我国抗ALS类除草剂油菜种质创制与研究进展

化学除草是控制田间草害的有效手段,但我国油菜化除面积非常有限。创制对特定除草剂具有选择抗性的油菜新种质,选育抗性品种是实现我国油菜化除的有效途径。乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase,ALS) 类除草剂具有高效低量、选择性强、杀草谱广等优点,在生产上得到广泛应用。本文简述了ALS 基因及其突变产生抗性的机制,着重介绍我国基于ALS靶酶突变的抗除草剂油菜种质创制、抗性生理生化和分子机理等方面的研究进展,并探讨了抗除草剂新种质在油菜抗性新品种选育、杂交油菜制种及抗性基因在转基因工程中的应用。     

抗除草剂油菜研究及其进展

分析了抗除草剂油菜研究的意义，对油菜除草剂抗性的3个来源、抗除草剂油菜研究进展进行了简要评述。指出了其生产应用可能存在的问题及进一步研究的方向。     

甘蓝型油菜抗草甘膦基因遗传转化及抗性鉴定

为自主研发抗除草剂的甘蓝型油菜,从细菌（Isotericola variabilis）中克隆I.variabilis-EPSPS*基因,使油菜产生草甘膦抗性。通过农杆菌介导法将I.variabilis-EPSPS*转入甘蓝型油菜自交系育127,获得转I.variabilis-EPSPS*基因单株E₁。草甘膦耐受性结果表明,转I.variabilis-EPSPS*基因T₁代在不同浓度草甘膦的培养基中能够正常生长,而非转基因对照生长严重受阻。I.variabilis-EPSPS*成功整合于油菜基因组并可稳定遗传,草甘膦处理后表达量增加,而且在草甘膦浓度改变时仍保持稳定表达。在温室用41%草甘膦异丙胺盐商品制剂（农达）600倍稀释液（1/3田间生产推荐中剂量）处理转I.variabilis-EPSPS*基因E₁的T₁植株,体内莽草酸累计量远低于非转基因对照。通过对角果长、每角果粒数和千粒重等农艺性状考察发现,转基因植株和对照相比无显著性差异。田间喷施农达400倍液（1/2田间生产推荐中剂量）,发现转基因E₁T₁植株正常生长而对照全部死亡。鉴于I.variabilis-EPSPS*基因在转基因油菜中能够稳定遗传并赋予了油菜草甘膦除草剂抗性,认为该抗草甘膦转基因油菜是一份新种质。     

油菜抗除草剂突变体的筛选及其鉴定

利用60Co-γ射线辐照的湘油15油菜种子,以Basta溶液为筛选压在油菜无性系中筛选出了抗除草剂突变体,随后通过打孔叶片抗性鉴定、除草剂喷洒鉴定等方法确定抗性。最后利用SRAP分子标记方法进行鉴定,从而为突变体的真实性提供了分子水平上的证据。     

转bar基因抗草铵膦油菜对草铵膦抗性的评价

为评价抗草铵膦转基因杂交油菜对草铵膦的抗性,以转bar基因抗草铵膦杂交油菜“7748”为材料,在2个密度水平和4种除草剂下,以油菜单株鲜重、株高、单株叶面积、净光合速率、SPAD值、全株角果数、每角粒数、千粒重等为指标,研究了草铵膦及其对照药剂对抗草铵膦转基因杂交油菜生长、产量及产量构成、品质的影响.结果表明,草铵膦处理后4d之内油菜叶绿素相对含量、净光合速率极显著低于对照,15d左右内油菜单株鲜重、单株叶面积极显著低于对照,20 d左右内油菜株高极显著低于对照,但药后1个月左右均超过对照.密度间、密度与除草剂交互作用差异显著,密度间以高密度的平均产量最高,除草剂间以草铵膦处理的平均产量最高.草铵膦处理后,油菜全株角果数有所下降,但角粒数、千粒重提高.转基因杂交油菜对草铵膦有较强的抗性,草铵膦对转基因杂交油菜安全并能稳定增加其产量,可应用于生产.     

