家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂Bmserpin 6的原核表达及对酚氧化酶原活性和抗菌肽表达的调控作用

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)对昆虫的免疫反应起重要调节作用。根据家蚕基因组数据库序列设计引物,从家蚕幼虫血细胞中克隆了Bmserpin6的编码基因,并构建重组表达载体,在大肠杆菌中成功表达了重组Bmserpin6蛋白。将纯化的重组Bmserpin6注射家蚕5龄幼虫后6 h提取家蚕血液制备血清,检测血清样品中的酚氧化酶原活性显著下降(P0.05)。体腔注射重组Bmserpin6后的家蚕5龄幼虫再通过微球菌诱导蚕体内抗菌肽gloverin2基因的表达,结果显示幼虫脂肪体和血细胞中的gloverin2基因表达显著下调(P0.05)。依据上述结果推测:体外表达的重组Bmserpin6可以调节蚕体内2个重要的免疫途径,即抑制蚕体酚氧化酶原的激活和外源细菌诱导的蚕体抗菌肽的产生。     

3种微生物及其胞壁物质体外诱导家蚕血液黑化反应的观察

分别将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白僵菌及其细胞壁物质脂多糖、肽聚糖和甘露聚糖与家蚕血液在毛细针管中混合,体外观察外源物诱导家蚕血液黑化反应的免疫防御作用。结果表明3种微生物及其胞壁物质均能诱导家蚕血液发生黑化反应,与家蚕血液混合后的大肠杆菌数目随混合时间延长及血液黑化程度加剧而下降。说明家蚕血液黑化反应与昆虫其他的免疫应答反应相同,能被微生物以及相关分子诱导和启动,发挥免疫防御作用,并且大肠杆菌在加入昆虫黑色素合成前体——多巴和多巴胺的培养基中生长繁殖受到抑制的实验结果,也是该结论的佐证。     

重组鸡干扰素-γ对脂多糖引起的肉鸡免疫应激的影响

文章旨在研究前期注射重组鸡干扰素-γ(rChIFN-γ)对肉鸡免疫应激的影响。将40羽14日龄肉鸡随机平均分成A、B、C和D 4组。于14、21、28和35日龄给A组和B组肉鸡静脉注射PBS缓冲液1mL.只-1,C组同期静脉注射含rChIFN-γ50μg的PBS缓冲液1mL.只-1,D组同期静脉注射含rChIFN-γ100μg的PBS缓冲液1mL.只-1。于36、38、40日龄,给B、C、D组的肉鸡腹腔注射含有大肠杆菌脂多糖(LPS,按体质量以250μg.kg-1计算)的PBS缓冲液1mL.只-1造模,A组同期腹腔注射PBS缓冲液1mL。记录36日龄至41日龄肉鸡的体质量和采食量,测定第3次注射脂多糖(40日龄)12h肉鸡的血常规和T淋巴细胞刺激指数,并于第3次注射脂多糖后12、24和36h,测定肉鸡血清白细胞介素-1(IL-1)、皮质酮(CORT)的含量。研究表明:(1)在整个免疫应激时期(36～41日龄),A组的平均日增体质量(P<0.01)和平均日采食量(P<0.05)均要高于B、C、D 3组,A组的料重比要显著低于B、C、D 3组(P<0.05);(2)第3次注射脂多糖后12h,C组和D组的白细胞总数显著高于A组和B组(P<0.05);(3)第3次注射脂多糖后12h,C组和D组的淋巴细胞刺激指数显著高于A组和B组(P<0.05);(4)第3次注射脂多糖后12h,A组的CORT含量显著低于B组(P<0.05),第3次注射脂多糖后24h,A组的CORT含量低于B组(P<0.01)、C组(P<0.05)和D组(P<0.05),第3次注射脂多糖后36h,A组显著低于B组(P<0.05);(5)第3次注射脂多糖12h后,A组IL-1显著低于B组(P<0.05),第3次注射脂多糖24h后,A组极显著低于其它各组(P<0.01)。结果显示,前期注射rChIFN-γ,可以缓解免疫应激导致的肉鸡血清中IL-1和皮质酮升高,提高免疫应激时期肉鸡的细胞免疫功能,缓解免疫应激对肉鸡的负面影响。     

