BMP4在诱导骨髓间充质干细胞向生殖细胞分化中的作用

为了探讨骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)在诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向生殖细胞分化中的作用,将全骨髓培养法获取小鼠BMSCs,在含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM培养液中培养传代;取生长状态良好的第三代(P3)BMSCs,分别添加不同浓度(5、10、20、40和80ng·mL~(-1))的BMP4作为实验组,未添加BMP4为对照组。4d后,MTT法和台盼蓝染色检测细胞的增殖率和存活率,实时定量PCR(RT-qPCR)检测生殖细胞阶段特异性基因(Oct4、Dazl、Fragilis、Mvh、Nobox、Stella、Stra8和Gdf9)的表达。结果发现,BMP4浓度为5~20 ng·mL~(-1)时细胞存活率和增殖率最高;BMP4浓度为20 ng·mL~(-1)组Mvh、Fragilis、Oct-4、Dazl及Stella表达水平最高,均显著高于对照组(P0.05);Nobox表达水平则在BMP4浓度40ng·mL~(-1)组最高,且各浓度组均显著高于对照组(P0.05);各浓度BMP4组Stra8和Gdf9的表达水平均与对照组间无显著性差异(P0.05)。此结果提示,BMP4浓度在20 ng·mL~(-1)时,BMSCs的存活率、增殖率及原始生殖细胞特异性基因的表达最高;BMP4在诱导间充质干细胞向生殖细胞分化过程中起重要作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养方法的研究

[摘要〕目的研究在体外培养和纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法〔方法采用改良全骨髓贴壁 方法,分离和纯化3-4周的大鼠BMSCs,镜卜连续观察细胞的形态变化、流式细胞仪鉴定其表面抗原CD45和CD29 均表达情况〔结果原代培养的细胞呈圆形和梭形等,24 h后大部分细胞均贴壁〔8-10 d可达800Ic-90%融合,纯化 青传代周期为6-8 d〔流式细胞术鉴定表明C D45阴性,CD29阳性〔结论改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠 }''J骨髓间充质干细胞,是一种比较理想的分离培养方法、     

奶山羊骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

【目的】分离、培养奶山羊骨髓间质干细胞(MSCs),探讨其生物学特性,为心血管、神经退化,尤其是不育症患者的细胞移植治疗及相关细胞发育分化研究奠定基础。【方法】采用贴壁培养法进行MSCs的分离和培养,通过形态学观察、生长曲线测定、免疫细胞化学染色和RT-PCR技术等进行检测;并采用免疫细胞化学法对自发分化的细胞及定向诱导分化的神经样细胞、心肌样细胞、生殖样细胞进行检测,计算生殖样细胞的阳性率。【结果】分离得到的MSCs为成纤维样细胞,其增殖能力强,无致瘤性,已连续传代至22代;其表达胚胎干细胞(ESCs)的表面标记Oct4、Nanog、C-myc和TERT;MSCs形成类胚体自发分化的细胞表达3胚层特异标志基因AFP、β-ⅢTubulin和心肌α-actin;MSCs经β-巯基乙醇诱导,定向分化为表达Nestin和β-ⅢTubulin的早期神经样细胞,经5-氮胞苷(5-Aza)诱导,可定向分化为表达CT3及心肌α-actin的心肌样细胞,并出现肌管样结构,经维甲酸(RA)诱导,分化的细胞表达生殖细胞减数分裂前期的蛋白Vasa、Scp3和CD49f(α6整合素)等生殖细胞标记,其阳性率分别达到35.7%,24.0%和14.0%。【结论】自奶山羊骨髓分离得到MSCs,其具备间质干细胞的基本特性,并具有向神经细胞、心肌细胞、生殖细胞分化的潜能。     

