红莲型水稻不育系和保持系线粒体基因组BAC文库的构建

以红莲型(HL)细胞质雄性不育系和保持系为材料, 构建了水稻线粒体基因组的BAC文库. 每个文库保存约2300个菌落, 外源插入片段介于9～25 kb之间. 以线粒体基因为探针对文库进行菌落原位杂交验证, 均筛选到了阳性克隆. 构建的两个文库为进一步研究水稻线粒体基因组的结构特点, 为克隆与红莲型水稻细胞质雄性不育相关的线粒体基     

陆地棉雄性不育恢复系18R的BAC文库构建

 18R雄性不育恢复系农艺性状优良,恢复性状稳定,对不育系能够100%恢复,是研究棉花三系互作的重要材料。本研究以pCC1BAC(BamHI)为载体,构建了18R的细菌人工染色体（BAC）文库。建立的文库包含139,200个BAC克隆。分析结果表明, BAC文库DNA插入片段为50～200 kb,91%的克隆插入片段为80～150 kb,平均102 kb,空载率<2%,覆盖6.3倍基因组。     

雷蒙德氏棉细菌人工染色体文库的构建

细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)文库是开展基因组测序、基因图位克隆、分子标记开发、物理作图等研究的重要基因组资源。本研究以二倍体野生棉雷蒙德氏棉(G.raimondii,D5)为材料,从成株期暗培养的黄化幼嫩叶片中得到纯净、完整和高质量的基因组DNA。经脉冲场凝胶电泳检测,所提取基因组DNA大于700 kb。经酶切、片段选择、连接转化,构建了雷蒙德氏棉的基因组BAC文库,文库共包含26 880个克隆,平均插入片段为127 kb,覆盖该棉种全基因组的3.7倍左右,克隆空载率小于5%。该文库的构建,为雷蒙德氏棉基因组物理图谱的构建、功能基因的定位与克隆、以及比较基因组研究提供了重要的基因组资源。     

樟树细菌人工染色体(BAC)文库的构建及质量检测

樟树(Cinnamomum camphora(L.)Presl)是一种具有材用、药用、油用、香料和生态环境建设等多种用途的樟科植物代表种。本研究以樟树幼嫩叶片为材料,通过提取高分子量核DNA(HMW-DNA)构建了第一个樟树细菌人工染色体(BAC)文库。该文库一共有36 960个克隆,平均插入片段为120 kb,覆盖樟树全基因组5.7倍左右,空载率小于1%。随机挑选10个BAC克隆进行末端测序说明BAC克隆为正常可用的单克隆。以此为基础,对樟树的BAC文库进行了测序,最终得到287.28 G的数据。樟树基因组BAC文库的构建,为樟树重要功能基因的克隆、功能验证、物理图谱的构建和全基因组测序等研究工作奠定了基础。     

甘蓝型油菜含MATH结构域基因BnMT-1干扰载体的构建及遗传转化

本研究以甘蓝型油菜湘油15种子不同发育时期抑制差减文库为研究对象,设计特异性引物扩增得到一个与油脂代谢相关,含MATH结构域的基因片段,长度为327bp,命名为BnMT-1。根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向插入到表达载体pFGC5941.nap查尔酮内含子两侧,经限制性内切酶酶切和质粒PCR扩增检测,证明已成功构建了干扰载体PP-MT。采用根癌农杆菌法将PP-MT干扰载体转入甘蓝型油菜中,对转化植株基因组DNA的PCR检测表明,干扰载体已转入到甘蓝型油菜中,共获得了两株转基因植株。这为进一步研究BnMT-1基因在甘蓝型油菜中的功能打下了基础。     

棉花细菌人工染色体文库构建的方法优化

以我国抗病、优质、丰产的棉花优良品种中棉所12号为材料,对棉花细菌人工染色体(BAC)文库构建过程中的一些关键技术,如plug的制备、DNA的部分消化、酶切片段的选择、插入片段与载体的摩尔比值、连接产物的浓缩等进行了研究,建立了构建棉花BAC文库的适宜方法体系。依照该方法初步构建了含有38000个克隆的棉花BAC文库。经检测,插入片段平均大小约为120kb,蓝斑率小于0.5%,空载率小于1%。插入片段与载体的最适摩尔比为1∶15,一次转化可以获得约2000个克隆,cfu·μl 1高达4。该方法为进一步构建中棉所12号多倍基因组的BAC文库、从而进行棉花基因组有关研究奠定了基础。     

