朱砂叶螨几丁质酶TecCht2基因的克隆及特征分析

【目的】拟克隆朱砂叶螨几丁质代谢中的关键基因几丁质酶基因,并对其进行特征分析。【方法】利用转录组拼接技术对朱砂叶螨转录组进行拼接,根据叶螨几丁质酶序列通过BLAST找到朱砂叶螨几丁质酶相似序列,设计PCR引物,进行朱砂叶螨几丁质酶基因克隆,分析其详细特征。利用SWISS MODEL预测其蛋白结构,特别是催化功能区的结构。【结果】测序分析确认为朱砂叶螨几丁质酶基因序列,并提交到GeneBank(KY705296),其开放阅读框为1 875bp,编码624个氨基酸,C端有几丁质结合区。根据新的几丁质酶分类,判定TecCht2为Ⅵ型几丁质酶,其结构具有典型的几丁质酶结构特征。【结论】本研究克隆得到的朱砂叶螨几丁质酶基因,为今后几丁质酶功能和用于害螨防治研究奠定基础。     

朱砂叶螨

朱砂叶螨又叫红蜘蛛，属于蜘蛛纲真螨目叶螨科。食性杂，可为害多种作物，主要为害茄子、辣椒、番茄、黄瓜、豆类、马铃薯等，以保护地蔬菜受害重，也是棉花及花卉上的重要害虫。成螨、若螨群集在叶背面吸食植物汁液，一般先     

朱砂叶螨烟碱型乙酰胆碱受体α4亚基基因的克隆与序列特征分析

烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)是一种对神经递质乙酰胆碱起快速反应的激动剂门控离子通道,也是新烟碱类杀虫剂的作用靶标。此研究利用同源克隆结合RACE技术,从朱砂叶螨敏感品系中克隆了一条nAChR基因,全长为2 023bp,开放阅读框长1 635bp,编码544个氨基酸。预测分子量(Mr)为62.20kDa,等电点(pI)为5.00。根据同源性及系统发育分析,将其命名为Tcα4,提交至NCBI数据库,获得GenBank登陆号为KP694228。Tcα4具有nAChRα亚基典型结构特征:N端胞外结构域和C端跨膜结构域。Tcα4与二斑叶螨nAChRα4亚基基因序列同源性高达98.71%,与二斑叶螨其他nAChR亚基基因同源性仅在20.07%~43.16%之间,与其他昆虫nAChRα4亚基基因同源性在45.96%~56.07%之间。系统发育分析结果表明朱砂叶螨与二斑叶螨和肩突硬蜱nAChRα4亚基基因在同一分支,与其他昆虫nAChRα4亚基基因则较远。朱砂叶螨nAChRα4亚基基因的克隆为朱砂叶螨其他nAChR亚基基因的研究及以nAChR为作用靶标的新型杀螨剂的研究提供了一种新途径,奠定了基础。     

二斑叶螨与朱砂叶螨在棉花上的种间竞争力

通过比较二斑叶螨(Tetraychus urticae Koch)和朱砂叶螨(T.cinnabarinus Boisduval)以棉花为寄主时,单种种群和混合种群数量动态及内禀增长力(rm)值来确定2种叶螨竞争力的大小.结果表明:2种叶螨试验单种种群的活动虫态数量动态曲线均在第38天达到峰值,两者的单种种群达到峰值时活...     

朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3基因克隆及表达特征分析

[目的]拟克隆朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3并对其进行表达特征分析.[方法]采用同源基因克隆技术克隆TecCDA3,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达特征.[结果]成功克隆朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3 (GenBank No.MK779705),其开放阅读框长度为1 611 bp,共编码536个氨基酸,含有3种结构域,根据同源性和发育树分析判定其属于几丁质脱乙酰基酶家族Group Ⅱ.TecCDA3在成螨时期表达量最高,在幼螨时期表达量最低,呈现先下降后升高的表达趋势.[结论]克隆得到朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3并对其表达特征进行分析,丰富朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶基因家族.     

朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA5基因克隆及表达特征分析

[目的]探明朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶家族的功能.[方法]克隆基因TecCDA5a、TecCDA5b、Tec-CDA5c,并运用实时荧光定量PCR技术进行表达特征的分析.[结果]克隆几丁质脱乙酰基酶基因TecCDA5a、TecCDA5b、TecCDA5c (GenBank:MK813905、MN852245.1、MK813906);TecCDA5的最高表达水平是在成螨期,而最低的表达水平是在幼螨期,呈现先跌后升的趋势;同源性比较和发育树分析证实,TecCDA5属于几丁质脱乙酰基酶Group Ⅳ.[结论]获得朱砂叶螨TecCDA5s,明确了其在螨不同发育时期差异性表达特征,为以CDA为靶标设计新型dsRNA杀螨剂提供依据.     

