基于棉花转录组测序的SSR分子标记的开发

通过对棉花转录组进行测序获得的57 695条Unigenes,利用MISA软件进行搜索,得出简单重复序列(simple sequence repeat,简称SSR)的分布情况,共挖掘检索得到1 886个SSR位点,SSR的出现频率为3.27%。所有SSR位点分布于1 759条Unigenes上,发生频率为3.05%,平均每20.8 kb会出现1个SSR位点。有117条Unigenes含有1个以上SSR位点,含有复合型SSR的Unigenes数目为56条,其中三核苷酸基元类型分布最多,SSR数量为1 582个,占挖掘出总SSR数量的83.88%,而单、二、四、五、六核苷酸重复类型所占的比例较小。最后通过Primer 3程序进行SSR引物设计,得到部分引物序列,可用于棉花遗传多样性分析、分子标记辅助育种以及种质资源的保存等。     

基于柿雌雄花芽转录组测序的SSR和SNP多态性分析

为深入开发柿SSR和SNP分子标记,进而推动柿品种鉴定和遗传多样性等研究,以‘禅寺丸’柿的雌雄花芽转录组序列为基础,对SSR和SNP位点进行发掘。结果表明:转录组测序获得了154 741条unigene,其中有38.49%unigene在数据库中得到注释。利用MISA软件进行SSR位点的搜索,共得到44 304个SSR,包含83种重复基元,其中以A/T类型为主的单核苷酸重复所占的比例最高(20 006个,占47.63%),其次是以AG/CT类型为主的二核苷酸重复(16 055个,占38.23%),再次是以AAG/CTT类型为主的三核苷酸重复(5 402个,占12.87%)和以AAAG/CTTT类型为主的四核苷酸重复(500个,占1.19%)。在转录组得到的unigene中共发现SNP 405 685个,发生频率为1/253bp。6种单核苷酸变异中,转换类型发生频率显著高于颠换类型,转换类型中的C/T(31.51%)和A/G(31.41%)发生频率最高,在颠换类型中A/T发生频率最高。柿SSR和SNP的位点是非常丰富的,可为柿遗传图谱构建、遗传多样性和亲缘关系研究提供丰富的基础数据信息。     

基于转录组测序的红萍SSR和SNP特征分析

为了解红萍在不同氮浓度胁迫下红萍转录组中SSR、SNP分子标记的详细情况，分析转录组数据中分布的SSR和SNP位点。通过提取红萍根和叶的RNA,构建cDNA文库并利用二代测序平台进行高通量测序，利用MISA对测序数据进行SSR特征分析，同时采用软件STAR进行比对并通过GATK进行SNP识别。结果表明：红萍转录组共有9 009个SSR位点，SSR位点频率为30.12%。其中，以三核苷酸重复和单核苷酸重复为主，分别占总比例的43.66%和26.41%。SNP位点有439 217个，包括转换类型(282 532个)和颠换类型(156 685个);转换类型占比(64.33%)显著大于颠换类型(35.67%)。C/T在所有变异类型中所占比率最高，占总量的17.33%;G/A位居其次(17.01%)。红萍转录组SSR和SNP位点丰富，可为红萍遗传多样性、遗传结构与分化以及功能基因的开发利用等研究提供依据。     

基于转录组测序的黄麻SSR分子标记开发与初步验证

为开发黄麻SSR引物,为黄麻分子标记辅助育种等研究提供有利工具,在黄麻转录组测序的基础上,采用MicroSAtellite(MISA)软件进行SSRs搜索,并对部分SSR引物的多态性进行验证,结果表明:1)在1kb以上的13 718条unigene中,共检测到8 571个SSR位点,占评估序列数目的62.47%,平均每3.47kb有1个SSR;2)所开发的SSR标记中,单核苷酸重复序列最多,占42.15%,二核苷酸和三核苷酸序列也较丰富,分别占14.80%和16.74%;3)利用Primer3.0软件设计了与木质素合成酶基因及MYB转录因子相关的880对引物,随机选取29对引物,以8份不同类型黄麻种质进行多态性验证,获得8对具有稳定多态性的引物,多态性引物比率为27.58%。结果表明,基于黄麻转录组序列的SSR标记开发是可行的,开发的SSR标记可为黄麻属遗传多样性分析、遗传图谱构建及功能基因的挖掘等研究提供有利工具。     

