10株桑黄菌基于rDNA ITS序列的分子鉴定

建立桑黄菌的分类学基本框架,可为桑黄菌的开发利用奠定基础。利用rDNAITS序列分析技术,在分子水平上对采自秦巴山区的9株野生桑黄菌和1株实用桑黄菌进行分类鉴定。以真菌rDNAITS序列分析中的通用引物ITS1和ITS4,分别对10个菌株的基因组DNA模板PCR扩增出目的片段,将扩增产物割胶纯化、克隆并测序,获得10个菌株的rDNAITS序列,并结合GenBank中已登录桑黄菌的rDNAITS同源序列,应用MEGA4.1软件和Neighbor-Joining法,分别计算遗传距离及构建系统发育进化树分析亲缘关系。结果表明10株桑黄菌均为针层孔菌属(Phellinus),其中:S1、S4、S6、Rh、Sc菌株初步鉴定为鲍氏针层孔菌(Phellinus baumii);S2、S3、S5、S7、Gy菌株初步鉴定为裂蹄木层孔菌(Phellinus linteus)。     

ITS1 rDNA序列用于瘤胃原虫研究可行性的探讨

文章主要探讨瘤胃原虫rDNA序列的ITS1区段用于其群体研究的可行性和有效性。试验1由3只瘘管山羊提供瘤胃液、以不同结构碳水化合物底物(可溶性淀粉/滤纸纤维:A,100:0、B,70:30、C,50:50、D,30:70、E,0:100)进行体外培养;试验2以4只瘘管山羊为试验动物,以A(鱼粉)、B(羽毛粉)、C(玉米蛋白粉)和D(豆粕)等蛋白质饲料配制的4种等氮日粮进行4×4拉丁方试验,采用ITS1rDNA序列的遗传指纹检测及细胞计数技术研究原虫群体组成的变化。遗传指纹检测结果表明,在试验1不同碳水化合物结构底物培养条件下或在试验2不同蛋白日粮条件下,原虫群体组成都发生了变化。细胞计数的研究结果与之一致。依据本研究结果可见,ITS1rDNA序列是原虫研究的良好素材。     

白僵菌菌株的ITS序列鉴定

球孢白僵菌是世界范围内害虫生物防治中推广和应用最为成功的昆虫病原真菌之一。我国东北地区,尤其是吉林省多年以来一直利用白僵菌进行玉米螟防治,取得良好的经济效益、生态效益和社会效益。利用分子生物学技术,通过白僵菌ITS序列快速进行种的鉴定,明确菌株的分类地位,为进一步的研究提供准确的研究材料。研究结果表明,8个白僵菌菌株都为球孢白僵菌菌株,其同源性达到99%。     

狼尾草属牧草rDNA的ITS序列分析

对来自福建、江苏、海南等15份狼尾草属牧草的5.8SrDNA、ITS1及ITS2片段进行克隆及序列分析,并登录于GenBank数据库,采用DNAMAN、CLUSTALX、MEGA等软件分析其遗传关系聚类图。结果显示,克隆的目的片段长度为573～586bp,聚类结果总体能较好地反应狼尾草属牧草之间的遗传距离,其中杂交狼尾草和细茎杂交狼尾草可能存在着同种异名的现象。     

狼尾草属牧草rDNA的ITS序列分析

 对来自福建、江苏、海南等１５份狼尾草属牧草的５．８ＳｒＤＮＡ、ＩＴＳ１及ＩＴＳ２片段进行克隆及序列分析,并登录于ＧｅｎＢａｎｋ数据库,采用ＤＮＡＭＡＮ、ＣＬＵＳＴＡＬＸ、ＭＥＧＡ 等软件分析其遗传关系聚类图。结果显示,克隆的目的片段长度为５７３～５８６ｂｐ,聚类结果总体能较好地反应狼尾草属牧草之间的遗传距离,其中杂交狼尾草和细茎杂交狼尾草可能存在着同种异名的现象。     

猫锡兰钩虫rDNA ITS1的扩增及分子鉴定

为了对从猫粪便样品中分离的钩虫虫卵进行种类鉴定,本研究提取该虫卵基因组DNA,根据核糖体内转录间区1(ITS1)的保守序列设计钩虫属引物,通过PCR扩增、克隆、测序、相关软件分析,建立系统进化树,从分子水平对其进行种类鉴定.结果表明扩增出404 bp DNA片段,测序结果显示该片段包括309 bp ITS1和95 bp的5.8S rDNA,与NCBI中登录的序列进行比对以及采用Clustal X和MEGA5.1软件分析确定该钩虫为锡兰钩虫.这是我国首次建立钩虫的分子鉴定方法,也是40年来再次发现猫源锡兰钩虫,为锡兰钩虫分子生物学和分子流行病学研究奠定了基础.     