朱砂叶螨精子的超微结构及形成过程

朱砂叶螨精子染色质高度浓缩，无核包被、鞭毛和顶体结构，精子内部无线粒体和核糖体。精子双层膜厚度为００１５～０．０２５μｍ，精细胞管状膜的高度和宽度分别是０．２５～１．３３μｍ和０．０２５～０．０３３μｍ，精子和核直径分别为１．３～１．５μｍ和０．６～０．７μｍ。精子形成时，首先精子内核物质分散，有包被，无管状膜内陷；然后管状膜内陷，放射状；接着管状膜内隐不断扩展成为小囊泡状，核物质集中在中央，核包     

朱砂叶螨V-ATP酶H亚基基因克隆及特征分析

【目的】为了寻找有效防治朱砂叶螨的生物学方法。【方法】克隆朱砂叶螨V-ATPaseH基因,对该基因序列进行生物学特征分析;采用实时荧光定量PCR技术对V-ATPaseH进行不同时期表达特征分析。【结果】成功克隆V-ATPaseH基因(GenBank登陆号：OQ834270),基因全长1 540 bp,阅读开放框为1 475 bp,编码491个氨基酸;V-ATPaseH在朱砂叶螨的卵、幼螨、若螨、成螨4个时期均有表达。其中以朱砂叶螨成螨时期表达量最高,其次是若螨、卵,幼螨时期表达量最低。【结论】克隆得到朱砂叶螨V-ATPaseH基因,明确其不同时期的表达特征,为今后研究以V-ATP酶为靶标的新型生物农药杀螨剂研制奠定基础。     

二斑叶螨与朱砂叶螨在四季豆上种间竞争力研究

对二斑叶螨与朱砂叶螨在以四季豆为寄主时的种间竞争进行了研究。结果表明：无论单种种群还是混合种群。二斑叶螨的活动虫态和成虫的内禀增长力均高于朱砂叶螨,这表明在以四季豆为寄主植物时,二斑叶螨比朱砂叶螨具有更强的种问竞争力。     

朱砂叶螨抗药性测定及防治

玻片法测定表明，朱砂叶螨对三氯杀螨醇，水胺硫磷，克螨特的抗药性为３．６６－３９．７７倍。温室，大棚内的冬秧等寄主上越冬的个体达９２．６６％；每年有４－５个危害高峰，种群高峰出现在种群增长高峰后７－１０天。中雨，大雨，暴雨对种群增长有抑制作用。     

Joint Acaricidal Action of Diafenthiuron and Fenbutatin-oxide Against Tetranychus cinnabarinus （Boisduval） （Acari： Tetranychidae）

[Objective]This study was conducted to obtain a new high-efficiency acaricide mixture.[Method]The synergism acaricidal of diafenthiuron and fenbutatin-oxide against carmine spider mite was investigated,and the optimal ratio of both acaricides were determined by means of co-toxicity factors and co-toxicity coefficients（CTC）.[Result]At 24 h post-treatment,the LC50values of diafenthiuron and fenbutatin-oxide against T.cinnabarinus female adults were 154.67 and 93.26 mg/L,respectively,and the synergistic mass ratios of diafenthiuron and fenbutatin-oxide ranged from 1：0.06 to 1：0.87,and the optimal diafenthiuron-to-fenbutatin-oxide ratio was 1：0.39 with the LC50and CTC of 67.87 mg/L and 188.93（CTC significantly above 100 strongly indicated synergism）,respectively,and the toxicity relative to diafenthiuron and fenbutatin-oxide was 2.28 and 1.37 times,respectively.[Conclusion]The joint acaricidal action of diafenthiuron and fenbutatin-oxide strongly indicates synergism.These findings proved scientific theoretical basis for mixing diafenthiuron and fenbutatin-oxide to control spider mites and developing a new synergisic acaricide.     