利用转录组测序开发甘蔗SNP分子标记

【目的】利用转录组测序开发甘蔗SNP分子标记,为甘蔗建立一种高效和低成本的分子标记开发方法。【方法】以40个甘蔗栽培品种为试验材料,使用高通量测序平台获得其转录组数据,经质控后将其匹配到参考基因组,然后使用GATK软件检测和过滤SNP分子标记,并使用snpEff对SNP进行注释及统计分析。利用这些SNP分子标记进行系统发生分析、主成分分析和群体结构分析。最后,开发KASP标记并随机验证其有效性。【结果】转录组数据经质控后平均每个样本获得6.5 Gb的序列。通过变异分析和多重过滤筛选后,共获得220397个注释到染色体上的双等位基因SNP位点,平均密度为3 SNP/kb。SNP类型及分布特征分析结果表明,编码区错义突变与沉默突变的比值（N/S）为1.05,转换类型和颠换类型的比值（Ts/Tv）为1.89,杂合SNP占38.66%～49.91%,位于转录本的SNP比例为44.74%。系统发生分析、主成分分析和群体结构分析结果均表明,甘蔗栽培品种遗传来源较为单一,但群体分化较大。开发了11176个KASP分子标记,并随机合成25组KASP引物进行多态性验证,共有23组（92%）引物能检测到扩...     

基于转录组测序技术的黄唇鱼SSR分子标记筛选

[目的]筛选出可用于黄唇鱼(Bahaba flavolabiata)遗传资源评价及亲缘鉴定的SSR分子标记,为开展其保护遗传学研究打下基础.[方法]利用Illumina HiSeq 4000测序平台对野生黄唇鱼样本进行转录组测序,采用TGICL对转录组数据进行聚类去冗余以获得Unigene,并通过生物信息学方法进行功能注释分类、代谢通路和SSR特征分析等.[结果]黄唇鱼混合组织的转录组测序共获得13.43 Gb数据,经组装并去冗余后获得65047条Unigenes.采用BLAST对组装获得的Unigenes进行七大功能数据库(NR、NT、GO、COG、KEGG、Swissprot和Interpro)注释,结果共有55583条Unigenes被注释(占85.45%).通过MISA对黄唇鱼的Unigene进行SSR搜索,共检测到29797个SSR位点分布于19664条Unigenes中.SSR位点分布类型及其特征分析结果显示,最主要的重复类型为二核苷酸重复基元(11855个,占39.79%),其次是单核苷酸重复基元(9695个,占32.54%)和三核苷酸重复基元(6663个,22.36%),而四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复基元的数量相对较少.二核苷酸重复基元类型中重复最多的基序是AC/GT(8355条),在三核苷酸重复基元类型中重复最多的基序是AGG/CCT(1866条).从随机选取的186对SSR引物中,最终筛选出47对扩增稳定性好且具有多态性的SSR引物,以二核苷酸和四核苷酸重复基元的扩增结果居多.[结论]通过转录组测序能有效筛选出具有多样性的黄唇鱼SSR分子标记,可为黄唇鱼的遗传多样性分析、亲缘鉴定和遗传图谱构建等后续研究提供基础资料.     

基于转录组测序的花斑裸鲤SSR、SNP和InDel位点特征分析

为利用分子标记规模化开发与辅助花斑裸鲤(Gymnocypris eckloni)良种选育,以花斑裸鲤(2⁺龄)的鳃、肾脏和肝脏组织为材料,经总RNA提取和cDNA文库构建后采用Illumina Novaseq 2000平台进行转录组测序,并采用MISA和GATK3软件分析转录组的SSR、SNP和插入缺失标记(InDel)位点特征。结果表明：在486 221条Unigenes序列中共发现了128 727个SSR,出现频率为26.47%,平均每3.76 kb出现1个SSR;花斑裸鲤SSR包括6个重复类型,以单碱基和二碱基重复基元类型为主,分别占总SSR位点数的46.53%和42.45%,重复基元类型共77种,其中,A/T和AC/GT两种基元的出现频率最高,是花斑裸鲤SSR的优势重复基元;所有重复次数中出现次数最多的为5～15次,占所有SSR位点的87.52%;通过GATK3软件搜索得到399 080个SNP位点,转换类型多于颠换类型,分别占总SNP的56.29%和43.71%,转换类型中A/G发生频率略高于C/T,而颠换类型中A/T发生频率最高,C/G发生频率最低;I...     

