不同方法灭活卵黄抗体的比较试验

为确保提取卵黄抗体的安全性,防止其中混入外源病毒,为此使用了化学药品灭活的方法。试验对不同终浓度的甲醛和二乙烯亚胺(BEI)对卵黄抗体灭活效果进行了比对。将鸡新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV H9型)、禽传染性囊病病毒(IBDV)、减蛋综合征病毒(EDS-76)和禽脑脊髓炎病毒(AEV)分别混入到卵黄抗体中,混合后加入终浓度为0.03%、0.05%、0.1%甲醛和0.02%BEI于室温条件下,灭活24h,从试验结果我们可以看出0.02%BEI和0.03%甲醛只能灭活部分病毒,而0.05%和0.1%甲醛能灭活全部病毒,并且对抗体活性无任何影响。因此,综合以上结果选用0.05%的甲醛进行灭活,保证疫苗的安全性。     

甲醛灭活猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液的最佳条件研究

为探究甲醛对猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液最佳的灭活条件,本试验采用10％的甲醛溶液与猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗抗原液混匀,使甲醛终浓度分别达到0.05％、0.07％、0.10％、0.15％、0.20％,在4～8℃下经过不同时间的灭活,通过对灭活液不同时间点的无菌检验及灭活检验,综合判定灭活效果.结果显示...     

鸡新城疫-禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(La Sota株+HP株)的灭活试验

为了研究鸡新城疫-禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(La Sota株+HP株)中两种病毒的最佳甲醛灭活浓度和灭活时间,试验选取四种甲醛最终浓度0.1%、0.2%、0.4%、0.8%,分别对两种抗原进行灭活,在灭活10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、24 h、30 h、36h、42 h分别取样,对每个样品进行灭活检验和血凝价测定。从试验结果得出,新城疫病毒(La Sota株)最适合的甲醛浓度为0.1%,灭活时间为16 h;禽流感病毒(H9亚型HP株)最适合甲醛浓度为0.1%,灭活时间为18 h。     

二乙烯亚胺和甲醛对猫杯状病毒灭活效果比较研究

为比较二乙烯亚胺(BEI)和甲醛对猫杯状病毒(FCV)的灭活条件,采用终浓度分别为0.05%、0.1%、0.2%和0.3%的甲醛和终浓度分别为0.5%、1%、2%和3%的BEI在37℃对FCV灭活6、12、24、36、48 h,通过微量滴定法检测灭活病毒滴度变化,于F81细胞盲传3代验证病毒灭活效果,采用巢式PCR和ELISA法检测病毒抗原完整性。结果显示:37℃下作用48 h,1%、2%、3%的BEI和0.05%、0.1%、0.2%、0.3%甲醛均可灭活FCV。本研究结果可为FCV灭活疫苗的灭活工艺研究提供参考。     

四种不同灭活剂对新城疫病毒的灭活效果研究

为探索甲醛、β-丙内酯(BPL)、二乙烯亚胺(BEI)和盐酸聚六亚甲基胍(PHMG)对新城疫病毒(NDV)的最佳灭活条件,试验采用不同浓度梯度的甲醛、BPL、BEI和PHMG对NDV进行不同时间的灭活处理,通过血凝(HA)试验、无菌检验和灭活检验确定灭活效果。结果显示,37℃下,NDV的最佳灭活条件为0.1%～0.2%的甲醛灭活22～24h、0.02%～0.025%的BPL灭活9～10h、2%～3%的PHMG灭活16～20h,该研究为筛选规模化生产ND疫苗所需的理想灭活剂提供了依据。     

基于单克隆抗体捕获的猪血清和乳汁中PEDVIgA抗体间接ELISA方法的建立和评估

为快速准确地评价猪血清和乳汁中猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)IgA抗体水平,本研究从4株PEDV单克隆抗体中筛选得到1株可高效捕获PEDV全病毒粒子(灭活的病毒细胞培养原液)的特异性IgG单克隆抗体8A3,将其用作检测孔内的包被抗体以捕获病毒粒子制备抗原板,从而建立了用于检测母猪血清和乳汁中PEDV特异性IgA抗体的间接ELISA方法。该方法中,单克隆抗体8A3的最适包被浓度为6.0μg/mL,阴性判定临界值(D_(450 nm))为0.34,且在检测中不与常见的猪病毒阳性血清反应。与传统的免疫过氧化物酶单层检测(immuno-peroxidase monolayer assay,IPMA)相比,所建立的ELISA方法检测阳性和阴性血清的符合率分别为98.7%(152/154)和98.0%(145/148);检测初乳和乳汁样品的阳性和阴性符合率分别为100%(60/60)和95.8%(23/24);检测初乳和泌乳期样品中的IgA水平与中和效价的趋势高度相关(kappa=0.835)。本研究建立的检测PEDV IgA的间接ELISA方法灵敏度、敏感性和特异性与传统方法高度一致,可简化检测步骤,适用于大规模评价临床样本乳汁和血清中PEDV IgA抗体的快速检测。     