长雄野生稻(Oryza longistaminata)全基因组Fosmid文库构建

长雄野生稻(O.longistaminata)起源于非洲,具有和亚洲栽培稻相同的AA基因组,是栽培稻改良的重要遗传资源。本研究构建了长雄野生稻全基因组fosmid文库,共获得33.6万克隆,文库的平均插入片段大小约为40kb,其中94.7%的克隆插入片段大小在30~50kb之间。挑取其中约11万克隆并保存,可覆盖10倍栽培稻基因组,对任意基因或序列的筛选概率达到了99.99%。将剩余的22万个克隆进行了末端配对测序,显示其有助于长雄野生稻全基因组测序的拼接。所构建的fosmid文库为筛选和克隆长雄野生稻的有利基因提供了研究材料。     

高抗黑胫病烤烟BAC文库的构建及分析

烟草是重要的模式植物。本研究利用pIndigoBAC536-S载体及Hind III限制性内切酶酶解烟草基因组DNA的方法,构建了烟草新品系14-60的细菌人工染色体(BAC)文库。该文库共包含414,720个克隆,保存在1080块384板中。随机挑选的120个烟草BAC克隆检测结果表明,外源插入片段大小为97.0～145.5 kb,平均约为123 kb,空载率极低(0),覆盖烟草基因组11倍。用烟草hem A基因、eIF4E-1基因、NtFT基因的特异引物进一步验证,该文库质量高、可用性强,为烟草黑胫病抗性基因的克隆以及其他重要农艺性状和品质性状等功能基因克隆研究提供了基础资源。     

白粉菌诱导的番茄叶片AD-cDNA文库的构建及初步分析

为了研究番茄白粉菌与番茄相互作用的分子机制,以白粉菌诱导的番茄叶片为材料,利用SMART技术构建了番茄的AD-c DNA文库。该文库总库容量为3.77×1010cfu,重组率达到96%,插入片段长400~2 000 bp,平均长度约为1 000 bp。随机挑取50个克隆进行测序,利用生物信息学软件进行初步分析,表明获得的文库质量较高。     

长片段小麦细菌人工染色体DNA亚克隆文库的构建

为了加快小麦基因组的测序,以Langdon库中的一个BAC克隆(BAC790O10)为材料,利用HydroShear DNA剪切仪将其打断,产生许多大小不同的DNA随机片段,回收其中3～5 kb的片段,并将这些片段随机克隆入TOPO载体,构建了适合于鸟枪法测序的亚克隆文库.     

Construction and characterization of a BAC library of soybean

We have constructed a soybean (Glycine max (L.) Merrill) bacterial artificial chromosome (BAC) library from green leaf protoplasts of the cultivar, Misuzudaizu. The library contains 53,760 clones with an average insert size of 116 kb. About 2.9% chloroplast DNA origin was revealed by PCR and colony hybridization. Apart from 2.8% clones having no insert, this library represents 5.2 genome equivalents. With this genome coverage, the probability of having any DNA sequence represented in the library is higher than 99.5%. Three-dimensional pools of the BAC library in combination with the use of a high efficiency genome scanning (HEGS) electrophoresis facilitate rapid and efficient PCR-based screening. An average of five positive clones were identified after screening the BAC library with SSR and STS markers. BAC-end walking was performed for three SSR associated BACs. This library will provide a good resource for positional cloning of agronomically and biologically important QTL genes that Misuzudaizu possesses.     

Construction and characterization of a BAC library for sunflower (Helianthus annuus L.)

A bacterial artificial chromosome (BAC) library was constructed using the sunflower (Helianthus annuus L.) restorer line RHA325, which carries the restorer gene Rf1 and the Pl2-gene conferring resistance to downy mildew. High molecular weight DNA was prepared from nuclei using leaf material from two-week old seedlings. The library was constructed using the HindIII site of pBeloBAC11. The current BAC library comprises 104,736 clones. The insert size of the clones varied between 20 and 270 kb, with an average insert size of 60 kb. The whole 1.9× sunflower BAC library was spotted in duplicate on four high-density filters, each carrying 55,296 clones. The content of organellar DNA, which was estimated by colony hybridisation against the mitochondrial probe coxI and the chloroplast probe rbcL, proved to be less than 0.03 and 0.1%, respectively. BAC pools, allowing PCR-based screening, were made and used to identify positive BAC clones for the markers OP-K13_454, closely linked to the restorer gene Rf1. The PCR-based screening was verified by the results obtained for this marker by colony hybridisation.     