Effects of Recombinant Chicken lnterferon-γ on Lipopolysaccharide Induced Immunological Stress in Broilers

文章旨在研究前期注射重组鸡干扰素-γ(rChIFN-γ)对肉鸡免疫应激的影响.将40羽14日龄肉鸡随机平均分成A、B,C和D4组.于14、21、28和35日龄给A组和B组肉鸡静脉注射PBS缓冲液1 mL·只-1,C组同期静脉注射含rChIFN-γ 50 μg的PBS缓冲液1 mL·只-1,D组同期静脉注射含rChIFN-γ 100 μg的PBS缓冲液1mL·只-1.于36、38、40日龄,给B、C、D组的肉鸡腹腔注射含有大肠杆菌脂多糖(LPS,按体质量以250 μg·kg-1计算)的PBS缓冲液1 mL·只-1造模,A组同期腹腔注射PBS缓冲液1 mL.记录36日龄至41日龄肉鸡的体质量和采食量,测定第3次注射脂多糖(40日龄)12h肉鸡的血常规和T淋巴细胞刺激指数,并于第3次注射脂多糖后12、24和36 h,测定肉鸡血清白细胞介素-1(IL-1)、皮质酮(CORT)的含量.研究表明:(1)在整个免疫应激时期(36～41日龄),A组的平均日增体质量(P＜0.01)和平均日采食量(P＜0.05)均要高于B、C、D3组,A组的料重比要显著低于B、C、D3组(P＜0.05);(2)第3次注射脂多糖后12 h,C组和D组的白细胞总数显著高于A组和B组(P＜0.05);(3)第3次注射脂多糖后12 h,C组和D组的淋巴细胞刺激指数显著高于A组和B组(P＜0.05);(4)第3次注射脂多糖后12 h,A组的CORT含量显著低于B组(P＜0.05),第3次注射脂多糖后24 h,A组的CORT含量低于B组(P＜0.01)、C组(P＜0.05)和D组(P＜0.05),第3次注射脂多糖后36 h,A组显著低于B组(P＜0.05);(5)第3次注射脂多糖12 h后,A组IL-1显著低于B组(P＜0.05),第3次注射脂多糖24 h后,A组极显著低于其它各组(P＜0.01).结果显示,前期注射rChIFN-γ,可以缓解免疫应激导致的肉鸡血清中IL-1和皮质酮升高,提高免疫应激时期肉鸡的细胞免疫功能,缓解免疫应激对肉鸡的负面影响.     

LPS致炎时间对小鼠小肠组织中IAP与NF-κB表达的影响

【目的】探究随着脂多糖(LPS)致炎时间延长小鼠小肠组织中肠型碱性磷酸酶(IAP)和核转录因子-κB(NF-κB)表达量变化,为减少肠黏膜应激损伤提供理论基础。【方法】选用体重相近、日龄接近的雄性健康ICR小鼠35只,随机分为7组,每组5只,小鼠腹腔注射1 mL/只LPS(5 mg/kg)。分别在注射LPS前(0 h)与注射后3、6、12、24、48和72 h,各组小鼠麻醉后断颈处死,采集十二指肠、空肠、回肠组织。用实时荧光定量PCR及Western blotting分别检测各肠段中IAP与NF-κB的mRNA水平及蛋白表达量;通过免疫共沉淀法检测IAP与NF-κB之间相互作用。【结果】与0 h相比,随着LPS致炎时间延长小鼠小肠组织中IAP基因表达量呈现波浪式变化,十二指肠、空肠组织在6 h时达到最高(P<0.01),回肠组织在48 h达到最高(P<0.01);24 h时十二指肠、空肠组织中NF-κB基因表达量极显著或显著升高(P<0.01;P<0.05),其他时间点表达量变化均差异不显著(P>0.05)。LPS处理后,随着时间延长,小鼠各肠段中IAP和...     