鸽新城疫四原材料病毒的灭活试验研究

经鸽新城疫ND-GS O1四原材料病毒的最佳灭活时间,最佳灭活温度以及甲醛浓度的试验研究,确定了0.1%甲醛在37 ℃条件下经过16 h,70 ℃的温度条件下经过20 min灭活病毒为最佳灭活方法,不仅能有效的完全灭活ND病毒,而且能使病毒的血凝活性保持在94%以上.     

猪流行性腹泻病毒间接ELISA抗体检测方法建立与应用

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是目前引起我国猪急性肠炎并水样腹泻的重要病原之一,但尚无商品化病毒血清抗体检测试剂盒。本研究以纯化的PEDV为包被抗原,通过优化ELISA反应条件,建立了间接ELISA抗体检测方法,其反应条件为:抗原最佳包被浓度为3μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶100,包被时间为37℃作用2 h,1.5%BSA 37℃封闭3 h,二抗1∶10 000稀释,37℃作用30 min,抗体临界值为OD450nm≥0.306判为阳性,OD450nm≤0.268判为阴性,介于二者之间为可疑。该方法检测6份已知PEDV阳性血清效价为1∶3 200,检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和口蹄疫病毒血清抗体均为阴性,批间和批内重复试验变异系数2.5%～8.3%,对江苏、上海、浙江、安徽地区587份猪血清样品进行检测,抗体阳性率达56.76%,证明该方法具有较好敏感性、特异性和重复性,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。     

一株变异型猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及其灭活疫苗的免疫效力试验

本研究旨在分离猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）变异株,通过悬浮培养工艺制备成高效价的PEDV灭活疫苗。2017年从中国多个规模化猪场采集腹泻病死仔猪的小肠及其内容物200份,通过RT-PCR方法进行PEDV检测并测序,筛选一株PEDV变异株,将其在2 L反应器里悬浮培养的Vero细胞上进行病毒分离与传代培养,收获的病毒液鉴定后测定TCID₅₀,经甲醛灭活后加入氢氧化铝胶佐剂配制成PEDV灭活疫苗,对其物理性状、稳定性、黏度、无菌等进行检验,检验合格后免疫妊娠母猪及所产仔猪,对其安全性和免疫效力进行研究。结果显示,200份病料中有86份为PEDV阳性,将筛选的PEDV变异株病料在Vero细胞上传至第5代时出现细胞病变,传至第10代收获病毒液,经鉴定后确定为PEDV变异毒株,并命名为PEDV-GF10株。收获的病毒液浓缩后测得病毒滴度可达1×10^8.0 TCID₅₀/mL。疫苗检验合格后在母猪产前40和25 d时试验组后海穴肌内注射4 mL疫苗,空白组不免疫,结果显示试验组与空白组母猪的生产情况无明显差异,所产3日龄仔猪分别免疫不同剂量后体温无显著差异,表明该疫苗对母猪和仔猪均安全性良好。随机挑选试验组与空白组母猪所产3日龄仔猪各20头,分别口服4 mL PEDV-F10病毒培养物,空白组母猪所产仔猪在攻毒24 h后PEDV发病率为100%,抗体均为阴性;试验组母猪所产仔猪只有10%出现了轻微的腹泻症状,仔猪获得了高达90%保护率,且仔猪被动免疫后抗体能持续至35 d以上。以上结果表明,PEDV-GF10变异株通过悬浮细胞培养后病毒滴度显著提高,研制的PEDV-GF10株灭活疫苗安全有效,能够对中国的PEDV变异株达到有效防控,为国内PED防控提供了理论依据。     

禽流感病毒BEI灭活疫苗制备与免疫效果

使用浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%的二乙烯亚胺(BEI)37℃灭活禽流感病毒(Re-5株)24h,经灭活效果检测BEI浓度≥0.5%可以完全灭活病毒。0.5%的BEI和0.2%的甲醛灭活禽流感病毒,以相同配方制备疫苗,免疫效力比较研究结果显示,按照规程要求免疫21d后采血HI效价分别为8.35log2和7.66log2,BEI灭活疫苗的抗体水平要高于甲醛灭活疫苗。本研究为禽流感灭活疫苗灭活工艺研究提供了依据。     

