鸡传染性支气管炎病毒广西株N、M基因的克隆与序列分析

为研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了1株IBV。参照GenBank中IBV的核苷酸序列设计2对引物,利用RT-PCR技术对分离毒株的N、M基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示,N基因序列全长为1 230 bp,编码409个氨基酸,M基因序列全长为678 bp,编码225个氨基酸。与参考毒株相比,分离株的N基因核苷酸序列同源性为87.2%~93.3%,推导的氨基酸序列同源性为90.0%~94.4%;M基因的核苷酸序列同源性为83.6%~91.0%,推导的氨基酸序列同源性为82.7%~92.9%。在遗传进化树中,本试验分离株Guangxi156株与BJ株和LX4株两个参考株位于同一个分支上,亲缘关系较近,而与其他参考株属于不同的分支,亲缘关系较远。结果表明,本试验分离株是一株新的IBV变异株。     

欧拉型藏绵羊GHRHR基因部分片段的克隆及多态性研究

对欧拉型藏绵羊生长激素释放激素受体(GHRHR)基因部分片段进行PCR扩增和克隆测序(GenBank Accession No:EU289218),利用BioEdit7.0.9.0、DnaSP 4.10.9和MEGA4.0等生物信息学软件对该部分序列与GenBank中普通牛、瘤牛、水牛相应序列进行比对分析,并对58只欧拉型藏绵羊该基因片段进行SmaI-RFLP研究。结果表明:欧拉型藏绵羊与普通牛、瘤牛、水牛3个物种基因序列间同源性大小依次为92.5%、92.0%、91.5%;4个物种间共发现41处序列间碱基差异(9.65/100 bp),其中藏绵羊与普通牛、瘤牛、水牛3个牛亚科物种均存在差异碱基29处。碱基变异类型主要表现为碱基转换和颠换,少数为碱基插入和缺失。推导的部分氨基酸序列间同源性大小依次为88.8%、88.8%、94.4%。58只欧拉型藏绵羊该基因片段SmaI-RFLP分析均为单态,表现为AA基因型。     

内蒙古阿尔巴斯绒山羊与蒙古绵羊BMP2部分基因片段的克隆及分析

从阿尔巴斯绒山羊及蒙古绵羊血中提取基因组DNA,根据已报道的BMP2基因的保守序列设计上下游引物,扩增山羊及蒙古绵羊的BMP2基因部分序列,将此片段克隆到pMD18-T载体中,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,进行序列测定,并将两者序列进行比对.结果山羊该核苷酸片段与绵羊的同源性达99%,与人的同源性87%,与小鼠的同源性85%,与牛的同源性98%.说明该基因在不同物种间具有较高的保守性,尤其是山羊与绵羊之间具有更高的保守性.     

绵羊Lin28基因编码区克隆与序列分析

为研究绵羊Lin28基因的功能,探讨其在绵羊体细胞重编程中的作用,本研究参照GenBank上小鼠、猪、牛和人的Lin28基因mRNA序列的保守区设计简并引物,Trizol法提取100 d左右胎绵羊肠组织总RNA,RT-PCR扩增Lin28基因编码区(CDS)序列,利用生物信息学软件DNAMAN、BioEdit和在线软件NCBI BLASTn、PlantsP和ScanProsite等分别进行核苷酸和推导的氨基酸序列比对,构建进化树,分析蛋白功能结构域并推测氨基酸序列的三维结构。结果显示,绵羊CDS区为包括终止密码子在内的630 bp,编码209个氨基酸。同源性分析结果表明,其与爪蟾、斑马鱼、鸡、牛、马、猫、猪、人、大鼠和小鼠的核苷酸序列同源性分别为53.8%、55.2%、70.2%、88.3%、88.7%、89.2%、89.5%、90.5%、95.9%和98.9%;氨基酸序列同源性分别为76.5%、67.9%、93.2%、99.3%、97.7%、99.3%、99.3%、98.5%、99.3%和100.0%。生物信息学分析显示,绵羊Lin28蛋白含有2个CCHC型的锌指结构和1个冷休克结构域。结果表明,本试验成功克隆Lin28基因的编码区,为进一步研究Lin28基因的功能及探讨其在绵羊体细胞重编程中的作用奠定基础。     

荣昌猪C-Fos原癌基因克隆与序列分析

为获取荣昌猪原癌基因C-Fos的基因序列及对该基因进行进一步的分析与利用,采集荣昌猪睾丸,提取总RNA,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得荣昌猪C-Fos基因,TA克隆后测序.结果表明,获得的荣昌猪C-Fos基因全长为1143 bp,编码氨基酸381个.将荣昌猪与GenBank中野猪,马,牛,羊,家猫,大熊猫,人,黑猩猩,猕猴,大鼠,小鼠,兔C-Fos基因进行同源性比较,比对结果显示,荣昌猪与野猪的同源性最高,核苷酸序列同源性高达99.48％,氨基酸序列同源性高达99.47％,与其他物种则存在较大种属差异.     