EP2受体对大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织中IL-1β和IL-6 mRNA表达的影响

为了研究前列腺素E2(PGE_2)受体-EP2受体对大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织中炎性因子的影响,本试验分别用1×10~(-8)～1×10~(-5 )mol/L的EP2受体激动剂(Butaprost)处理大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织,培养12 h,并选取Butaprost的有效作用浓度处理大肠杆菌感染的子宫内膜组织8,12和24 h,用RT-qPCR法检测IL-1β和IL-6 mRNA的表达,同时用HE染色技术观察组织形态结构。最后,在大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织中加入1×10~(-5 )mol/L的EP2受体阻断剂(AH6809),以验证EP2受体对IL-1β和IL-6 mRNA表达的特异性作用。结果显示:当10~(-7)mol/L的Butaprost处理大肠杆菌感染的奶牛子宫内膜组织12 h时,对IL-1β和IL-6基因表达的促进作用最为明显,并且能够加剧大肠杆菌引起的奶牛子宫内膜组织的病理性损伤;AH6809能够有效阻断Butaprost对IL-1β和IL-6基因表达的促进作用。结果表明,EP2在调控大肠杆菌引起的奶牛子宫内膜组织的炎性损伤中发挥重要的作用,为更加高效地治疗细菌性奶牛子宫内膜炎提供理论依据。     

纳米氧化锌对家蚕的急性毒性测试

纳米材料已广泛地应用于人们的日常消费品中,其生物安全性也随之成为关注的热点。以家蚕5龄幼虫作为实验动物,分别将不同浓度纳米氧化锌水悬浊液由幼虫腹部注射入蚕体,研究其对家蚕的急性毒性。测定纳米氧化锌对家蚕5龄幼虫48 h的致死中量(LD_(50))为737.31μg/头,参照全球化学品统一分类和标签制度(GHS)的分级标准,其毒性等级为3级。观察家蚕3龄幼虫染毒后12 h即出现了抽搐、表皮皱缩、禁食等中毒症状。调查统计染毒后12 h起幼虫的体质量极显著低于对照组。组织病理学观察染毒后48 h幼虫中肠、丝腺、脂肪体、气管等组织的细胞均出现不同程度损伤甚至破裂。其中,中肠上皮细胞受损,围食膜出现大量破损;丝腺细胞空隙基本消失,腺腔内容物极少;脂肪体细胞连接松散;气管管壁细胞基本脱离、消失,螺旋丝发生了融合解聚。试验结果表明,纳米氧化锌可在一定程度上抑制家蚕的生长和消化,并对家蚕的组织细胞产生较明显的不良影响。试验结果可为家蚕作为特殊模式动物研究纳米材料的急性毒性提供试验方法参考。     

大鼠热结肠道型气分证模型的构建及肠道结构、IEL和GC数量的变化研究

为了建立大鼠热结肠道型气分证模型,通过给大鼠灌服热性中药、自身粪便悬液及腹腔注射灭活大肠杆菌菌液,分别观察和检测大鼠临床症状、采食量、饮水量、体重、体温变化,并对大鼠肠道组织结构、IEL和GC数量变化进行研究。结果表明,灌服温热性中药、自身粪便及注射灭活大肠杆菌液后5h时大鼠临床症状、采食量、饮水量及体温等均符合中兽医热结肠道型气分证特征,肠道组织结构变化以注射灭活大肠杆菌后5h病理损伤最为明显,且十二指肠、空肠、回肠的IEL和杯状细胞数量均出现显著下降。即确定灌服12d热性中药及2d大鼠自身粪便后,腹腔注射灭活大肠杆菌后5h可成功制作出热结肠道型气分证大鼠模型。     