基于PEDVNsp7蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

本研究旨在建立检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)不同毒株抗体的间接ELISA方法。试验以纯化的非结构蛋白7(nonstructural protein 7,Nsp7)作为包被抗原,通过优化ELISA反应条件建立了PEDV不同毒株抗体检测的间接ELISA方法。结果显示,其最佳反应条件为:抗原包被量为0.2μg/孔,包被条件为37℃孵育1h后4℃过夜;血清稀释度为1∶300,作用时间为2h;酶标二抗最适稀释度为1∶10 000,作用时间为1.5h;TMB显色液作用时间为15min。在优化条件下,临界值的判定标准为:样品S/P值0.1694判为阳性,S/P值0.1398判为阴性。所建立的ELISA方法特异性、重复性及敏感性均良好。用所建立的ELISA方法对40份来自于疑似猪PEDV血清样品进行检测,该方法与商品化试剂盒检测之间的符合率为95%。本研究建立的ELISA方法在临床上可用于PEDV不同毒株抗体水平的检测,也有用于PEDV早期诊断的潜质,从而为制定有效防控PEDV的措施提供一定的参考依据。     

三种不同灭活方法对新城疫病毒血凝和RT-PCR试验结果的影响

为研究热灭活、甲醛、β-丙内酯(BPL)三种不同灭活方法对新城疫病毒(NDV)血凝和RT-PCR试验结果的影响,将收获的NDV鸡胚尿囊液分别用浓度为0.1%~0.5%的甲醛37℃灭活24 h或4℃灭活48 h、浓度为0.02%~0.2%的BPL 37℃灭活9 h、60℃热灭活30~90 min,并于灭活前后进行血凝试验和RT-PCR检测。结果表明,用0.02%的BPL 37℃灭活9 h或0.1%的甲醛4℃灭活48 h,不影响NDV的血凝价;采用热灭活30 min或0.02%的BPL 37℃灭活9 h,不影响NDV核酸检测。本研究可为相关病原检测以及诊断制品制备过程中灭活方法的选择提供参考。     

检测猪流行性腹泻病毒S1蛋白抗体的间接ELISA方法

为了建立检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗体的间接ELISA方法,初步分析PED灭活疫苗免疫母猪所产仔猪的血清母源特异抗体动态,笔者应用重组PEDV部分纤突(spike,S)蛋白作为检测抗原,建立了基于PEDV S1蛋白的间接ELISA抗体检测方法,并用该方法检测了产前4周用PED灭活疫苗免疫母猪的初乳、分娩当天血清及其仔猪1、7、14、21、28和35日龄(d)时血清中的PEDV抗体。结果显示:建立的间接ELISA方法能够特异地检测PEDV抗体,与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒及猪轮状病毒的抗血清无交叉反应;敏感性高于免疫过氧化物酶单层试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA),与IPMA检测结果的符合率为97.14%;批内和批间重复性试验的变异系数小于10%。免疫母猪初乳、分娩当天血清中的PEDV抗体阳性率为100%,初乳比血清中的平均抗体水平低;1d仔猪血清PEDV抗体阳性率为50%,平均抗体水平低,与初乳中的抗体水平接近,7d以后所有仔猪血清全部转为PEDV抗体阴性。建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法;产前用PEDV灭活疫苗给怀孕母猪免疫1次时,其所产仔猪血清中的母源特异抗体阳性率和抗体水平低,且维持时间短暂。     

甲醛灭活牛支原体的条件探究

为了优化牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)的灭活条件,确定灭活M.bovis的甲醛浓度和时间,为M.bovis灭活疫苗的研发提供可靠依据,试验采用不同浓度的甲醛对M.bovis进行灭活,每隔12 h测定M.bovis的最大代谢活力,并将灭活的M.bovis传代和感染家兔呼吸道以观察灭活效果,进一步通过血清抗体效价来测定免疫原性。结果表明:在36 h内终浓度为0.5%的甲醛就能将M.bovis彻底灭活,但其免疫原性大大降低,不利于灭活疫苗的制备;终浓度为0.3%的甲醛处理60 h后只能将M.bovis部分灭活;终浓度为0.4%的甲醛灭活48 h后能将M.bovis彻底灭活,免疫原性略微降低不影响免疫效果,为最佳灭活条件。     