Joint Acaricidal Action of Diafenthiuron and Fenbutatin-oxide Against Tetranychus cinnabarinus(Boisduval)(Acari: Tetranychidae)

[Objective]This study was conducted to obtain a new high-efficiency acaricide mixture.[Method]The synergism acaricidal of diafenthiuron and fenbutatin-oxide against carmine spider mite was investigated,and the optimal ratio of both acaricides were determined by means of co-toxicity factors and co-toxicity coefficients(CTC).[Result]At 24 h post-treatment,the LC50values of diafenthiuron and fenbutatin-oxide against T.cinnabarinus female adults were 154.67 and 93.26 mg/L,respectively,and the synergistic mass ratios of diafenthiuron and fenbutatin-oxide ranged from 1:0.06 to 1:0.87,and the optimal diafenthiuron-to-fenbutatin-oxide ratio was 1:0.39 with the LC50and CTC of 67.87 mg/L and 188.93(CTC significantly above 100 strongly indicated synergism),respectively,and the toxicity relative to diafenthiuron and fenbutatin-oxide was 2.28 and 1.37 times,respectively.[Conclusion]The joint acaricidal action of diafenthiuron and fenbutatin-oxide strongly indicates synergism.These findings proved scientific theoretical basis for mixing diafenthiuron and fenbutatin-oxide to control spider mites and developing a new synergisic acaricide.     

Studies on Acaricidal Bioactivities of Artemisia annua L. Extracts Against Tetranychus cinnabarinus Bois. （Acari： Tetranychidae）

The aim of this study was to determine the best extraction technique, the most suitable solvent, the optimal plant parts, and the acaricidal activities of Artemisia annua L. The petroleum ether （30-60℃）, petroleum ether （60-90℃）, ethanol, acetone, and water parallel and sequenced extracts were obtained from the leaves, stems and roots of different period of A. annua L. in April, May, June, July and September respectively. And then the acaricidal bioactivities against Tetranychus cinnabarinus of all extracts were determined by the slide-capillary method in the laboratory. The results indicated that the acaricidal bioactivities elevated as the development of A. annua plant at the concentration of 5 mg mL-L The general tendency exhibited the sequence of July 〉 June 〉 May 〉 April, but September decreased comparing to July. However, the most effective extracts in five months were all acetone parallel extract of A. annua leaf, and the corrected mortalities treated after 48 h ranged from 74 to 100%. The median lethal concentrations （LC50） against T. cinnabarinus of acetone parallel extracts ofA. annua leaves in September, July, June, May and April were 0.5986, 0.4341, 0.8376, 0.9443 and 1.3817 mg mL^-1, respectively, treated after 48 h. The 13 groups were isolated from acetone extracts ofA. annua leaves in July by column chromatography, both the 1 lth and 12th groups exhibited strong bioactivities. The median lethal concentrations of the 1 lth and 12th groups against T. cinnabarinus were 0.3683 and 0.1586 mg mL^-1, respectively. The acetone parallel extract ofA. annua leaf in July was the most toxic to T. cinnabarinus and the corrected mortality was 100% after 48 h. The acetone parallel extract of the 1 lth and 12th groupswere the most active components, acted as the emphases in further study.     

抗药性朱砂叶螨实验种群生命表参数研究

系统观察了朱砂叶螨抗甲氰菊酯品系和敏感品系实验种群在26℃下的生长发育和生殖情况，并通过组建2品系的生命生殖力表，用种群生命表参数分析抗性种群与敏感种的生态适合度差异。实验结果表明抗甲氰菊酯品系(Rf)的发育历期和寿命缩短，产卵量下降。敏感品系平均寿命为35．3ld，平均每雌产卵量为185．00粒；抗性品系分别为29．58d，134．67粒。抗甲氰菊酯品系的净生殖率(R0=139．2147)显著低于敏感品系(R0=180．6388)。抗甲氰菊酯品系内禀增长率(rm)、周限增长率(λ)和种群加倍时间(p．b．t)分别为0．2272、1．255l和3.0508，并与敏感品系的内禀增长率、周限增长率和种群加倍时间差异不显著。     