油菜新种质12WH318咪唑啉酮抗性遗传及基因克隆和表达

研究油菜新种质12WH318咪唑啉酮抗性,为其利用提供理论基础。对亲本、F1、F2和BC1世代研究结果显示,油菜种质12WH318的咪唑啉酮抗性由1对核基因控制,无细胞质效应,呈完全显性遗传。已有研究显示,咪唑啉酮类除草剂的作用靶标是乙酰乳酸合成酶(ALS)。应用同源序列法,从抗性种质12WH318和3个非抗性种质中获得油菜Bn ALS基因家族中的Bn ALS1﹑Bn ALS2和Bn ALS3。比对Bn ALS1和Bn ALS3的核苷酸和氨基酸序列后发现,12WH318的Bn ALS1基因发生点突变致使蛋白序列的第638位丝氨酸(AGT)残基被天冬酰胺酸(AAT)所替代。对Bn ALS1和Bn ALS3基因进行相对表达量分析发现,除草剂处理1d后叶片中的Bn ALS1和Bn ALS3基因表达量急剧升高,在除草剂处理7d后Bn ALS1基因表达量显著低于清水对照,而Bn ALS3基因表达量与清水对照无显著差异。研究认为,12WH318的咪唑啉酮抗性可能主要由Bn ALS1基因控制。     

抗多菌灵的芒果炭疽病菌的杀菌剂筛选及其交互抗性测定

为筛选抗多菌灵的芒果炭疽病菌的杀菌剂,采用生长速率法测定23种杀菌剂对8株抗、感多菌灵的芒果炭疽病菌(Colletotrichum gtoeosporioides Penz.)的室内毒力.通过EC50值、EC90值及杀菌剂间的交互抗性测定等综合分析表明:对芒果炭疽病菌毒力最强的杀菌剂是咪鲜胺,其平均EC50值和EC90值分别为0.04、0.21μg/mL;苯醚甲环唑、丙环唑、吡唑醚菌酯、氟硅唑、氟硅唑·恶唑菌酮、戊唑醇、腈菌唑和多抗霉素对芒果炭疽病菌的毒力也较强,与多菌灵不存在交互抗性,这9种杀菌剂均可作为防治芒果炭疽病的首选杀菌剂.另外,三唑酮、异菌脲、三环唑和代森锰锌也有较好的抑菌效果,可用于芒果炭疽病的防治.通过交互抗性分析,在苯并咪唑类杀菌剂之间,苯并眯唑类杀菌剂与烯唑醇,嘧菌酯、醚菌酯与腈菌唑·醚菌酯,嘧菌酯、醚菌酯与三唑酮,苯醚甲环唑与氟硅唑·恶唑菌酮之间存在交互抗性;而百菌清与嘧菌酯、醚菌酯和腈菌唑·醚菌酯,恶霉灵与嘧菌酯、醚菌酯、腈菌唑·醚菌酯和三唑酮之间存在负交互抗性.     

甘蓝型油菜全基因组DELLA蛋白基因家族的鉴定和表达分析

DELLA蛋白是参与赤霉素调控途径的关键因子,对调节植物的生长发育具有重要的作用。为了揭示甘蓝型油菜中DELLA蛋白家族的分布和特征,利用生物信息分析了家族成员、序列特征、进化关系和组织表达。结果表明,甘蓝型油菜中有13个DELLA蛋白基因,被定位到8条染色体和2条随机序列（chrC09_random和chrCnn_random）上;系统进化树分析发现,该家族被聚为4个亚家族,第一亚家族含有7个基因,第二、三和四亚家族各包括2个基因; DELLA基因呈组织特异性表达,其中BnaA10g17240D、BnaC09g40420D、BnaCnng68300D和BnaC05g47760D在各组织中表达都相对较高,在茎中BnaA06g34810D、BnaA09g18700D和BnaC09g52270D表达最高。本研究为后续基因的功能研究提供参考。     