中国水仙BAC文库构建的研究

为更深入地挖掘中国水仙的基因组信息,筛选与中国水仙品质相关的功能基因,以中国水仙品种‘金盏银台’的黄化叶片为材料,采用改良Zhang法获得高分子量核DNA,经酶切、连接和转化,首次构建了中国水仙基因组BAC文库。结果表明,采用改良zhang法获取的核DNA分子量大于1 Mb,适合BAC文库的构建;优化了连接、转化体系,发现载体和插入片段的摩尔比为5:1时,连接、转化效率最高;经检测,该文库包括69120个克隆,插入片段的平均大小约87 kb,空载率小于1%,大约50%的克隆大小在80~90 kb之间;Southern blot结果表明该文库未受到细胞器DNA的污染。     

棉花抗黄萎病相关基因筛选与亚克隆文库构建

以黄萎病菌诱导下差异表达的棉花抗病相关基因片段PR8为探针,利用杂交方法,对优质、抗病海岛棉品种Pima90-53 BAC文库进行筛选。从30 336个BAC克隆中筛选到含有PR8基因片段的4个阳性克隆,分别为127K13,128D14,169J3和178C5。用Sau3AI对其中的169J3克隆进行酶切,回收2~4 kb的DNA片段并连接到载体pUC118BamHI-BAP上,构建了含有该基因片段的亚克隆文库,共含有4 224个克隆。经电泳检测,插入片段在1~3 kb,平均为2 kb。该亚克隆文库的构建为克隆PR8基因奠定了基础。     

高纤维强力棉花种质系苏远7235 BAC文库的构建

苏远7235是我国利用异常棉等多个野生种创造的高纤维强力棉花种质系,是开展棉花纤维品质研究的重要材料。本研究以pIndigoBAC-5(HindIII-cloning ready)为载体,构建了苏远7235的细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)文库,该文库包含30336个BAC克隆。分析结果表明,重组克隆苏远7235 DNA插入片段为50-140 kb,平均120 kb,空载率2.1%,89.6%的克隆插入片段大于100 kb。     

干旱胁迫下油菜消减文库的构建及分析

以抗旱能力强的油菜Holiday为材料,以干旱处理的样品为Tester,正常水分管理(对照)为Driver构建干旱诱导的甘蓝型油菜叶片正向抑制性消减杂交 (SSH)文库。随机挑选24个阳性克隆进行PCR验证,结果表明,其中23个含有插入片段,平均大小在750 bp左右。将96个阳性克隆测序,并拼接和去除冗余,获得重叠群4条,单拷贝序列82条,平均长度为542 bp。经BlastX程序比对蛋白数据库发现,11条EST没有找到同源性序列,75条有同源序列。KOBAS分析发现,28条EST被定位到67条代谢途径中,根据P值推测,光合中的碳固定、有氧呼吸的电子供体、氮代谢、乙醛酸和二羧酸代谢在植物干旱胁迫中发挥着极为重要的作用。这些EST涉及到的功能中所占比例最大的分别是细胞器(58.82%)、结合(30.77%)和新陈代谢过程(43.72%),表明甘蓝型油菜面对干旱胁迫时,细胞器组件上的功能发挥了重要的作用,结合基因和蛋白被激活,加强了新陈代谢。     

六个甘蓝型油菜油酸脱氢酶（FAD2）假基因的克隆和分析

以甘蓝型油菜湘油15为材料,采用PCR方法克隆并分析了56个FAD2基因克隆和47个FAD2基因cDNA克隆,从中发现6个新的FAD2基因拷贝。它们与公布的甘蓝型油菜FAD2基因(AY577313)具有87%以上的同源性,没有内含子,在开放阅读框中存在1~12个终止密码子,其中有2个拷贝具有转录功能。将这6个FAD2基因拷贝在酿酒酵母中进行体内表达实验,通过气相色谱检测脂肪酸组成证明其不具备油酸脱氢酶功能,与对照相比,也没有改变酵母体内脂肪酸组成。由此推测这6个FAD2基因拷贝为假基因。     

