抗猪脂肪细胞膜单链抗体基因的构建及鉴定

应用噬菌体展示技术，从猪脂肪细胞免疫的小鼠脾细胞mRNA中构建出单链抗体(scFv)cDNA文库。cDNA文库克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E，转化E.coli TG1,通过噬菌体表面展示，用猪脂肪细胞对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行3轮亲和富集，筛选出了猪脂肪细胞膜scFv，为今后的应用奠定了基础。     

噬菌体抗体库技术及其研究策略

噬菌体抗体库技术是近年发展起来的将抗体基因与噬菌体外壳蛋白基因在其表面进行融合表达的技术。可用来构建噬菌体抗体库 ,并可从中制备各种基因工程抗体 ,为抗体的进一步开发应用提供了具有良好前景的新方法。     

鼠源性抗雄性特异性抗原噬菌体Fab抗体库的构建

利用雄鼠脾细胞免疫6~7周龄C57BL/6雌鼠,加强免疫后取脾细胞,TRIZOL法提取细胞总RNA,并逆转录合成cDNA第一条链。以其为模板,利用特异性Ig基因的引物PCR扩增出重链Fd片段和κ链基因,并将扩增出基因重组到噬质粒载体pComb3中,重组噬质粒转化大肠杆菌XL1-Blue中,分别构建κ链基因库和抗体Fab段基因库。分别经蓝白斑筛选,计算转化效率,通过PCR反应和双酶切反应鉴定抗体库的重组率,轻链、重链Fd段基因的重组率均为80%。抗体Fab段基因库经过辅助噬菌体VCSM13超感染,成功构建了鼠源性噬菌体Fab抗体库,并测定噬菌体抗体库的库容和滴度,结果分别为1.5×107,3.2×1011pfu/mL。对噬菌体抗体库的18个克隆进行ELISA分析,结果显示以雄鼠脾细胞作为抗原时,有9个克隆含有雄性特异性的噬菌体抗体,而以雄鼠睾丸细胞作为抗原时,有8个克隆与睾丸细胞呈现结合活性。噬菌体抗体库的构建为雄性特异性抗原的鼠源性噬菌体抗体Fab片段的筛选及其应用、雄性特异性抗原和抗体功能性分子基础的研究奠定了坚实基础。     

噬菌体抗体库技术及其在鸡单链抗体中的应用

抗体工程经历过多克隆血清，单克隆抗体阶段，现发展到了基因工程抗体时代。目前，抗体工程领域最突出的进展就是噬菌体抗体库技术的建立。噬菌体抗体库技术实际上是丝状噬菌体展示技术(phage display technology)与抗体组合文库技术(combinatorial immunoglobulin library     

抗诺氟沙星噬菌体单链抗体库的构建与筛选

应用噬菌体展示和重组抗体技术制备抗诺氟沙星(NFLX)单链抗体库,筛选获得抗NFLX高特异性、高亲和力的单链抗体scFv。将NFLX与BSA化学偶联获得的免疫源,免疫Balb/C小鼠,提取脾细胞RNA,反转录获得cDNA。以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的特异性引物,扩增获得VH基因和VL基因。通过SOE-PCR法将VH基因和VL基因通过柔性多肽Linker((Gly4Ser)3)拼接成VH-Linker-VL片段,酶切(sfiⅠ+NotⅠ)处理后,插入噬粒载体pCANTAB5E,并转化宿主菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建抗NFLX噬菌体单链抗体库。以包被抗原NFLX-OVA包被96孔板,亲和富集法,经三轮淘筛,间接Elisa初步检测重组scFv的特异性抗原结合活性。成功构建噬菌体单链抗体库,获得鼠源抗NFLX特异性的scFv,噬菌体中scFv插入率为90%,获得库容约为1.3×106的抗NFLX噬菌体单链抗体库,筛选得到5株抗NFLX的scFv。为运用噬菌体展示抗体技术制备特异性抗药物单抗及进一步建立药残检测新技术奠定了基础。     

噬菌体抗体库技术研究进展

噬菌体抗体库技术是利用PCR扩增出抗体的全套可变区基因,将抗体分子DNA片断如Fab或单链抗体(ScFv)与噬菌体外壳蛋白基因PⅢ或PVⅢ连接,使融合蛋白表达于噬菌体颗粒的表面,经过“吸附-洗脱-扩增”过程富集筛选特异性抗体。这一技术将抗体基因型和表型联系在一起,使识别抗原的能力和噬菌体的可扩增性统一起来,较好的模拟了体内的抗体产生的过程,成为一种高效的筛选体系。本文就噬菌体抗体库技术的原理、构建、筛选及其应用研究进展做一综述。     