转bar基因油菜对非选择性除草剂草丁膦的抗性研究

比较转bar基因油菜742R和普通油菜742对非选择性除草剂草丁膦(PPT)的抗性差异。通过田间浓度梯度试验和测定叶片谷氨酰胺合成酶(G S)活性,研究转bar基因油菜742R和普通油菜742对PPT的抗性差异及机理。结果发现普通油菜742子叶期、苗期、蕾期、花期和结果期PPT最低致死浓度分别为0.15%,0.15%,0.25%,0.3%和0.4%,而转bar基因油菜742R子叶期和苗期PPT最低致死浓度分别达2.5%和3.0%,约为普通油菜的20倍,蕾期、花期和结果期当PPT浓度达到30%时植株也未全部死亡,是普通油菜的100倍以上。叶片G S活性测定结果表明,正常生长的742R的G S活性比742高10%左右,PPT处理后,转bar基因油菜742R的G S活性降低20%左右,3 d后基本恢复正常,普通油菜742的G S活性降低90%以上,处理后第3天活性丧失。转bar基因油菜对PPT的抗性比普通油菜高20倍以上。     

花生荚壳抗黄曲霉菌侵染的鉴定方法研究及抗性种质发掘

        黄曲霉毒素污染是影响花生食用安全性和制约产业发展的重要因素。荚壳是花生抵御黄曲霉菌侵染的第一道防线,为建立花生荚壳抗黄曲霉侵染的鉴定方法,本研究利用强侵染黄曲霉菌AF2202接种花生荚果,通过对不同接种菌浓度和培养时间的比较分析,发现接种浓度为2 ×106孢子/mL、培养7d的组合方案可以有效区分花生荚壳对黄曲霉菌侵染的抗性。利用所建立的鉴定方法对276份遗传变异丰富的花生核心种质材料进行接种鉴定,进一步证明了这一方法鉴定花生荚壳抗性的有效性和实用性,初步发掘出2份具有荚壳抗性的特异花生种质。     

油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位、原核表达及其酶活分析

为了研究油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位与酶学特性,以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）品系N131为材料,采用RT-PCR法克隆到BnALS3的cDNA序列。该序列含有一个长度为1 959bp的开放阅读框,编码蛋白为652个氨基酸,在N端含有一个由49个氨基酸残基组成的叶绿体信号肽序列。将该信号肽序列构建至植物表达载体35S:: BnALS3-GFP,利用拟南芥原生质体细胞进行瞬时表达,结果显示BnALS3蛋白定位在叶绿体中。构建去除叶绿体信号肽序列的BnALS3原核表达载体pCzn1-BnALS3,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE和Western Blot检测显示,在11℃条件下以终浓度为0.2mmol.L-1的IPTG诱导8h后,pCzn1-BnALS3基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白His-BnALS3呈部分可溶性,分子量约为67kD。酶活分析表明,原核表达的His-BnALS3最适反应pH值为7.0,最佳反应温度为37℃,酶学常数Km值和Vmax值分别为6.55 mmol·L-1和6.40μmol·mg-1·h-1。     

39份外引小麦种质的抗叶锈病基因检测及其抗性鉴定

为明确39份外引小麦种质的抗叶锈病基因组成,利用与抗病基因紧密连锁或共分离的分子标记对抗叶锈病基因进行检测,并结合田间接种鉴定对种质材料的叶锈病抗性进行评价。结果表明,抗叶锈病基因Lr1、Lr10、Lr20、Lr24、Lr26、Lr34、Lr37和Lr38在39份种质中均有分布,频率分别为30.77%、17.95%、2.56%、5.13%、12.82%、30.77%、23.08%和5.13%,其中携带Lr24和Lr38的种质抗性良好。Lr34和Lr37单独存在时,种质对叶锈病的抗性分别表现为中感和高感,两者聚合时能够提高载体种质的抗性水平,表现为中抗。此外,4份种质材料(KPL-1、OK.95571、莫斯科39和非黑土地24)对叶锈病的抗性表现突出,均达到0;级,是抗叶锈病育种的重要抗源,其中KPL-1和OK.95571分别携带3个和5个抗叶锈病基因;莫斯科39和非黑土地24仅携带Lr1,推测这两份材料含有其他未检测的抗叶锈病基因。综上,较多的抗叶锈病基因聚合有利于提高种质的叶锈病抗性。     