糖尿病诱导剂链脲佐菌素与原核表达的家蚕素Ⅱ对家蚕血糖含量的影响

为探讨高等动物糖尿病诱导剂对家蚕血糖含量的影响以及鉴定原核表达的家蚕素Ⅱ(BBXⅡ)的降血糖活性,通过给家蚕幼虫注射糖尿病诱导剂链脲佐菌素和BBXⅡ,调查家蚕的生理效应及血糖含量变化。分别以50~500μg/g的剂量给4龄24 h幼虫注射链脲佐菌素后12~48 h,会引起蚕体血液中的海藻糖含量升高,但与对照组的差异不显著;以250μg/g的剂量给5龄24 h幼虫注射链脲佐菌素后6 h,血液中的海藻糖含量显著升高,海藻糖酶活性显著降低。蚕体注射链脲佐菌素后表现出不同程度中毒症状,生长发育、存活率、茧质、眠性及后代的滞育性等均受到不同程度的影响。半定量RT-PCR检测表明,链脲佐菌素会导致家蚕体内BBX-Ⅱ基因的表达量下调,其中对4龄期幼虫的影响大于5龄期幼虫。用原核表达的BBXⅡ注射正常饲养的家蚕幼虫、饥饿后进食的幼虫和经链脲佐菌素处理的幼虫,均可引起血液中海藻糖含量显著降低和海藻糖酶活性升高,显示原核表达的BBXⅡ对家蚕具有降血糖活性。     

NLRP3炎症小体激活在急性大鼠乳腺炎中的作用

为探讨炎症小体NLRP3在大肠杆菌诱发的实验性大鼠乳腺炎中的作用,36只SD大鼠随机分为对照组、大肠杆菌组和抑制剂组。其中：大肠杆菌组于大鼠产后72 h经乳头管注入2×10¹² CFU/mL大肠杆菌悬液100μL/侧到第4对乳腺(两侧)内;抑制剂组在注射大肠杆菌悬液前0.5 h腹腔注射500 mg/kg格列本脲;对照组注射等量灭菌生理盐水,注射后12 h收集血清及乳腺组织。结果：大肠杆菌诱发能显著提高乳腺组织NLRP3及衔接蛋白ASC和炎症相关蛋白激酶Caspase-1的表达,促进炎性细胞因子IL-1β的释放,从而引起N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活性及丙二醛(MDA)水平的显著升高。NLRP3的抑制剂格列本脲预处理能抑制NLRP3及ASC和Caspase-1的表达,降低炎性细胞因子IL-1β的释放,下调NAGase的活性和MDA水平。可见NLRP3炎症小体的激活在大肠杆菌诱导的实验性乳腺炎症反应中发挥了重要的作用。     

家蚕半胱氨酸蛋白酶的研究进展

家蚕(Bombyx mori)作为鳞翅目模式昆虫,较早开展了组织蛋白酶研究,其中以对家蚕半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease)的研究居多。半胱氨酸蛋白酶参与了家蚕生长发育、蜕皮变态和免疫调节等生命活动过程。本文重点综述近几年国内外学者在家蚕半胱氨酸蛋白酶分类、基因表达特征、生物学功能研究方面取得的新进展,并简要阐述对家蚕半胱氨酸蛋白酶研究的主要方面。     

LPS诱导的免疫应激对肉鸡组织内参基因稳定性的影响

脂多糖(LPS)诱导的免疫应激下,选择适于校正肉鸡肝脏、心脏和回肠组织中目的基因表达量的内参基因。将30只1日龄的肉鸡随机分为对照组与处理组,21日龄时,处理组注射1 mg/kg的LPS,对照组注射等量灭菌生理盐水,2 h后,每组各取7只肉鸡的肝脏、心脏和回肠组织。通过实时荧光定量PCR技术(RT-q PCR)对各组织中β-肌动蛋白(ACTB)、β2-微球蛋白(B2M)、18 S核糖体RNA(18 S r RNA)、28 S核糖体RNA(28 S r RNA)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)共5个内参基因的表达定量,利用Ref Finder和Ge Norm软件分析内参基因的稳定性及配对差异。结果显示:LPS刺激下,5个内参基因的表达水平有不同程度的变化。18 S r RNA、ACTB和GAPDH适于肝脏中目的基因表达量的校正;B2M和GAPDH适于心脏中目的基因表达量的校正;18 S r RNA和ACTB适于回肠中目的基因表达量的校正。选择表达稳定性高的内参基因适于校正目的基因的表达量,RT-q PCR应根据不同的研究对象进行选择,建议选择2个或2个以上的内参基因。     