基于甘薯耐盐转录组测序的SSR和SNP特征分析

旨在对甘薯耐盐转录组中潜在的SSR和SNP位点进行挖掘及特征分析，以完善甘薯分子标记。试验以不同耐盐甘薯品种的转录组序列为基础，利用MISA、GATK软件分析了转录本中的SSR和SNP信息。结果显示，研究共获得SSR位点33192个，分布在24323条Unigenes中，出现频率为21.11%。其中，6271条Unigenes含有超过1个以上的SSR位点。SSR类型以单核苷酸重复SSR和双核苷酸重复SSR为主。在重复基元中，A/T和AG/CT所占的比例最高，为优势基元。在157252条Unigenes中共挖掘到SNP位点7691906个，分布密度为0.08个/bp。其中转换类型有4729922个，颠换类型有2961984个。在所有突变类型中，C/T和A/G含量最高，分别为占总数的32.34%和29.15%。综上所述，甘薯转录组具有较丰富的SSR和SNP标记，多态性较高，可为甘薯抗逆品种筛选、种质培育等研究奠定理论基础。     

油茶转录组测序与SSR特征分析

以油茶转录组测序数据为基础,利用MISA软件对SSR进行搜索,并对SSR特征进行分析评价。结果表明：油茶转录组中发现104 515个SSR,分布在80 724条Unigene中,分布密度为1/1.48 kb,平均出现频率为33.58%。主要的核酸重复类型是单核苷酸和二核苷酸,A/T和AG/CT是优势重复基元,重复比例最高的是10次。基序长度主要分布在12~20 bp之间,占总数的51.71%。油茶转录组SSR位点具有显著的数量优势、丰富的类型和较好的多态性潜力。     

棘腹蛙、棘胸蛙和双团棘胸蛙血细胞的比较研究

为棘腹蛙、棘胸蛙和双团棘胸蛙的人工饲养、两栖类血液生理学和比较细胞学研究提供基础资料,采用常规血涂片Wright染色法对水城地区的棘腹蛙(Paa boulengeri)、棘胸蛙(Paa spinosa)和双团棘胸蛙(Paa yunnanensis)的血细胞进行显微观察、形态参数测定。结果表明:3种棘蛙的血细胞在形态上区别不大,大小上存在差异。     

基于转录组测序的温带臭虫SSR和SNP位点分析

[目的]温带臭虫(Cimex lectularius)是世界性分布的吸血性寄生虫,主要靠吸食人血为生。探究温带臭虫转录组SSR和SNP分布规律,可为后期温带臭虫的SSR和SNP分子标记开发、遗传多样性分析以及遗传图谱构建等研究奠定基础。[方法]以转录组数据为基础,利用软件msatcommander v0.8.2和SOAPsnp v1.03系统分析了SSR和SNP位点多态性和分布特征。[结果]温带臭虫转录组数据的25 468条unigene中含有4 758个SSR位点,分布在4 171unigene序列中。其中单核苷酸重复的次数最多,共有2 795个,占总数的58.74%,其次是三核苷酸重复和二核苷酸重复分别是984个(20.68%)和764个(16.06%),四核苷酸重复有195个(4.10%),而五、六核苷酸重复最少,仅出现20次(0.42%)。在温带臭虫的SSR位点中,共出现30个重复基元,其中优势的重复基元类型是A/T,共有2 757个,其次是AT/AT,有474个,ATT/AAT有342个。在25 468个unigene中共发现76 562个simple SNPs,其中转换类型46 634个,占60.91%,颠换类型29 928个,占39.09%。碱基转换类型比例高于颠换类型。6种单碱基变异类型中,C-T发生频率最高,比例为30.69%,其次为A-G,比例为30.22%。[结论]温带臭虫转录组中SSR和SNP位点数量多,出现频率高,且类型丰富。     

饲料营养水平和温度对棘胸蛙蝌蚪变态发育的影响

为了探究在棘胸蛙蝌蚪变态发育过程中,饲料的营养水平与水温对其的影响,在蝌蚪30日龄时采用5种不同营养水平的饲料和3种不同水温进行饲养,测定蝌蚪的体长、体重及变态率等指标.结果表明:饲料营养水平和温度对棘胸蛙蝌蚪变态发育的影响显著.动物蛋白含量最高的Ⅰ组饲料喂养的蝌蚪于70 d左右进入变态期,80日龄时的体重为0.625 g;动物蛋白含量最低的Ⅵ组饲料喂养的蝌蚪进入变态期最晚,90日龄时的体重为0.553 g.在同一营养水平下,高温Ⅵ组蝌蚪的变态时间最短,70 d左右出现变态.本研究结果表明,较高的动物蛋白含量和较高水温均有利于促进蝌蚪的变态发育.     