油菜防卫素和草酸氧化酶基因的克隆与诱导表达水平研究

基于拟南芥、甘蓝及油菜等的植物防卫素(PDF)相关基因序列和已克隆的油菜草酸氧化酶(OXO)基因序列设计PCR引物,对甘蓝型油菜基因组DNA进行扩增,获得了序列大小分别为470bp和629bp的PDF1.2和OXO.生物信息学分析表明,该PDF1.2和GenBank中的相关基因同源性在42%～71%,OXO和GenBank中的相关基因同源性在70%以上.在油菜苗期,油菜黑胫病病原接种后基因PDF1.2表达量增加3倍以上,基因OXO也有不同程度的增强表达;诱导剂acibenzolar-s-methyl诱导基因OXO增强表达,但不能诱导PDF1.2增强表达.诱导的系统表达(非处理叶)高于局部表达(处理叶).这是首次报道油菜PDF1.2克隆和诱导表达结果.     

广谱抗稻瘟病种质75-1-127的褐飞虱抗性基因鉴定及分子标记辅助选择育种

【目的】水稻品系75-1-127携带广谱抗稻瘟病基因Pi9,已被广泛应用于抗稻瘟病水稻品种改良。笔者育种实践发现75-1-127表现出较强的褐飞虱抗性,因此鉴定该品系中的褐飞虱抗性基因并进行分子辅助选择育种。【方法】根据水稻品系B5中褐飞虱抗性基因Bph14和Bph15的序列,设计引物扩增75-1-127的基因组DNA,并对PCR产物进行测序分析。采用苗期集团法鉴定了75-1-127和B5的褐飞虱抗性表型。利用与Bph14与Bph15连锁的分子标记筛查了75-1-127为稻瘟病抗源回交转育的两系不育系后代,并鉴定了这些后代的稻瘟病抗性、褐飞虱抗性和主要农艺性状。【结果】75-1-127中含有与B5完全一致的Bph14和Bph15序列。75-1-127和B5苗期褐飞虱抗性均为1级。在以75-1-127为抗源改良的两系不育系中,携带Bph14、Bph15的单基因系或双基因系的褐飞虱抗性均得以改良,其中双基因聚合系的死苗率为8.5%,与供体亲本75-1-127以及阳性对照B5差异不显著,进一步证实75-1-127含有褐飞虱抗性基因。【结论】水稻品系75-1-127携带褐飞虱抗性基因Bph14和Bph15,可以作为抗源应用于水稻褐飞虱抗性育种。     

茶树CLH基因家族的鉴定与转录调控研究及其在白化茶树中的表达分析

叶绿素酶（Chlorophyllase,CLH）是叶绿素降解过程中的关键酶,将叶绿素a脱去植醇,形成脱植基叶绿素a。以白化茶树白鸡冠新梢叶片为材料,克隆获得3条CsCLHs基因cDNA全长序列,并进行生物信息学分析。结果表明,3条CsCLHs基因分布于2个亚家族,其蛋白质编码区（Coding sequence,CDs）长度为894~975 bp,编码氨基酸个数为297~324,蛋白质分子量为31.99~34.91 kDa,等电点为4.89~7.61,不稳定系数为38.94~48.24,其中CsCLH1.1和CsCLH1.2为不稳定蛋白,CsCLH2为稳定蛋白。Cell-PLoc亚细胞定位预测结果表明,3个CsCLHs蛋白均定位于叶绿体;而WolfPsort亚细胞定位预测结果显示,CsCLH1.1和CsCLH1.2定位于细胞质,CsCLH2定位于叶绿体。遮阴和恢复光照处理下的qRT-PCR结果显示,遮阴抑制白鸡冠叶片CsCLHs的表达,光照诱导白鸡冠叶片CsCLHs的表达。不同品种中CsCLHs表达模式分析表明,CsCLH1s在白化叶中高表达。另外,酵母单杂交结果表明,CsCDF5可以与CsCLH1.1和CsCLH2启动子结合。综上所述,CsCLHs在白化茶树叶片中可能参与叶绿素降解,在叶片白化过程中发挥重要作用,结果可为进一步探究茶树CLH基因家族的功能及茶树叶片白化机理提供参考。