大肠杆菌对奶牛子宫内膜组织合成分泌IL-1β、IL-6和PGE_2的影响

基于奶牛子宫内膜组织体外培养方法,分别采用浓度为1×10~5,1×10~6 CFU/mL的致病性大肠杆菌处理体外培养的子宫内膜组织12,24 h后用HE染色方法评价组织损伤情况,ELISA法检测组织培养液上清中IL-1β,IL-6和PGE_2的分泌变化,RT-qPCR法检测IL-1β和IL-6基因表达变化。结果显示:与对照组相比,大肠杆菌分别处理12,24 h后奶牛子宫内膜组织中子宫内膜上皮细胞和腺上皮细胞脱落、坏死、崩解,并且显著提高奶牛子宫内膜组织IL-1β,IL-6和PGE_2的分泌及IL-1β和IL-6的mRNA的表达量。结果表明:成功建立了体外大肠杆菌型奶牛子宫内膜炎模型,且IL-1β,IL-6和PGE_2在大肠杆菌引起的奶牛子宫内膜组织炎症反应中发挥着重要的调控作用。     

一种家蚕丝腺体外培养和基因瞬时表达分析的方法

家蚕是鳞翅目重要的模式生物,但是目前家蚕培养细胞系少,给家蚕基础研究带来不便,也影响了家蚕作为模式生物的应用。组织体外培养在一定程度上可以代表体内环境,且操作相对简单。我们尝试并建立了一种采用TC-100培养基体外培养丝腺组织的方法,取健康家蚕5龄2 d的幼虫,用75%乙醇进行表面消毒,灭菌水冲洗,剪开腹部表皮固定,用镊子轻轻拉出丝腺组织,用75%乙醇快速漂洗、PBS缓冲液冲洗2～3次,放入含有800μL TC-100培养基的12孔细胞培养板的培养孔中,每孔4条丝腺组织,27℃培养;将0.64μg增强荧光蛋白基因表达载体pcDNA3.0[ie1-egfp-SV40]加入到25μL不完全TC-100培养基中孵育15 min后转染丝腺组织,48 h后用荧光显微镜观察,培养基清澈,丝腺组织外形完好、发出亮绿色荧光,表明egfp在丝腺中得到了表达。为进一步验证体外培养丝腺的转染效果,将家蚕miR-0031*的抑制物(inhibitor)和阴性对照(inhibitor negetive control)各10μL按照同样方法配成转染液,加入到放有丝腺组织的培养孔中,48 h收集丝腺组织,提取总RNA,荧光定量PCR检测靶基因BmFib-L的表达量,结果显示,inhibitor抑制miR-0031*的表达,促使BmFib-L的表达量上升,表明用体外培养丝腺进行转染等试验是可行的。该方法的建立为研究蚕丝蛋白基因表达调控的分子机制提供新的技术途径,也为家蚕其他组织的体外培养和研究提供借鉴。     

家蚕血细胞对病原微生物吞噬作用的扫描电镜观察

为探讨家蚕血细胞的吞噬作用,对蚕体腔分别注射微粒子孢子M_(1 2)和核多角体,经30min、1h、2h后,用相差显微镜及扫描电镜进行观察。家蚕血细胞对微粒子M_(1 2)孢子及核多角体的捕食作用,主要为颗粒细胞,其吞噬作用较之其他血细胞显著,家蚕血细胞对微粒子及核多角体的吞噬作用主要为膜捕捉(active en-membranosis),注射病原微生物30min后,可观察到多数的颗粒细胞已在捕食病原微生物;经2h后,多数的颗粒细胞已吞噬了数个甚至10数个病原微生物。     

家蚕品种7532和大造在高温冲击下中肠抗氧化酶活性的变化

为了探讨家蚕抗高温冲击的生理机制,比较了高温(36℃)冲击对家蚕二化性品种7532和大造5龄幼虫死亡率和中肠抗氧化酶活性的影响。自5龄24h起,供试家蚕品种大造经高温冲击24h以后,幼虫的累计死亡率就显著升高;而7532经高温冲击48h以后,幼虫的累计死亡率才显著升高。高温冲击48～72h,7532的5龄幼虫中肠组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性较高,且随高温冲击时间延长显著增加,而大造5龄幼虫中肠组织中SOD的活性较低,且高温冲击时间延长后的变化不显著;7532的5龄幼虫中肠组织中的过氧化氢酶(CAT)活性在高温冲击48h后显著升高,而大造5龄幼虫中肠组织中的CAT活性在高温冲击24h后显著下降,直到72h后才显著升高,并且7532中肠组织中的CAT活性显著高于在大造中肠组织中的活性;2个品种5龄幼虫中肠组织中的谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性分别在高温冲击24h和48h时达到峰值,在高温冲击48～72h期间,7532中肠组织中的GST活性显著高于大造中肠组织中的活性。上述结果提示,家蚕品种7532抗高温冲击能力较家蚕品种大造强,与其中肠组织中的抗氧化酶活性升高有关。     