山羊DAZL基因的克隆及在山羊骨髓间充质干细胞中的表达

本研究以山羊睾丸组织为材料,用RT-PCR法成功克隆了山羊DAZL基因的cDNA序列950 bp,测序和生物信息学分析表明,其含有885 bp的完整开放阅读框(ORF),编码295个氨基酸,与牛的氨基酸序列同源性为97.97%,编码产物含有典型的RNA识别基序RRM和DAZ重复基序;将山羊DAZL基因亚克隆至表达载体pEGFP-C1上,构建了山羊DAZL基因真核表达载体pEGFP-DAZL,采用脂质体法将其瞬时转染至山羊骨髓间充质干细胞(BMSC)中,通过荧光显微镜观察确定重组质粒在山羊BMSC内的表达和定位。     

阻断大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化与肿瘤发生相关性研究

【目的】分析骨髓间充质干细胞在体外定向分化为脂肪细胞的适宜诱导条件.阻断正常干细胞的分化过程,探讨肿瘤发生机理.【方法】利用贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),通过地塞米松、胰岛素和吲哚美辛联合诱导大鼠BMSCs,使其分化为脂肪细胞.在细胞分化过程中利用3-甲基胆蒽(3-MC)阻断大鼠BMSCs的分化过程.【结果】大鼠BMSCs分化试验显示:诱导30d后经油红O染色,细胞内可见脂肪细胞特有的红色脂滴沉淀,并且随着诱导时间的延长,油红O阳性细胞比例增加,脂滴增大,表明大鼠BMSCs已成功分化为脂肪细胞.大鼠BMSCs分化阻断试验显示:诱导30d后经油红O染色细胞内红色脂滴沉淀明显下降,表明阻断后的细胞具有脂肪细胞的特性,但分化不完全;形态学鉴定表现出:细胞接触抑制消失,细胞核异常,微核畸变率高,核型异常,表明阻断后的干细胞发生恶性转变.【结论】通过地塞米松、胰岛素和吲哚美辛的联合作用,诱导BMSCs成功向脂肪细胞分化.在BMSCs向脂肪细胞分化的过程中加入阻断剂3-MC,阻断其分化过程,表明干细胞分化过程受到阻断,细胞停止在分化的中间阶段,有转化成肿瘤细胞的趋势.     

猪骨髓基质细胞的分离培养及生物学特性研究

【目的】探讨猪骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的体外分离培养方法,并对猪BM-SCs的生物学特性进行研究,旨在建立一种稳定的体外培养猪BMSCs的方法体系。【方法】分离刚出生猪的BMSCs进行体外培养,传代,分别观察原代及传代细胞的形态和分化特征,绘制生长曲线,测定细胞分裂指数和贴壁率。采用细胞免疫化学染色对碱性磷酸酶(ALP)进行检测,以确定成骨分化能力,并通过免疫组化法对表面分子CD44、CD34进行染色鉴定。【结果】猪BMSCs体外生长良好,细胞接种后1~2 d生长缓慢,2~5 d进入对数生长期,6 d后细胞数开始下降;猪BMSCs在第4天分裂指数最高,约为10%;猪BMSCs传代后10 h贴壁率最高,达90%以上。猪BMSCs ALP染色阳性率达到75%;CD44阳性率可达98.83%,而CD34在第2代后消失;猪BMSCs在第5代以前生长形态稳定,培养至7代后,衰老现象严重。【结论】该方法分离的猪BMSCs早期生长性状稳定,增殖速度快,并获得了高纯度的猪BMSCs,据此建立了一种稳定的体外培养猪BMSCs的方法体系。     

Bone marrow colonies: stimulation in vitro by supernatant from incubated human blood cells

A substance which stimulates growth of granulocytic and mononuclear cell colonies from mouse and human bone marrow was produced by incubated human blood cells. It is resistant to heat and freezing and is not dialyzable. Intact irradiated and unirradiated cells had very little activity, and sonically disrupted cells had no activity. The addition of plasma or sonically disrupted cells to the cell supernatant decreased its activity.     

