球孢白僵菌感染对家蚕血淋巴黑化及微生物蛋白酶抑制剂表达的影响

家蚕是一种具有重要经济价值的绢丝昆虫,也是一种重要的模式生物。家蚕易受到环境中各种病原物的侵染而发生疾病。通过观察家蚕感染球孢白僵菌后血淋巴黑化程度的变化、家蚕血淋巴蛋白SDS-PAGE分析和微生物蛋白酶抑制剂的胶内活性染色分析,研究球孢白僵菌感染对家蚕血淋巴黑化和微生物蛋白酶抑制剂表达的影响。结果表明,球孢白僵菌感染会激活家蚕血淋巴的黑化反应,参与对真菌的免疫应答。SDS-PAGE分析显示,接种球孢白僵菌后120 h内家蚕血淋巴蛋白未发生明显的水解。胶内活性染色表明,家蚕血淋巴中存在一种白僵菌诱导型蛋白酶抑制剂SI-3,其抑制活性随着感染进程的推移而略有变化。研究结果不仅有助于阐明病原性真菌与家蚕的互作关系,发现新的抗真菌分子,而且对农林害虫防治具有一定的指导意义。     

家蚕三种白僵菌的初步观察

从本校的蚕病实验室收集寄生家蚕的白僵菌中,分离出球孢、小球孢和卵孢三种白僵菌.球孢和小球孢白僵菌分生孢子为球形或卵形,前者孢子较大,且菌落呈平绒状,并逐渐由白变黄;后者孢子较小,菌落后来形成乳粉状孢子层.卵孢白僵菌分生孢子多亚圆形或椭圆形,且大小开差较大,菌落表面高低不平,白色,后期形成粉状.小球孢白僵菌菌丝体,从病蚕节间膜生出,而球孢和卵孢白僵菌全身布满菌丝层,但以卵孢白僵菌生长速度为快.球孢和小球孢白僵菌病蚕血液中有芽生孢子.且球孢白僵菌特多.而卵孢白僵菌病蚕血液中芽生孢子极少.其中以卵孢白僵菌致病力最强.球孢和小球孢白僵菌较弱.     

白僵菌生防菌株Bb10和4株家蚕来源白僵菌分离株的生物学特性研究

为探明用于生物防治的白僵菌菌株和家蚕来源白僵菌的关系,用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基对来自广西壮族自治区的白僵菌生防菌株Bb10和收集自广西象州、宜州、环江等蚕区的4株家蚕白僵菌分离株进行分离鉴定,并对菌株的生物学特性和毒力进行比较。菌株的鉴定结果表明:象州寺村镇的家蚕白僵菌Bb9和广西生防白僵菌Bb10均为卵孢白僵菌;象州中平镇的家蚕白僵菌Bb3和环江家蚕白僵菌Bb12为球孢白僵菌;宜州家蚕白僵菌Bb11为小球孢白僵菌。上述5株白僵菌的菌落形态、营养生长量、产孢量等生物学性状及对家蚕的毒力存在差异。生长最快的是Bb9菌株和Bb10菌株,且二者的菌落形态均呈棉絮状,但Bb10菌株的分生孢子较Bb9菌株的分生孢子要大很多;产孢量最高的是Bb10菌株和Bb11菌株;Bb3菌株对家蚕的毒力最强,Bb9菌株和Bb10菌株的毒力相对较弱。上述结果暗示广西蚕区白僵病的病原来源非常复杂,部分蚕区的家蚕白僵菌与生防用白僵菌有一定程度的相似性,可作为家蚕白僵病的溯源和防控依据。     

白僵菌菌株的ITS序列鉴定

球孢白僵菌是世界范围内害虫生物防治中推广和应用最为成功的昆虫病原真菌之一。我国东北地区,尤其是吉林省多年以来一直利用白僵菌进行玉米螟防治,取得良好的经济效益、生态效益和社会效益。利用分子生物学技术,通过白僵菌ITS序列快速进行种的鉴定,明确菌株的分类地位,为进一步的研究提供准确的研究材料。研究结果表明,8个白僵菌菌株都为球孢白僵菌菌株,其同源性达到99%。     