普通小麦品种小偃54中α/β-醇溶蛋白编码基因的克隆与序列分析

醇溶蛋白是小麦籽粒贮藏蛋白的重要组分,其组成与含量对小麦加工品质具有重要影响。本研究建立了利用PCR从普通小麦基因组BAC文库中筛选含有α/β-醇溶蛋白基因序列BAC克隆的方法,并获得9个不同的含有α/β-醇溶蛋白基因的BAC克隆。从其中鉴定出17个α/β-醇溶蛋白基因,其编码区序列长度为852~957 bp。12个序列在编码区内存在提前终止密码子,推测为假基因。其他5个成员(Gli-Xy54-1、Gli-Xy54-2、Gli-Xy54-3、Gli-Xy54-7和Gli-Xy54-13)分别编码291、310、311、287和317个氨基酸残基,都具有α/β-醇溶蛋白一级结构的典型特征。根据推导的氨基酸序列中乳糜泻病诱发因子的分布情况及多聚谷氨酰胺重复区的长度差异,推测Gli-Xy54-7可能定位于6A染色体,Gli-Xy54-2、Gli-Xy54-3和Gli-Xy54-13可能定位于6B染色体,Gli-Xy54-1可能定位于6D染色体。基因聚类分析支持了上述推论。这是第一次从普通小麦中筛选到包含α/β-醇溶蛋白基因的BAC克隆,并从中得到目标基因全长,对进一步研究普通小麦基因组中α/β-醇溶蛋白编码基因的组成、表达与功能有较好的参考价值。     

柑桔线虫抗性主基因座Tyr1的特异标记开发与遗传作图改进(英文)

本文利用先期从BAC文库获得的NBS-LRR类候选抗病基因克隆序列Pt8a和Pt9a,进一步开发与柑桔线虫抗性主效基因位点Tyr1连锁的分子标记。以Pt8a和Pt9a序列作探针,通过高密度克隆印迹杂交,从BAC文库筛选出200个以上的阳性克隆,以阳性克隆插入序列设计引物,对柑桔抗线虫材料和感线虫材料开展以PCR扩增为基础的集群分离分析,发现一部分克隆序列与柑桔线虫抗性主效基因位点Tyr1紧密连锁;再通过染色体步行测序,分别从3个克隆（7A4,4L17和29F20）获得3个完整的NBS-LRR类候选抗病基因序列。从此类序列开发更高特异性的分子标记,并在利用原有分子标记的基础上,对柑桔线虫抗性杂交后代群体（9145 family）构建较高密度的遗传图谱;同时,将新开发的分子标记应用于柑桔衰退病抗性杂交后代群体（9401 family）,以初步估算柑桔线虫抗性主效基因位点Tyr]与柑桔衰退病抗性基因Ctv的遗传距离。     

Cloning, genetic and physical mapping of resistance gene analogs in barley (Hordeum vulgare L.)

The majority of verified plant disease resistance genes isolated to date belong to the NBS‐LRR class, encoding proteins with a predicted nucleotide binding site (NBS) and a leucine‐rich repeat (LRR) region. Using degenerate primers, designed from the conserved motifs of the NBS region in tobacco N and Arabidopsis RPS2 genes, we isolated 190 resistance gene analogs (RGA) clones from barley genomic DNA. A total of 13 single‐ and low‐copy RGAs were genetically mapped onto chromosomes 1H–7H (except 5H) using three barley double haploid (DH) mapping populations: Steptoe × Morex, Harrington × TR306 and LUGC × Bowman. Sequence analysis of the RGAs showed that they are members of a diverse group. As a result of BLAST searches, one RGA proved unique as it did not detect any significant hit. Another RGA is putatively functional, because it detected several barley expressed sequence tag (EST) matches. To physically map the RGAs, 13 sequences were used to screen a 6.3 × cv. ‘Morex’ bacterial artificial chromosome (BAC) library. After fingerprint analysis, eight contigs were constructed incorporating 62 BAC clones. These BAC contigs are of great value for positional cloning of disease resistance genes, because they span the regions where various barley R genes have been genetically mapped.