甘肃甘南野生羊肚菌rDNA的ITS序列分析

根据形态学特征挑选了7株采自甘肃甘南境内的野生羊肚菌,应用rDNA-ITS序列进行了比对技术分析。结果表明,7株野生羊肚菌归属为4个种：粗柄羊肚菌Morchellav crassipes、羊肚菌M.esculenta、黑脉羊肚菌M.angusticeps和高羊肚菌M.elata。根据分子系统树发现,粗柄羊肚菌和羊肚菌属于黄羊肚菌类群,而黑脉羊肚菌和高羊肚菌属于黑羊肚菌类群。     

棕熊蛔虫ITS rDNA的PCR扩增与序列分析

目的以核糖体DNA（rDNA）的第一与第二内转录间隔区序列（ITS-1及ITS-2）鉴定从广州动物园棕熊分离的蛔虫种类。方法应用PCR方法以保守引物NC5和NC2扩增蛔虫样本的ITS及5．8SrDNA序列,将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-TEsay载体,用菌落PCR及酶切鉴定阳性菌落,对阳性菌落进行测序,并与Gen．Bank“公布的人蛔虫（Ascaris lumbricoides）、猪蛔虫（Ascariis suum）、浣熊贝利斯蛔虫（Baylisascaris procyonh）及狮弓蛔虫（Toxascaris leonina）ITS序列比较。结果从棕熊分离的2个蛔虫样本的ITS及5．8SrDNA总长为859—861bp,种内相似性为99．7％,与GenBank^TM公布的人蛔虫、猪蛔虫、浣熊贝利斯蛔虫及狮弓蛔虫的相似性分别为84．6％、84．5％、89．3％及72．3％,序列差异明显。结论棕熊蛔虫不同于上述种类蛔虫,可能为Baylisacaris transfuga.     

异形同刺线虫形态学鉴定及基于核糖体ITS序列分子进化分析研究

对采自黑龙江省某鹅场莱茵鹅盲肠内的线虫进行形态学鉴定,然后采取PCR方法扩增虫体核糖体ITS序列,进行序列分析并以ITS序列为标记基因构建系统发生树,分析该线虫与其他虫体的进化关系。结果表明,所分离的虫体为异形同刺线虫(Ganguleterakis dispar),该线虫ITS序列全长为957 bp,其中ITS-1,5.8S和ITS-2大小分别为424 bp,157 bp和376 bp。应用BI,MP,NJ 3种方法构建系统发生树结果相同,在尖尾目线虫的分支中,本研究的5条异形同刺线虫聚集在一起,与同科的鸡异刺线虫亲缘关系较海绵异刺线虫和Heterakis dahomensis接近。该结果为禽类异形同刺线虫病的分子鉴别诊断方法提供了参考。     

鹅蛔虫ITS rDNA的分子特征及种类分析

为探究从广东省清远的鹅体内采集的蛔虫(Ascaridia anseris)的种类,对临床采集的鹅蛔虫样品,在形态观察的基础上,用保守引物NC5和NC2扩增鹅蛔虫的ITS rDNA基因片段,将扩增产物经克隆测序后,获得大小为1 009bp的鹅蛔虫ITS rDNA基因序列(GenBank登录号为KC905082)。序列比对和系统进化分析表明,鹅蛔虫5.8SrRNA基因与GenBank收录的鸡蛔虫(登录号为AJ001508)同源性为96%,而与不同地理株的鸽蛔虫的同源性在91%~96%之间;禽蛔科的鸡蛔虫、鸽蛔虫和鹅蛔虫同一进化分支,鹅蛔虫、鸡蛔虫和鸽蛔虫处于各自的独立进化分支。上述证明,鹅蛔虫是不同于鸽蛔虫的一个独立有效种,在系统发生关系上与鸡蛔虫更亲近。     