生物防治白僵菌与家蚕病原白僵菌的生物学特性初步比较

对广州市森林保护用生防白僵菌Bb2、华南农业大学保存生防用白僵菌Bb7以及收集自广东省化州蚕种场、化州市笪桥村、翁源县硝村等蚕区的3株家蚕白僵菌分离株(Bb8、Bb13、Bb14),分别用PDA培养基进行分离和扫描电子显微镜观察,并对菌株的生物学特性进行初步比较,为开展家蚕白僵病的病原溯源和防控研究,以及为评估蚕区使用白僵菌农药对养蚕生产安全的影响提供实验依据。结果表明,上述5株白僵菌的菌落形态、营养生长量、产孢量等生物学性状存在差异,生长最快的是Bb2菌株,产孢量最高的是Bb8菌株和Bb13菌株;2株僵蚕蛹来源白僵菌Bb8、Bb14的分生孢子在扫描电子显微镜下呈球形或近球形,二者同为球孢白僵菌[Beauveria bassiana(Bals.)Vuill.]。研究结果还显示部分蚕区的家蚕白僵菌与生物防治用白僵菌有一定程度的生物学特征相似性,而相同地区的家蚕病原白僵菌也存在差异,这暗示广东蚕区家蚕白僵病的病原来源复杂,对于2株生防用白僵菌菌株Bb2、Bb7是否为家蚕病原白僵菌还有待进一步研究。     

兽用中草药介绍（六）

僵蚕 又称白僵蚕、白姜蚕、僵虫、姜虫、天虫(见图)。为蚕蛾科昆虫家蚕,在4～5龄的幼虫,被真菌门半知菌纲的白僵菌感染或人工接种白僵菌而感染致死的家蚕干燥虫体。     

白僵菌诱导家蚕抗菌肽enbocin1基因的表达特征及产物的抗真菌活性

家蚕的抗菌肽家族基因enbocin1是蚕体免疫系统相关基因。为解析家蚕对病原真菌感染免疫应答反应的分子机制,采用实时荧光定量PCR检测抗菌肽基因enbocin1在家蚕5龄幼虫感染球孢白僵菌(Beauveria bassiana)后的时空表达模式,结果显示:enbocin1主要在幼虫脂肪体中显著上调表达,而且持续至感染诱导后30 h,感染后8、30 h的表达水平分别上调了约44倍和6倍;在马氏管、体壁中该基因的诱导表达差异不显著,在血淋巴中几乎检测不到该基因的表达。进一步用原核表达系统成功表达并纯化获得了高纯度的重组家蚕抗菌肽enbocin1,体外抑菌试验表明其对白僵菌具有较强的抑菌活性,且重组enbocin1蛋白浓度与抑菌活性之间具有量效关系。用重组enbocin1蛋白制备了效价达1∶30 000的多克隆抗体,可用于进一步深入研究enbocin1的功能及其作用机制。研究结果提示抗菌肽enbocin1在家蚕抵御真菌感染的过程中可能具有重要作用。     

家蚕Toll和IMD信号通路重要基因对不同病原体感染的免疫响应

Toll和IMD通路是昆虫先天免疫的重要信号通路，抗菌肽的产生可以由这些通路激活。通过感染4种不同种类的病原体(球孢白僵菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌),对家蚕Toll通路的BmTube、BmMyD88、BmTollip、BmECSIT、BmTRAF2和BmCactus基因，IMD通路的BmDredd、BmFadd、BmTAB2、BmTAK1、BmRelish1和BmRelish2基因以及4类不同抗菌肽(antimicrobial peptide, AMP)基因BmCecropinA1、BmAttacin1、BmDefensinA和BmGloverin1的表达进行分析，探讨家蚕在感染不同病原后Toll和IMD通路级联反应的免疫响应。结果表明，家蚕Toll和IMD信号通路级联反应基因表达调控与不同种类病原体感染相关；不同类型的病原选择性地激活Toll和IMD通路，进而诱导特定AMP基因的表达，AMP基因表达对细菌的免疫响应快，对真菌的免疫响应慢，其中BmCecropinA1表达强度显著高于其他类型AMP基因。     

耕牛球孢白僵菌中毒的治疗

<正>球孢白僵菌(B.bassiana)属于半知菌亚门(Deuteromycotina),丝孢纲(Hyphomycetes),丛梗孢目(Moniliales),丛梗孢科(Moniliaceae),白僵菌属(Beauveria),是广泛用于害虫生物防治的真菌类杀虫制剂。球孢白僵菌在虫体内生长繁殖,消耗虫体内养分,形成大量菌丝和孢子,布满虫体全身,同时     

白僵菌的分类研究进展

白僵菌(Beauveria)是一类寄主范围广、致病性与适应性很强的昆虫病原真菌,已广泛应用于农林害虫的生物防治,但是有些白僵菌种对家蚕等经济昆虫也存在严重的危害。对国内外近一个多世纪以来有关白僵菌属种的分类研究历史、分类研究方法以及6个白僵菌属种的形态特征予以概述,并简要介绍生物防治环境中避免白僵菌交叉感染家蚕的监测鉴定方法,以期为开展相关白僵菌的分类鉴定和对白僵菌杀虫剂使用的安全性评价及降低给养蚕生产造成危害的风险性提供参考。     