Stimulation of bone resorption in vitro by synthetic transforming growth factor-alpha

Experiments were conducted to test the hypothesis that tumor-derived transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) is responsible for the increased bone resorption and hypercalcemia seen in some malignant diseases. Homogeneous synthetic TGF-alpha prepared by the solid-phase synthesis method stimulated bone resorption directly in vitro in a concentration-dependent manner. Incubation times of 72 hours or more were required to stimulate resorption, which is similar to the time course of bone resorption by epidermal growth factor.     

MitoQ对犬骨髓间充质干细胞线粒体功能及抗氧化能力的影响

研究线粒体靶向抗氧化剂Mitoquinone(MitoQ)对犬骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的线粒体功能与抗氧化基因表达的作用,为进一步提高犬BMSCs的临床应用效率提供理论依据。以犬BMSCs为材料,添加MitoQ预处理48 h,采用荧光定量PCR、荧光探针等方法评估BMSCs线粒体功能以及抗氧化基因的表达水平。结果显示,随着传代次数的增加,BMSCs线粒体融合明显增强,线粒体分裂明显减弱;线粒体膜电位与ATP含量均显著下降;抗氧化基因的表达显著下调。添加MitoQ预处理后,BMSCs线粒体融合基因Mfn2的表达略有上调,且线粒体分裂基因Drp1和线粒体生物合成相关基因PGC-1α的表达显著上调;线粒体膜电位与ATP生成显著增加;抗氧化基因SOD1、SOD2、CAT和GSH-Px的表达显著上调。结果表明,MitoQ可改善犬BMSCs线粒体功能,增强BMSCs抗氧化能力。     

Heterozygous Beta thalassemia: balanced globin synthesis in bone marrow cells

In two patients with heterozygous beta thalassemia the rates of synthesis of the alpha and beta chains of hemoglobin were equal in nucleated red cell precursors, although beta chain synthesis was reduced in peripheral blood reticulocytes. This finding suggests a relative instability of beta chain messenger RNA in beta thalassemia.     

骨髓基质细胞诱导的神经干细胞移植对颞叶癫痫大鼠学习记忆障碍的改善作用

   探讨骨髓基质细胞诱导的神经干细胞移植至海人酸(kanic acid,KA)致痫大鼠海马后对学习记忆障碍的改善作用,从而为干细胞移植治疗癫痫提供理论依据.体外分离大鼠骨髓基质细胞,并在特定条件下培养、诱导分化为神经干细胞.在海马内注射KA建立大鼠癫痫模型,之后把诱导的神经干细胞移植至KA致痫鼠的海马内,用Morris水迷宫测试大鼠学习记忆能力,用PCR方法检测海马内NSE、c-fos和SEZ-6基因表达,采用Western blot技术检测海马内NSE、C-FOS和SEZ-6蛋白表达.结果显示:骨髓基质细胞成功诱导分化为神经干细胞,诱导分化的神经干细胞移植到脑内可明显改善大鼠的学习记忆障碍;移植组大鼠海马内NSE、c-fos和SEZ-6基因表达下调,NSE、C-FOS和SEZ-6蛋白表达亦下调,与阳性对照组及假移植组比较,差异显著(P<0 05).说明骨髓基质细胞诱导的神经干细胞移植至KA致痫大鼠海马后对学习记忆障碍有明显的改善作用,其机制可能与NSE、c-fos、SEZ-6基因和蛋白的表达下调相关.     