抗猪流感噬菌体单链抗体库的构建与筛选

利用噬菌体展示技术构建猪流感病毒噬菌体抗体库,并筛选出猪流感高特异性、高亲和力的单链抗体(scFv)。以猪流感病毒免疫BALB/c小鼠,提取脾细胞总RNA,反转录后以cDNA为模板扩增获得VH基因和VL基因,并采用重叠延伸PCR(SOE-PCR),用柔性多肽Linker接头(Gly4Ser)按VH-Linker-VL方式将VH基因和VL基因拼接成scFv基因片段。将scFv基因和pCANTAB5E载体分别双酶切(SfiⅠ/NotⅠ)后连接,转化宿主菌TG1,经过辅助噬菌体M13K07拯救,构建噬菌体单链抗体库。以猪流感病毒为抗原包被96孔酶标板,经过3轮的亲和富集筛选,用Phage-ELISA鉴定阳性重组抗体。本研究成功构建出库容约为4×106cfu/mL抗猪流感病毒的单链抗体库,并筛选出4株特异性抗猪流感病毒的scFv抗体,能够与鼠源阳性多抗进行竞争结合猪流感病毒,为抗猪流感病毒转基因猪的研究奠定基础。     

天然鼠源噬菌体单链抗体库的构建

噬菌体展示技术是一项利用丝状噬菌体体外表达外源基因的新技术。它模拟动物体内抗体的形成过程，将抗体片段呈现在噬菌体表面，建成噬菌体抗体库，用与亲和层析相类似的原理，从抗体库中筛选出特异性噬菌体抗体，为制备人和动物用抗体提供了极为有效的手段。单链抗体是利用基因工程技术，由一个DNA片段(Linker)将抗体重链、     

抗庆大霉素噬菌体抗体库的构建和筛选

本研究使用噬菌体抗体库技术筛选针对庆大霉素（gentamicin）的单链抗体。以抗庆大霉素杂交瘤细胞株（2A3）为基因来源构建scFv基因,连接至pCANTAB5E噬菌粒载体,通过电击转化TG1（Escherichia coli TG1）构建了库容量为6.5×106噬菌体单链抗体库。抗庆大霉素噬菌体单链抗体库进行三轮富集筛选,通过Phage-ELISA技术成功筛选出了9个抗庆大霉素噬菌体阳性克隆,为开发新型残留检测用抗体奠定了基础。     

丝状噬菌体与噬菌体展示技术在抗体库中的应用

丝状噬菌体展示技术是将外源蛋白通过与丝状噬菌体外壳蛋白融合而表达于噬菌体颗粒的表面。自问世以来,它已被应用于生物科学的许多领域,其中最具吸引力的是抗体工程,利用该技术可构建不同的抗体库,从而获得针对不同抗原的抗体。本文着重介绍了丝状噬菌体的生物学特征...     

抗脂肪细胞膜蛋白抗体对猪胴体组成的调控

选择健康、胎次相近、体重为15kg的6周龄云南长撒二元杂交仔猪20头,公母各半,随机分为4组,每组5头。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组为试验组,于试验开始第一天各组每头猪分别腹腔内免疫抗脂肪细胞膜蛋白抗体10mL、20mL和30mL抗体;、Ⅳ为对照组,注射20mL非免疫血清。研究结果表明:抗脂肪细胞膜蛋白抗体可明显改善猪胴体组成。仔猪阶段(15kg)腹膜内免疫20mL、30mL抗体对猪胴体组成的改善效果最明显,脂肪率分别降低22.97%和22.25%(P<0.01);背膘厚分别减少18.85%和17.91%(P<0.05);板油重和花油重分别减少13.36%、13.70%和11.69%、11.03%(P<0.05);瘦肉率分别提高7.76%和7.62% (P<0.05);眼肌面积分别增加28.03%和24.21%(P<0.01)。     

抗脂肪细胞膜蛋白抗体对猪胴体组成的调控

选择健康、胎次相近、体重为15kg的6周龄云南长撒二元杂交仔猪20头,公母各半,随机分为4组,每组5头.Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组为试验组,于试验开始第一天各组每头猪分别腹腔内免疫抗脂肪细胞膜蛋白抗体10mL、20mL和30mL抗体;、Ⅳ为对照组,注射20mL非免疫血清.研究结果表明:抗脂肪细胞膜蛋白抗体可明显改善猪胴体组成.仔猪阶段(15kg)腹膜内免疫20mL、30mL抗体对猪胴体组成的改善效果最明显,脂肪率分别降低22.97%和22.25%(P＜0.01);背膘厚分别减少18.85%和17.91%(P＜0.05);板油重和花油重分别减少13.36%、13.70%和11.69%、11.03%(P＜0.05);瘦肉率分别提高7.76%和7.62%(P＜0.05);眼肌面积分别增加28.03%和24.21%(P＜0.01).     