一株家蚕病原白僵菌的鉴定及人工生产白僵蚕初探

白僵蚕作为传统中药材被用于治疗多种疾病,因此筛选应用于白僵蚕人工培养的优良白僵菌具有重要的实践意义。从僵蚕分离获得一株白僵菌,经形态学观察和菌株rDNA ITS的系统发育分析,鉴定为球孢白僵菌(Beauveria bassiana),命名为Beauveria bassiana GX-1。进一步研究菌株的营养生长量、产孢时间、产孢量等与致病力相关的部分生物学特性。结合不同浓度的白僵菌孢子悬浮液对家蚕5龄起蚕幼虫接种的致死率和2次中试试验的结果,确认人工生产白僵蚕孢子的接种量应为1×10~7个/mL,致死率达到95%以上。2次中试产品经HPLC法测定其草酸铵质量分数分别为6.26%和6.00%,物理和化学指标均达到《中华人民共和国药典》标准。研究结果为人工培养白僵蚕,提高白僵蚕的产量和品质奠定了实验基础。     

球孢白僵菌对小亚璃眼蜱的毒力测定及其孢外水解酶活性分析

球孢白僵菌作为一种很重要的生防真菌，已被广泛用于农业害虫和蜱的防治。在侵染宿主的同时，球孢白僵菌分泌大量孢外水解酶，如孢外蛋白酶和几丁质酶。这些酶类不但能够降解宿主表皮，而且被认为是菌株致病性的关键决定因子。为获得高毒力菌株的筛选方法，选取实验室分离鉴定的5株球孢白僵菌菌株，通过测定菌株的孢外水解酶活性和菌株对小亚璃眼蜱的致死率，并对球孢白僵菌的毒力和酶活性进行了相关性分析。结果显示，菌株蛋白酶活性与菌株毒力无相关性，菌株几丁质酶活性与菌株毒力呈现负相关性。本研究为蜱生防高毒力菌株的筛选以及酶活性的初步分析提供了理论依据。     

球孢白僵菌侵染对桑天牛幼虫血淋巴游离氨基酸含量的影响

为了探讨球孢白僵菌对桑天牛的致病机制,用高效液相色谱仪对感染球孢白僵菌后的桑天牛幼虫血淋巴游离氨基酸含量变化进行了测定与分析。在用球孢白僵菌处理后不同时间段的桑天牛幼虫血淋巴中,氨基酸含量呈规律性变化:白僵菌侵入1 d,桑天牛幼虫血淋巴中的游离氨基酸总量呈下降趋势,而侵入4~5 d,游离氨基酸总量又逐渐上升;受感染桑天牛幼虫血淋巴中的17种游离氨基酸含量变化不同,其主要氨基酸中的赖氨酸、酪氨酸、精氨酸、丝氨酸和氨基酸总量的变化趋势一样,先下降后上升,即是影响氨基酸总量变化的主要氨基酸种类。     

家蚕消化液中抗病毒因子的研究进展

家蚕是一种鳞翅目的模式昆虫,具有重要的经济价值和科研价值。家蚕幼虫容易遭受病原体的侵染,其中以病毒病的危害最为严重。中肠在家蚕先天性免疫中起着重要的作用,是抵御病原体的第一道天然屏障。从家蚕的消化液中发现并分离出许多抗病毒物质。通过讨论病毒对家蚕的感染模式以及消化液中的抗病毒因子的研究进展进行综述,为抗病毒免疫的进一步研究以及其他生物的病毒病研究提供参考。     

球孢白僵菌侵染对桑天牛幼虫解毒酶活性的影响

为明确球孢白僵菌(Beauveria bassiana)对桑天牛(Apriona germari Hope)的致病机制,探讨了球孢白僵菌侵染对桑天牛幼虫解毒酶系的影响,对用球孢白僵菌处理后不同时间桑天牛幼虫体内羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶和乙酰胆碱酯酶活性进行了测定。结果表明球孢白僵菌对上述3种酶的活性有显著影响,其中对羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响,均表现出先刺激后抑制的作用;而对乙酰胆碱酯酶活性的影响则呈先抑制后激活再抑制再激活的趋势。     

家蚕病原血清学研究进展

血清学技术是建立在抗原抗体特异性反应基础上的检测技术,它具有极高的特异性与敏感性,是实验诊断病原感染和鉴定病原的重要手段,也是研究病原的重要方法,已在人和动植物的病理研究与诊断中得到广泛应用.在节肢动物的病理学中,血清学技术对于病原体的检测、鉴定等发挥了重大作用.50年代末期,血清学方法已被成功的应用于昆虫病毒的研究.60年代末,我国学者曾用家蚕质型多角体病毒的多角体(CPB)抗血清,鉴别了两种多角体形状的CPV(CPV-T和CPV-H)之间的相互关系.以后,国内外学者又相继对家蚕的其它各种病原进行鉴定、定位和早期诊断研究,促进了对家蚕病原研究的深入.现在,血清学技术已被广泛的应用于家蚕质型多角体病毒(CPV)、病毒性软化病病毒(FV)、浓核病毒(DNV)等病毒病的研究与诊断.除此之外,也被应用于白僵菌和黄僵菌等真菌病原以及微粒子孢子等原虫病原的研究.     

