:在交流电场强度和频率分别为20 V/cm和2000k Hz时,原生质体可在较短的时间内形成2~4个原生质体串;最适于草地早熟禾种间原生质体融合的直流脉冲强度为200 V/cm、DC幅宽为40μs、直流脉冲次数为3次,原生质体密度为3×105个/m L,在此条件下,草地早熟禾种间原生质体总融合率和一对一融合率可分别达到25.39%和12.27%。     

苜蓿原生质体电融合适宜条件的筛选

为改良培育苜蓿(Medicago)新品种,拟建立苜蓿原生质体融合体系.通过电融合方法,使俄罗斯杂花苜蓿(M.varia)原生质体和甘农4号紫花苜蓿(M.sativa‘Gannong No.4’)原生质体进行非对称融合,获得了杂交细胞,研究不同失活处理条件、电场条件、原生质体密度对苜蓿原生质体融合的影响.结果表明:经过紫外灯辐射5min的俄罗斯杂花苜蓿原生质体和6 mmol· L-1 IOA处理的甘农4号紫花苜蓿原生质体,密度调至3×105～5×105个·mL-1,以交流电场强度15～20 V·cm-1、交流频率2000～2500 kHz,直流脉冲场强200～250 V·cm-1、脉冲宽幅40 μs、脉冲个数为3的条件为最适电融合条件,此时一对一有效融合率最高可达13.8％.     

微生物原生质体融合子筛选法的概述

本文对原生质体融合后融合子的几种筛选方法作了综述，便于选择合适的筛选方法从融合后的混合群体中选育目的融合子。     

牧草生物技术育种的概况与展望

本文对应用现代生物技术进行牧草育种的国内外概况及进展进行了综述。文中介绍了植物组织培养技术(包括微体繁殖及人工种子技术、幼胚培养、花药培养及单倍体利用、种质资源保存、体细胞无性系变异及离体选择)在牧草育种方面的应用,并对利用体细胞无性系变异选育抗病、抗除草剂及抗其它非生物逆境的牧草新品种作了重点论述。文中还介绍了原生质体培养、融合及异核体选择,以及基因工程中的T—DNA转化系统、病毒转化系统在牧草育种方面的应用。作者认为,在未来的几年中,利用体细胞无性系变异选育牧草抗逆新品种,以及将细胞工程技术与常规育种方法相结合以提高牧草育种效率,作为相对简单和非常有效的方法将得到广泛应用;原生质体融合和基因工程在牧草育种方面也会有较大发展。     

表达Omp1和Omp2的猪大肠埃希菌融合菌株R2的构建

为了构建猪大肠埃希菌融合菌株,在药敏试验和MIC试验的基础上,对猪大肠埃希菌HY2株(O101,Omp1)和GXA1株(O107,Omp2)进行交叉耐药培育.以HY2(O101,Omp1,Amir,Czls)和GXA1(O107,Omp2,Czlr,Amis)为亲本菌株,采用溶菌酶-EDTA法制备两亲本菌株原生质体,通过聚乙二醇(PEG)助融,进行原生质体融合,得到3株双耐药融合菌株.结果表明,猪大肠埃希菌原生质体制备和再生的最适条件是:溶菌酶浓度为200 U/mL,作用时间为25 min.筛选得到3株融合菌株R1、R2、R3,均可凝集两亲本的O抗原,其中,R2凝集性更好更稳定.进一步结合SDS-PAGE分析,显示融合菌株R2能较好的表达两亲本菌株形状,经多次传代仍能够稳定遗传.     

鸡大肠杆菌异型外膜蛋白原生质体融合菌株的构建

以鸡大肠杆菌Wwl株(O78，OMP-3．Amp^R，K^5)和WD2株(O2，OMP-1，Amp^5．K^R)作为亲本菌株，采用溶菌酶-EDTA法制备原生质体，以PEG作为助溶剂，进行原生质体融合，得到4株双耐药融合菌株，融合菌株的形态、染色特性和生化特性均符合大肠杆菌的特性，且均能同时表达两个亲本菌株的外膜蛋白(OMP)抗原(OMP-3，OMP-1)和O抗原(O78，O2)．表明两个亲本菌株发生了融合和染色体重组。经多次传代证明融合菌株是稳定的。     

兔红细胞融合条件的正交设计优化研究

细胞融合(cell fusion)又称细胞杂交,是在自发或人工诱导下,2个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞的过程。细胞融合是细胞工程研究中最常用的方法之一,这一技术已被广泛应用到许多相关学科及领域,是研究细胞和细胞之间相互关系、基因定位、细胞免疫、肿瘤等重要手段,为单克隆抗体和抗肿瘤疫苗的制备,动物、植物远缘杂交育种和微生物菌种选育等开拓了新途径[1-4]。     

酶解法制备酵母原生质体试验

原生质体融合是现代细胞工程中常用的技术,经过融合,不同原生质体的遗传物质会整合到一起,从而得到所需的具有特定遗传特性的细胞。获得原生质体是进行融合的关键步骤。本试验研究了酶解法制备酵母原生质体过程中酵母细胞破壁的最优条件。结果显示,用STC重悬OD_(600)=2的酵母菌量取得较好去膜效果的最佳条件为:酶解时间为30min,反应温度为37℃,酶量为40μg/mL。     

糙皮侧耳与酿酒酵母原生质体电融合条件的研究

为构建兼取木质素降解能力强和生长速度快的新型菌株,以糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体为亲本,采用双亲灭活标记方法,通过L16(45)正交试验研究交变电压、交变电场频率、脉冲场强、脉冲个数和脉冲间隔对两亲本电融合率的影响,利用拮抗试验和菌丝形态学比较方法对再生菌株进行筛选,RAPD分子标记方法对疑似融合株进行鉴定。结果表明:糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体的最佳融合条件为交变电压30 V,交变电场频率1100 k Hz,脉冲场强6 k V/cm,脉冲次数4个,脉冲间隔10μs,融合率达到4.396×10-5。筛选出的3株疑似融合株均为亲本原生质体融合产物。