蛇蛔虫ITS及5.8S rDNA的克隆及进化分析

利用聚合酶链反应（PCR）扩增蛇蛔虫rDNA的ITS-1、5.8S及ITS-2片段,将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,重组质粒通过菌落PCR鉴定后,对阳性菌落进行序列测定并进行序列分析。结果显示,所获得的蛇蛔虫ITS及5.8SrDNA序列总长为846bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS-1、5.8S及ITS-2序列。本研究系国际上首次报道蛇蛔虫的ITS序列,从而为蛇蛔虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查奠定了基础。     

双盲口线虫ITS rDNA的PCR扩增及序列分析

以从波兰大西洋鳕体内采集的8条双盲口线虫样品为研究对象,利用保守引物通过PCR扩增其核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacers,ITS)ITS-1 rDNA、5.8S rDNA、ITS-2 rDNA后,将扩增片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体,经PCR及酶切鉴定后,对获得的阳性质粒DNA进行序列分析。结果显示,所获得的ITS rDNA及5.8S rDNA序列总长存在一定差异,ITS rDNA为885～927 bp,包含18S rDNA、28S rDNA部分序列及ITS-1 rDNA(441～449 bp)、5.8S rDNA(155 bp)和ITS-2rDNA(266 bp)全部序列。结果表明,双盲口线虫ITS序列种内相对保守(ITS-1 rDNA:0～2.2%;ITS-2 rDNA:0～3.4%),而种间差异较大(ITS-1 rDNA20%;ITS-2 rDNA35%),可作为种间遗传变异研究的标记。本研究结果为双盲口线虫的分子鉴定、种群遗传学以及双盲口线虫病的进一步研究提供了参考和依据。     

鸡蛔虫ITS rDNA的PCR扩增克隆及序列分析

鸡蛔虫(Ascaridia galli)寄生于鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡等鸟禽类的小肠,偶见于嗉囊、胃和食道.鸡蛔虫病分布于全世界和全国各地,在我国具有分布广、感染率高、感染强度较高的特点[1].     

华南虎蛔虫ITS及5.8S rDNA序列扩增及分析

以从我国广州动物园华南虎肠道中采集的2条蛔虫作为研究对象,利用核糖体DNA(rDNA)中转录间隔区序列(ITS)的遗传标记特点,用保守引物NC5和NC2对提取的DNA进行PCR扩增,经胶回收纯化后,连接到pGEM-TEasy载体上,然后转化并鉴定出阳性菌落。对菌落进行PCR扩增并测序,将测序结果与GenBank公布的相关蛔虫ITS序列进行比对分析。结果显示,来自广州动物园的2条蛔虫ITS及5.8S rDNA序列总长均为858 bp,序列相似性为100%,与狮弓蛔虫(Toxascaris leonina)、猫弓首蛔虫(Toxocara cati)、犬弓蛔虫(T.canis)的ITS-1序列相似性分别为97%、81%、82%;5.8S序列的相似性分别为100%、98%、99%;ITS-2序列与GenBank上公布的狮弓蛔虫序列相似性94.6%,与猫弓首蛔虫、犬弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫(T.malaysiensis)序列相似性均小于60%。研究结果证明此次分离的华南虎蛔虫属于狮弓蛔虫。     

小熊猫蛔虫ITS及5.8S rDNA序列的克隆与分析

以广州动物园小熊猫体内分离出的蛔虫为研究对象,运用PCR方法,以保守引物NC5和NC2扩增其核糖体DNA（rDNA）的内转录间隔区（ITS）和5.8S序列,并对扩增后的片段进行纯化、克隆至pGEM-Teasy载体、转化、测序和序列分析,以鉴定小熊猫蛔虫的种类。结果显示2条蛔虫样品的ITS及5.8S rDNA序列基本一致,总长为913 bp,样品间序列相似性为99.7%。将序列与GenBank^TM公布的相关序列进行比较分析,结果显示2条蛔虫的ITS及5.8S序列与黑熊横走贝蛔虫（Baylisascaris transfuga注册号AB571304）相似性分别为98.1%、98.4%,与大熊猫西氏贝蛔虫（Baylisascaris schroederi注册号JN210912）相似性分别为96.9%、97.1%,与猪蛔虫（Ascaris suum注册号AB571302）相似性分别为89.9%、90.1%,与人蛔虫（Ascaris lumbricoides注册号AB571296）相似性分别为89.8%、90.1%,ITS-1序列与浣熊贝蛔虫（Baylisascaris procyonis注册号AB053230）相似性分别为92.0%、92.3%。研究结果表明小熊猫体内分离的蛔虫可能为贝蛔属蛔虫,从而为蛔虫的进一步分类、鉴定和遗传变异研究奠定了基础。     