白僵菌菌株的分离鉴定及生物学特性研究

以9株白僵菌菌株为材料,对其进行鉴定并探讨了菌株的生物学特性。结果表明,有2株为卵孢白僵菌,7株为球孢白僵菌;以营养生长量、产孢量、抗紫外线能力和致病力等生物学指标进行综合比较筛选,球孢白僵菌B1为生产白僵蚕的最佳接种菌株。     

球孢白僵菌对鸡皮刺螨体外杀灭效果试验

为了评价球孢白僵菌对鸡皮刺螨的杀灭效果,设计1×10⁹(A组)、1×10⁸(B组)、1×10⁷(C组)、1×10⁶(D组)等不同浓度球孢白僵菌对各100只鸡皮刺螨进行体外杀灭效果试验,并设生理盐水作为对照组。结果 10 d内A组、B组、C组、D组及对照组死亡成虫数量分别为94.333±2.082只、95.000±1.000只、43.667±0.577只、42.667±1.508只、以及20.667±2.080只。四组的致死中时(LT₅₀)分别为5.70 d、5.57 d、9.78 d和10.02 d。结果表明A组和B组对鸡皮刺螨有较好的体外杀灭效果,C组和D组有一定的杀灭效果,试验结果可为临床上用球孢白僵菌驱杀鸡皮刺螨提供依据。     

球孢白僵菌对鸡皮刺螨临床应用效果观察

鸡皮刺螨是中小型蛋鸡场常见的一种体外寄生虫，以往养殖户都采用有机磷农药或其他兽药进行防控，对人畜有一定的毒副作用。为验证球孢白僵菌对鸡皮刺螨的临床应用效果，对患病鸡群分别采用球孢白僵菌和辛硫磷进行杀虫效果对比试验。结果 A组（球孢白僵菌组）用药后5 d、10 d、15 d和20 d时螨虫减少率分别为59.6%、74.1%、76.6%和82.7%,B组（辛硫磷组）用药后5 d、10 d、15 d、20 d时螨虫减少率分别为86.8%、85.2%、85.4%和75.1%，两组在用药后10 d、15 d、20 d时螨虫减少对比无明显差异。结果显示球孢白僵菌对鸡皮刺螨具有较好驱杀效果。     

家蚕组织蛋白酶L及其特异性抑制剂基因参与微生物诱导蚕体的免疫响应研究

给家蚕5龄第3天幼虫分别注射藤黄微球菌(革兰阳性菌)和球孢白僵菌(真菌)进行诱导处理,利用已登录的家蚕组织蛋白酶L基因Bm Cts L(Gen Bank登录号:S77508.1)和Bm Cts L特异性抑制剂基因Bm Cts LI(Gen Bank登录号:AJ131752)的全长序列设计引物,实时荧光定量PCR检测微生物入侵后家蚕组织中Bm Cts L和Bm Cts LI基因的时空表达变化及协同反应,分析Bm Cts L酶活性变化与家蚕对微生物入侵免疫响应的相关性。家蚕的血细胞与脂肪体是微生物入侵后Bm Cts L和Bm CtsLI基因出现表达变化的主要组织,其中经藤黄微球菌诱导后,血细胞中的Bm Cts L基因响应最快,且基因mRNA转录水平极显著上调,脂肪体中的Bm Cts LI基因mRNA转录水平也极显著上调。微生物入侵后蚕体组织中Bm Cts L与Bm Cts LI基因的表达变化存在时间差异,其中Bm Cts L基因先于Bm Cts LI基因上调表达,推测Bm Cts LI基因通过对微生物入侵的协同反应调控BmCts L酶活性变化。藤黄微球菌比球孢白僵菌能更快诱导Bm Cts L和Bm Cts LI基因的表达变化;2种微生物诱导下蚕体血细胞中的Bm Cts L酶活性不仅上升快,而且明显高于其他组织。上述结果提示Bm Cts L和Bm Cts LI可能与家蚕的先天免疫相关,并且佐证了家蚕的血细胞在微生物入侵后能比其他组织更快速地产生免疫响应。