猪流行性腹泻免疫抗体的ELISA检测及其与琼脂扩散试验相关性分析

为了解不同免疫程序对母猪初乳中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体水平的影响,以及PEDV抗体的ELISA与琼脂扩散试验(琼扩试验)检测相关性,选取5家免疫程序不同的大型猪场,用PEDV IgA抗体ELISA检测试剂盒对其初乳抗体水平进行检测,并根据检测结果,选OD值大小不同的5组初乳样本,琼扩法检测其PEDV抗体效价并分析。结果显示,5家猪场初乳PEDV IgA抗体阳性率均较高,阳性率为94.00%~100%,阳性样本平均OD值为1.858 8~2.148 0,差异不显著;PEDV抗体琼扩几何平均效价与ELISA检测的OD值存在正相关性。分析表明,母猪产前进行猪流行性腹泻活疫苗和灭活苗各一次的组合免疫较为合理;对PEDV抗体检测琼扩法一定程度上可做为ELISA法的替代。     

卵黄抗体中外源病毒的不同灭活方法比较

为防止提取的卵黄抗体混入外源病毒,确保提取卵黄抗体的安全性,比较了甲醛和二乙烯亚胺对卵黄抗体的灭活效果。在卵黄抗体中,人工混入鸡新城疫病毒、禽流感病毒（H9型）、禽传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒和禽脑脊髓炎病毒,分别加入终浓度为0.02％二乙烯亚胺;0.03％、0.05％和0.08％甲醛, 25℃放置24小时。结果显示,0.02％二乙烯亚胺和0.03％甲醛只能灭活部分病毒,而0.05％和0.08％甲醛能完全灭活上述病毒并且不降低抗体活性。因此,可使用0.05％甲醛灭活卵黄抗体中潜在病毒。     

高病毒含量PEDV的纯化及培养条件的优化研究

为了提高猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的病毒含量并优化PEDV培养条件,试验采用病毒蚀斑纯化的方法,连续进行3代蚀斑纯化和增殖培养PEDV,并对纯化增殖的病毒进行PCR鉴定。以第3代增殖的PEDV为种毒,探讨PEDV在Vero细胞上增殖的最佳接毒剂量、吸附时间和弃液比例等。结果表明：经3代蚀斑纯化后,PEDV S基因序列未发生突变,并且PEDV含量比纯化前提高约35倍。PEDV在Vero细胞上的最佳接毒比例为0.01%,最佳吸附时间为2 h,最佳弃液比例为1/2,应用最佳培养条件培养的PEDV含量最高可达1×10^7.50 TCID₅₀/mL。说明通过病毒蚀斑纯化的方法可以培养高病毒含量的PEDV,为高抗原含量猪流行性腹泻疫苗的生产提供良好的种毒资源。     

乳汁中猪流行性腹泻IgA抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测母猪乳汁中猪流行性腹泻病毒(PEDV)IgA抗体的间接ELISA方法,研究以PEDV重组N蛋白和纯化全病毒作为包被抗原,方阵滴定法优化反应条件,建立了两种检测猪乳汁中PEDV IgA抗体的间接ELISA方法。结果显示,重组N蛋白和纯化全病毒的最佳包被抗原浓度均为2μg/mL,检测样品最佳检测稀释度分别为1∶10和1∶30,重复性试验的变异系数均小于10%,PEDV阳性乳汁的最低检测稀释倍数分别为1∶320和1∶960,对猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等阳性乳汁均无交叉反应性,两种方法对临床样品检测符合率为97.48%。表明两种方法均具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于检测和评价乳汁中特异性PEDV IgA抗体的水平。     

猪流行性腹泻病毒间接ELISA检测方法的建立

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的猪的一种急性、高度传染性肠道疾病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究以纯化的PEDV 为包被抗原,通过优化 ELISA 反应条件,建立了间接 ELISA 抗体检测方法,其反应条件为：抗原最佳包被浓度为 20 μg/mL,血清标准品最佳稀释度为 1：500,包被时间为4℃过夜,5%小牛血清37℃封闭1 h,二抗 1：10 000稀释,37℃作用1 h,抗体临界值为 D_{450 nm}≥ 0.289判为阳性,D_{450 nm}≤ 0.236判为阴性,介于二者之间为可疑。检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、细小病毒和口蹄疫病毒标准血清抗体均为阴性,重复试验变异系数均小于10%,对江苏、江西、福建、广东地区74份猪血清样品进行检测,抗体阳性率达84%,表明该方法具有较好敏感性、特异性和重复性,可用于 PEDV 抗体检测和流行病学调查。     

自制猪PPV和PRV二联灭活苗对后备母猪免疫效果观察

用自制猪细小病毒和猪伪狂犬病毒二联灭活苗对后备母猪免疫 ,效果观察表明 :猪细小病毒 HI抗体滴度最高达 1∶ 640 ,猪伪狂犬病毒血清抗体中和指数为 1 4 0 0以上 ,实验组母猪均未发生繁殖障碍 ,且平均产健康活仔率比对照组高出 1 .9%。