一株棘胸蛙源蛙病毒的分离与鉴定

通过对棘胸蛙(Quasipaa spinosa)患病个体结合人工感染试验、PCR检测和系统发育分析对分离病原进行鉴定。结果表明,将患病的棘胸蛙肝、脾、肾等组织研磨匀浆液接种鲤鱼上皮瘤细胞(EPC),出现明显细胞病变。人工注射感染棘胸蛙表现出与自然患病相似的症状,14 d累计死亡率达到80%。通过对蛙病毒MCP基因的PCR检测及系统发育树分析发现,分离的棘胸蛙病毒与蛙病毒属病毒的相似性在99%以上,且与蛙病毒属FV3病毒类群聚为同一分支,暂命名为棘胸蛙蛙病毒(Quasipaa spinosa ranavirus,QSRV)。     

基于转录组序列的叶用芥菜奶奶青菜EST-SSR标记开发与遗传多样性分析

为了探究叶用芥菜奶奶青菜资源的多样性水平,基于转录组数据研究了奶奶青菜简单重复序列标记(EST-SSR)特征,筛选了适合奶奶青菜的EST-SSR引物,并分析了奶奶青菜的遗传多样性。转录组测序分析共获得46 386条非冗余基因(unigene),其中13 544条unigene序列中含有18 720个简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)位点,SSR的发生频率为29.20%,平均每2.73 kb出现1个SSR,分布频率为40.36%。优势重复序列为单核苷酸,占总SSR数量的49.39%,其次为三核苷酸和二核苷酸,分别占总SSR数量的25.44%和24.13%。AT、AGCT和AAG/CTT分别是单核苷酸、二核苷酸以及三核苷酸的优势重复基元。以30份奶奶青菜和5份其他芸薹属蔬菜为材料,从37对引物中筛选出17对多态性引物,扩增得到135条多态性条带,多态性比例达88.2%。遗传多样性分析结果显示,平均等位基因数(N_a)为5.705 9,平均有效等位基因数(N_e)为2.397 8,平均多样性指数(I)为1.036 1,平均观察杂合度(H_o)为0.312 1,平均期望杂合度(H_e)为0.530 0,平均Nei’s期望杂合度为0.521 9,表明筛选出的17对SSR引物具有较好的遗传多样性。通过非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)聚类分析,在相似系数为0.677处可将30份叶用芥菜奶奶青菜材料分为3类。试验结果可为叶用芥菜奶奶青菜的种质资源鉴定、亲缘关系分析和分子标记辅助育种等研究提供引物支持和技术参考。     

黑果枸杞转录组SSR信息分析及分子标记开发

分析黑果枸杞Lycium ruthenicum转录组中简单重复序列（SSR）位点信息,开发SSR分子标记。采用MISA软件在黑果枸杞转录组中共检测到73 896个SSR位点,分布于56 170条单基因簇（unigenes）中,出现频率为26.36%,平均分布距离为3.55 kb。优势重复基序为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸,分别占总SSR位点的74.33%,13.30%和11.81%;共发现84种重复基序,重复次数为5~33次,其中出现频率最高的基序为A/T,AG/CT,AT/AT,C/G和AAC/GTT。针对SSR位点设计了12 674对引物,随机挑选128对引物进行多态性验证,其中74对（57.8%）得到清晰的扩增产物;用其中的28对高多态性引物对24份枸杞种质进行扩增,共检测到等位基因256个,平均为9.1个。平均主效等位基因频率、观察杂合度、期望杂合度和多态信息量分别为0.432,0.439,0.712和0.678。以上结果表明:基于黑果枸杞转录组测序得到的Unigene信息可作为开发SSR标记的有效来源,获得的大批量SSR标记可为枸杞遗传多样性分析和遗传图谱构建提供可靠的标记选择。     

棘胸蛙虹彩病毒免疫方法研究

[目的]研究棘胸蛙虹彩病毒疫苗体表喷雾和肌肉注射的免疫效果,为其免疫方法提供理论依据。[方法]用不同浓度棘胸蛙虹彩病毒灭活疫苗进行体表喷雾免疫和肌肉注射免疫,并进行血清抗体效价检测和相对免疫保护率测定。[结果]注射0.2 m L 1×108TCID50/m L疫苗组21 d血清中和抗体效价最高达到380.2,相对免疫保护率达到80%;体表喷雾1×107TCID50/m L疫苗组,28 d最高抗体效价为320.0,相对免疫保护率为60%。[结论]肌肉注射疫苗和体表喷雾疫苗对棘胸蛙都有较好的免疫效果,肌肉注射疫苗组的免疫效果最佳,但喷雾免疫可作为棘胸蛙快速无损伤免疫的一种有效途径。     

油棕转录组SSR 标记开发研究

从NCBI网站下载4072 条油棕EST,结合文献报道的油棕果肉转录组序列信息,通过聚类拼接和处理,得到全长为32637.947 kb的无冗余序列20054条。在这些序列中共检索出4 538 个SSR袁检出率为22.6%遥其中以单核苷酸重复基序为主导类型袁出现频率为51.2%,二核苷酸、三核苷酸重复基序的出现频率分别为20.4%和17.9%。随机挑选了400对SSR引物进行PCR 多态性检测,获得29对PCR多态性引物,并随机选取11引物进行验证,在4种不同来源的油棕样本中表现出多态性。