猪三种细菌性病原单克隆抗体研究进展

单克隆抗体具有高度特异性、均质性及来源稳定并可大量生产的优点,成为传染性疾病研究、诊断和治疗的一个有力手段.随着单克隆抗体技术应用的深入,其在猪细菌性传染病的研究中发挥了一定的作用.论文简要介绍了单克隆抗体的技术原理,对猪链球菌病、猪胸膜肺炎和猪支原体肺炎三种常见猪细菌性传染病病原的单克隆抗体研究进展进行了概述,并对存...     

应用琼脂免疫扩散试验检测猪伪狂犬病抗体的研究

建立了ＡＧＩＤ用于猪伪狂犬病（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ,Ｐｒ）的诊断。对９８份被俭血清的ＡＧＩＤ结果与ＳＮ结果比较,当ＳＮ滴度大于１：８时两者的阳性检出符合率为１００％,ＳＮ滴度小于或等于１：８时,两者的阳性检出符合率为８７．５％,ＡＧＩＤ和ＳＮ总的阳性符合率为９４．４％,结果表明,ＡＧＩＤ对Ｐｒ可进行特异性诊断,流行病学调查和免疫动态监测。     

Serological Survey of Leptospiral Antibodies in Swine in Quebec

The prevalence of reactors to different serovars of Leptospira interrogans was determined in 117 swine premises in Quebec. A total of 926 sera were tested, using the microscopic agglutination method, against six leptospiral serovars: pomona, icterohaemorrhagiae, grippotyphosa, hardjo, canicola and ballum. Of the sera tested, 30 (3.2%) reacted to one of the three following serovars: pomona (2%), icterohaemorrhagiae (1.1%) and ballum (0.1%).     

猪瘟抗体消长规律动态研究

采用IHA实验方法监测猪瘟灭活疫苗免疫的猪抗体产生水平，并对仔猪母源抗体的消长规律进行了研究。结果表明仔猪母源抗体水平与母猪抗体水平呈正相关，其首次免疫抗体增长幅度与母源抗体呈负相关，但其抗体水平与免疫次数呈正相关。主动免疫的抗体效价与免疫剂量呈正相关，但与首免日龄无关。     

猪圆环病毒2型综合免疫及母源抗体评估研究

猪圆环病毒2型(PCV-2)参与引起的疾病症候群较为复杂,疫苗免疫效果受多种因素的影响。目前,疫苗的实际免疫效果及其对其他疫苗免疫效果的影响尚不十分清楚。针对这一问题,根据PCV-2病原和WH疫苗株特点,项目组设计了1组母猪、4组仔猪的免疫试验,并持续监测了免疫抗体及仔猪母源抗体变化情况,同时评估PCV-2免疫对其他疫苗(猪瘟、高致病性猪繁殖与呼吸综合征和猪O型口蹄疫)免疫效果的影响。结果显示,仔猪一次性免疫,不能达到理想的免疫效果,间隔2周~3周加强免疫,效果较好,保护抗体可持续到105日龄以上。母猪配种前和产仔前两次免疫,至仔猪断奶后,母猪抗体较高,所产仔猪,28日龄母源抗体较高。PCV-2疫苗免疫不影响上述3种疫苗的免疫效果。     

猪胸膜肺炎放线杆菌单克隆抗体的制备与鉴定

目的:建立抗血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌(APP-1)脂多糖(LPS)的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为今后建立该菌的免疫检测技术奠定基础。方法:腹腔注射APP-1标准株的甲醛固定抗原免疫BALB/c小鼠,ELISA检测血清中LPS抗体滴度并选择值最高的小鼠用于细胞融合,且于融合前3天加强免疫1次。常规方法进行融合,HT、HAT培养液选择培养融合后的细胞,ELISA检测细胞培养上清中的LPS抗体,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆传代。结果:获得2株稳定分泌抗APP-1LPS抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其小鼠腹水单克隆抗体效价132000～164000。结论:已成功建立2株稳定分泌抗APP-1LPS抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为今后建立该菌的免疫胶体金分型诊断技术奠定基础。     

脂肪细胞膜免疫对动物体脂含量的调控

降低动物体内脂肪含量,改善畜产品质量一直是动物研究人员研究的重点。近年发展起来的脂肪细胞膜免疫为降低动物体脂含量提供了一种安全而有效的方法。本文简要介绍了脂肪细胞膜免疫的两种免疫方法,并对其发展前景进行了展望。