家蚕中肠组织在变态发育不同时期的蛋白表达差异分析

分析了家蚕在变态期不同发育时段中肠组织蛋白表达差异的信息。SDS-PAGE电泳分析显示,从家蚕吐丝前1 d到化蛹72 h的中肠蛋白分离到相对明显的16条泳带,其中分子量约为30、45、70 kD的蛋白组分含量较大,且比较稳定,分子量约为50、60、62 kD的蛋白组分在不同时期存在着显著的表达差异。进而通过聚丙烯酰胺双向凝胶电泳分析,发现家蚕中肠组织蛋白的表达种类和差异蛋白数目的变化在化蛹1～3 d非常明显:蛋白表达种类的变化呈现2个高峰,分别为化蛹0 h和化蛹41 h;差异蛋白数目的变化呈现3个波峰,分别在吐丝98 h至化蛹0 h、化蛹30～41 h和化蛹41～58 h。在化蛹1～3 d,这种显著峰值变化的时期刚好与家蚕中肠组织发生旧肠壁细胞退化死亡和新生肠壁细胞分化增殖的盛期相吻合,从一个侧面反映了家蚕中肠组织在变态期活跃的发育进程。     

蒙药成分复方对乳房炎模型小鼠治疗作用的研究

旨在探讨蒙药成分复方对乳房炎模型小鼠的治疗作用。利用乳腺内注射大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合菌悬液的方法制备小鼠乳房炎病理模型;模型制备24 h后,阳性对照组、阴性对照组、蒙药成分复方组分别灌胃环丙沙星、生理盐水、蒙药成分复方水溶液,连续给药3 d,每天1次;于注射菌液后24 h(治疗前)和给药后72 h(治疗后),观察各组小鼠的临床症状、组织病理学变化,测定母鼠乳腺组织匀浆中的TNF-α、IL-6含量和乳腺内菌落数。结果表明,蒙药成分复方可以修复由大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染所造成的乳腺组织损伤,显著降低乳房炎模型小鼠乳腺组织中的TNF-α、IL-6含量和乳腺菌落数(P0.05)。蒙药成分复方可以治疗由大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合感染引起的小鼠乳房炎。     

注射大肠杆菌诱导柞蚕蛹血淋巴产生抗菌物质的某些特性

<正> 1981年,作者等报道了注射大肠杆菌于滞育的柞蚕蛹诱导血淋巴产生某些抗菌物质,能抑制包括病原细菌苏芸金杆菌、粘质沙雷氏菌等10种细菌。1981年,Steiner等从大肠杆菌免疫的天蚕蛹血淋巴中分离到溶菌酶、天蚕素A及B(Cecropin A、B),对后者进行了氨基酸的一级结构分析。1981年,大森等用福尔马林钝化的大肠杆菌疫苗注射于五龄家蚕,诱导血淋巴产生     

应用重组家蚕核多角体病毒在蚕体中表达人丙型肝炎病毒C区及E1区基因

将人丙型肝炎病毒的C区、E1区及部分E2区基因装入转移载体 pBM0 3 0 ,经原位杂交筛选、酶切鉴定、Southern杂交检测确定转移质粒装载成功。将转移质粒与家蚕核多角体病毒重组 ,在家蚕BmN细胞中挑选重组病毒 ,经点杂交技术确证重组病毒带有目的基因。将重组家蚕核多角体病毒通过针刺和注射方法感染蚕蛹及 5龄期家蚕 ,肽抑制试验检测目的基因表达的多肽活性。结果表明 ,目的基因已得到表达 ,表达量较高 ,为每蛹体约 60～ 60 0 μg。