两种鞭虫ITS序列的比较与进化分析

对猪鞭虫(Trichuris suis)和无色鞭虫(Trichuris discolor)的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列进行扩增、克隆和比较分析;以ITS序列为基因标记采取ML法构建系统发生树,确定它们间的亲缘关系。结果猪鞭虫ITS序列长1 397 bp,其中ITS1和ITS2序列长度分别为658 bp和585 bp。无色鞭虫ITS序列长1 404 bp,其中ITS1和ITS2序列长度分别为786 bp和455 bp,两者的ITS1与ITS2序列的同源性分别为55.8%和65.0%;进化分析显示两种鞭虫处于不同分支上,分别与Gen Bank上发表猪鞭虫和无色鞭虫序列聚集在一起,显示两者亲缘关系较远。     

小耳花猪蛔虫ITS及5.8S rDNA序列扩增与分析

以分离自小耳花猪消化道内的蛔虫为研究对象,提取虫体的DNA片断,然后用引物对核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区ITS-1、ITS-2及5.8S序列进行PCR扩增。结果显示,目的片段ITS总长为1441 bp,2个不同样品之间的I TS序列没有差异。通过BLAST检索,与相关蛔虫I TS序列进行比较,发现与拜林蛔线虫(Bayl i sascari s t ransfuga)、猪蛔虫(Ascari s suum)和人蛔虫(Ascari s l umbri coi des)的ITS序列相似性分别为88%、98%和86%,与其他蛔虫的相似性均小于90%。     

基于ITS序列的捻转血矛线虫系统进化分析

为分析捻转血矛线虫ITS序列的变异与虫株特性之间的关系,对捻转血矛线虫不同药物抗性虫株(苯并咪唑类药物抗性虫株、伊维菌素抗性虫株、莫西菌素抗性虫株、药物敏感虫株)、不同宿主来源虫株(长颈鹿、牛、绵羊、山羊、牦牛)和不同地理位置(中国、美国、意大利、法国、也门、马来西亚、澳大利亚)的分离株,以及毛圆科的其他线虫的ITS序列进行了分析。结果发现捻转血矛线虫与毛圆科其他线虫的ITS-2基因的相似性高,基于该基因建立的系统进化树可以很好地区分毛圆科不同属的线虫;捻转血矛线虫的抗药性特点与其ITS-1基因的变异进化关系不大;不同地理位置的捻转血矛线虫分离株的ITS-2基因变异很小;从野生动物长颈鹿体内分离的捻转血矛线虫的ITS-1基因与家养反刍动物分离株的差异较明显。研究结果表明捻转血矛线虫ITS序列在种内相对保守,不同虫株间变异较小,在毛圆科线虫的分子分类中具有一定意义。     

鸡NRAMP1蛋白序列特征、分子进化与突变分析

为解析鸡天然抗性相关巨噬蛋白1(Natural-resistance-associated macrophage protein 1,NRAMP1)223位Arg突变为Gln对蛋白质结构和理化性质的影响,试验系统分析了鸡NRAMP1蛋白质结构特征,重点比较鸡NRAMP1 223位Arg（抗性）和Gln（易感）的蛋白质理化性质和结构差异,并分析略阳乌鸡NRAMP1基因该位点的多态性。结果表明,NRAMP1蛋白质保守性较高,鸡和人NRAMP1氨基酸序列相似度达68%,以鸡NRAMP1的第223位氨基酸为参考,其他物种该位点均为碱性氨基酸（Arg、Lys、His）;鸡NRAMP1第2 454位G突变为A,223位Arg变成Gln,其理化性质和二、三级结构均发生变化,该位点附近的β-转角变为α-螺旋。略阳乌鸡NRAMP1基因该位点的GG基因型频率为67.1%,GA频率30.1%,AA频率2.7%。研究结果证实鸡NRAMP1蛋白质223位突变改变其结构和理化性质,可能与该蛋白抗感染能力相关。