黄花蒿提取物对朱砂叶螨生物活性的研究

 【目的】明确黄花蒿杀螨活性物质的最佳提取工艺;选择合适的溶剂和最佳的植株部位,明确黄花蒿杀螨活性物质的时间和空间分布状态,为综合开发利用黄花蒿提供科学依据。【方法】采集4、5、6、7和9月5个月份的黄花蒿植株,分成根、茎、叶3个部分,采用石油醚（30～60℃）、石油醚（60～90℃）、乙醇、丙酮和水溶剂的平行和顺序提取方法,共计获得135种提取物,用玻片毛细管法测定其对朱砂叶螨的杀螨活性。【结果】在杀螨活性方面,黄花蒿的杀螨活性随植株的生长呈增加的趋势,总体表现为7月份＞6月份＞5月份＞4月份,但9月份的杀螨活性与7月份相比有所下降。5个月份的黄花蒿叶丙酮平行提取物的活性都比其它提取物强,处理朱砂叶螨48 h的校正死亡率介于74%～100%之间。从对朱砂叶螨的致死时间动态上看,9月份、7月份、6月份、5月份、4月份黄花蒿叶的丙酮平行提取物对朱砂叶螨处理48 h,LC50分别为0.5986,0.4341,0.8376,0.9443和1.3817 mg•ml-1。对活性较高的7月份叶的丙酮提取物进行柱层析分离,得到13个组分,其中组份11和12的LC50分别为0.3683和0.1586 mg•ml-1,组分12的活性相对于七月份叶丙酮提取物而言提高了约5倍。【结论】黄花蒿7月份叶的丙酮提取物的毒力最好,5 mg•ml-1对朱砂叶螨处理48 h,校正死亡率为100%。7月份叶丙酮平行提取物柱层析组分11和12是活性组分,是进一步研究的重点。     

姜黄素和东莨菪内酯对朱砂叶螨形态变化和水分损失的影响

为明确植物源杀螨活性物质姜黄素和东莨菪内酯对朱砂叶螨的作用方式,测定了阿维菌素、哒螨灵、螺螨酯、姜黄素、东莨菪内酯对朱砂叶螨的毒力,并研究了药剂处理后朱砂叶螨的形态变化和水分损失.结果表明:阿维菌素、哒螨灵、螺螨酯、姜黄素和东莨菪内酯对朱砂叶螨的48hLC50分别为0.009 5,0.955,661.20,3 055.85和1 886.40mg/L;用各药剂的48hLC50质量浓度处理朱砂叶螨后发现,在形态上,经姜黄素和东莨菪内酯处理后其体长皱缩率在72h分别达到23.17%,19.46%,在168h分别达到35.94%,35.79%,与其他药剂和对照的差异具有统计学意义;在水分损失上,螺螨酯、姜黄素和东莨菪内酯处理后朱砂叶螨的水分损失率在96h内与其他药剂和对照相比差异具有统计学意义.该研究证实姜黄素、东莨菪内酯能够明显地影响朱砂叶螨的形态与体内水分含量,且两种药剂对朱砂叶螨的某些症状与神经毒剂和生长调节剂相似,其作用机理有待于下一步研究证实.     

二斑叶螨的实验种群密度效应研究

研究了二斑叶螨实验种群的密度效应。实验结果表明：二斑叶螨卵期不存在密度效应;幼、若螨期间存在密度效应,幼、若螨密度与其成活率明显相关,幼、若螨初始密度的增加导致死亡率增加,并且当代性比向偏雌方向发展,而子代性比向偏雄方向发展;不同成螨密度对成螨寿命和产卵量均有极显著差异。四季豆叶片上螨口密度大于2．5～3．5头／cm^2时,扩散量明显增加。     

二斑叶螨内参基因的筛选及解毒酶基因的表达水平

【目的】筛选二斑叶螨（Tetranychus urticae）敏感（SS）和抗甲氰菊酯品系（Fe-R）中合适的内参基因,并通过基因相对表达定量PCR研究二斑叶螨抗性品系解毒酶基因表达水平的变化。【方法】采用实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR,RT-qPCR）技术,分析二斑叶螨5.8S rRNA、α-tubulin、β-actin、ELF、GAPDH、RPL13a、SDHA和TBP共8个候选内参基因mRNA表达水平的稳定性,并分析二斑叶螨酯酶（Carboxyl/cholinesterases,CCEs）、谷胱甘肽转移酶（Glutathione s-transferase,GSTs）及细胞色素P450单加氧酶（Cytocheome P450 monooxygenases,P450s）等主要解毒酶基因相对表达量。用GeNorm和NormFinder软件进行内参基因稳定性评估,通过比较Ct值的方法进行基因相对表达量计算。【结果】8个内参基因中稳定性最高的为α-tubulin;以α-tubulin为内参基因,二斑叶螨Fe-R品系GSTs 基因TuGSTo1、TuGSTd1及P450s 基因CYP3D2相对表达量均显著高于SS品系,而CCEs 基因TuCCE1的表达量有所降低。【结论】在二斑叶螨SS和Fe-R品系中α-tubulin为理想的内参基因,RT-qPCR研究表明TuGSTo1、TuGSTd1和CYP3D2相对表达量的升高可能是二斑叶螨对甲氰菊酯产生高抗性的分子机理。