骨髓间充质干细胞移植在卵巢早衰小鼠卵巢功能重建中应用

探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植在卵巢早衰小鼠卵巢功能重建中的应用价值。通过一次性腹腔注射环磷酰胺和白消安建立小鼠卵巢早衰(POF)模型,并随机分为建模组、BMSCs移植组和空白对照组。移植组于建模14 d经尾静脉注射绿色荧光蛋白(GFP)转基因鼠BMSCs悬液(5×10~7个·mL~(-1)),每4 d重复1次,共5次;建模组和空白对照组注射等量生理盐水。观察建模后及BMSCs移植后小鼠的一般情况、血清FSH和E2水平、卵巢组织学变化以及GFP荧光信号在卵巢内的分布。结果发现,建模组小鼠食欲明显减退,活动减少,与空白对照组相比体重显著减轻(P0.05),FSH水平显著增高(P0.05),E2水平显著降低(P0.05),卵巢体积减小,间质纤维化严重,始基卵泡、生长卵泡和成熟卵泡数均显著减少(P0.05)。BMSCs移植后,移植组小鼠体重增加,食欲增强,活动增多;28 d后FSH浓度显著低于建模组(P0.05),E2浓度、始基卵泡、生长卵泡数及成熟卵泡数均显著高于建模组(P0.05),但各项指标仍与空白对照组间存在显著性差异;荧光显微镜下可见绿色荧光信号散在分布于卵泡周围。此结果提示,BMSCs可在小鼠损伤卵巢组织中定位存活,对卵巢组织结构及内分泌功能有修复作用。     

湖羊精原干细胞体外培养

研究了湖羊精原干细胞(SSCs)体外培养方法,湖羊睾丸曲精细管两步酶消化法制备细胞悬液,Percoll分离后比较SSCs纯化方法、FCS以及GDNF对SSCs体外培养与集落碱性磷酸酶(AKP)染色的影响。结果显示,虽然盘化法纯化的SSCs在集落形成时间与集落数上显著低于差速贴壁法(P<0.05),但是盘化法所得集落的AKP阳性率显著高于差速贴壁法(P<0.05);添加1% FCS的培养基可显著降低集落形成的时间,增加集落的数目与AKP阳性率(P<0.05),但集落形成时间与AKP阳性率在5%与1% FCS之间无显著变化(P>0.05);20 ng/mL GDNF处理组内集落数与AKP阳性率显著高于10 ng/mL GDNF(P<0.05),但集落形成时间与AKP阳性率与30～40 ng/mL GDNF的处理组无显著差别(P>0.05)。     

Hematopoietic histoincompatibility reactions by NK cells in vitro: model for genetic resistance to marrow grafts

In certain strains of mice, bone marrow grafts from parental donors fail to grow in first-generation hybrid mice. This "hybrid resistance" of nonsensitized F1 hybrid mice to the engraftment of parental hematopoietic transplants contradicts the classical laws of transplantation and is dependent on a radioresistant but immunogenetically specific effector mechanism. Studies in a new in vitro model reveal that committed hematopoietic precursors of parental origin can be inactivated by direct contact with natural killer-like splenic effectors from F1 mice. The reaction requires genetically restricted recognition, since only parental competitors syngeneic to the target bone marrow cells partially reversed this inactivation. Models of this type may be useful in studying the possible role of natural resistance in bone marrow transplantation in humans.     

58例急性白血病骨髓细胞免疫表型分析

目的 探讨急性白血病(AL)骨髓细胞免疫表型的特征及其临床意义.方法 采用CD45/SSC双参数散点图设门法对58例AL患者进行免疫表型分析.结果 在AML中髓系抗原CD117、CD33的阳性率分别为97.8％和93.3％,B-ALL主要表达CD19(100％)、HLA-DR(85.7％)、CD10(71.4％),CD20(42.9％),T-ALL主要表达CD7(100％)、CD3(80％)、CD5(60％)、CD2(60％),在伴髓系相关抗原的ALL (My+ALL)中CD33的阳性率为16.7％,CD41的阳性率为8.3％,CD117不表达.结论 采用CD45/SSC双参数散点图设门法对急性白血病进行免疫分型有一定的参考价值.     

Kinetic differences in unresponsiveness of thymus and bone marrow cells

Both thymus and bone marrow cells of adult mice can be made specifically unresponsive to human gamma globulin, but each cell population displays a distinct kinetic pattern for both the induction and spontaneous loss of the unresponsive state. These kinetics appear to be much slower in the bone marrow cells than in the thymus cells. In addition, the dose of deaggregated human gamma globulin needed to induce unresponsiveness in bone marrow cells is much greater than that needed to induce unresponsiveness in thymus cells. Apparently, unresponsiveness in only one cell type is sufficient for the tolerant state to be exhibited by the intact animal.