西藏牦牛、绵羊棘球蚴病病原的分子鉴定

本研究旨在对西藏自治区那曲地区和拉萨市牦牛、绵羊体内棘球蚴病原进行分子生物学鉴定并分析其遗传变异规律。对2016年11月底采自西藏拉萨市当雄县和那曲地区嘉黎县的5只绵羊体内的5个棘球蚴包囊、15头牦牛体内的18个棘球蚴包囊分别分离棘球蚴原头蚴或生发层组织，提取基因组DNA，应用PCR方法扩增nad1基因，通过测序获得nad1全基因序列。运用DNAStar MegAlign软件对序列进行同源性分析。以GenBank中已公布的棘球属的nad1全基因序列为比对对象，采用最大似然法（ML）构建系统发育树。结果显示，所测定的牦牛和绵羊的23个棘球蚴病原nad1基因序列与GenBank登录的细粒棘球蚴狭义种（G1基因型）nad1基因序列高度同源，同源性为99.6%~99.8%，23条nad1基因的遗传距离为0~0.0022447。同源基因的碱基变异率为0.2%~0.4%；与棘球属其他棘球绦虫同源基因的碱基变异率为14.9%~19.8%。有5个样本的nad1基因在不同位点发生碱基突变，变异位点发生序列转换。以上结果表明，本研究所采集牦牛和绵羊的棘球蚴为细粒棘球绦虫G1基因型，其nad1基因变异小，序列一致性高。     

藏绵羊生长激素释放激素基因内含子Ⅱ部分序列的分析

对藏绵羊生长激素释放激素(GHRH)基因内含子Ⅱ部分序列进行了PCR扩增和测序,用Genbank中的Blastn方法与普通牛相应基因序列进行了比对分析。结果表明,藏绵羊与普通牛GHRH基因内含子Ⅱ部分序列间同源性为92%;2个物种该基因内含子Ⅱ部分序列间的碱基变异类型主要表现为碱基转换和颠换,亦存在碱基插入和缺失。     

绵羊SUN2基因生物信息学分析及其在A549细胞中的表达

本研究旨在克隆绵羊SUN2（Sad1 and UNC84 domain containing 2）基因并进行生物信息学分析,构建真核表达载体并检测其在A549细胞中的表达。根据绵羊SUN2基因序列（GenBank登录号：XM_015095026.2）设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增并克隆绵羊SUN2基因CDS序列,测序鉴定后对其进行生物信息学分析,并构建pEGFP-C1-SUN2重组质粒。利用脂质体转染方法将pEGFP-C1-SUN2重组质粒转染至A549细胞并检测其表达。结果显示,绵羊SUN2基因CDS区序列全长2 187 bp,编码728个氨基酸,理论分子质量为81.06 ku,分子式为C₃₅₉₃H₅₆₃₉N₁₀₃₁O₁₁₁₀S₁₄,等电点（pI）为6.20,总原子数为11 387,不稳定系数为56.88,属于不稳定蛋白。绵羊SUN2基因序列与山羊、牛、猪、马、家犬、大鼠、小鼠及人的相似性分别为98.9%、97.2%、91.6%、90.6%、87.1%、82.4%、82.1%和86.1%,不同物种间基因相似性较高,进化过程中相对保守。系统进化树分析表明,绵羊SUN2基因与山羊、牛、猪、马和家犬等哺乳动物的遗传距离相对较近,与鸡的遗传距离较远。结构域及跨膜结构域预测显示,绵羊SUN2蛋白含有1个高度保守的SUN结构域,且存在跨膜结构域。信号肽预测显示其不存在信号肽位点,疏水性分析为亲水性蛋白,氨基酸序列二级结构主要为α-螺旋（51.65%）,其余为无规则卷曲（31.46%）、延伸链（12.36%）和β-转角（4.53%）。试验成功构建了绵羊SUN2基因真核表达载体pEGFP-C1-SUN2,将其转染至A549细胞并检测到蛋白表达。本试验结果为绵羊SUN2基因功能的研究提供了参考依据,为后续探究SUN2基因在绵羊肺腺瘤病中的作用奠定了基础。     

蒙古羊FSHβ基因cDNA克隆与序列分析

为了加快我国内羊产业发展,提高肉用绵羊的繁殖力,试验以蒙古羊为研究对象,以FSHβ基因作为绵羊高繁殖力的候选基因,采用RT-PCR技术对蒙古羊FSHβ基因的部分序列进行了克隆与序列分析.结果表明:克隆得到的蒙古羊FSHβ基因全长870 bp,其编码区为250 bp,共编码83个氨基酸,3'非编码区620 bp;采用DNASTAR软件分析得到FSHβ基因序列中的A、T、G、C比例分别为27.36%、21.61%、24.94%、26.09%,G+C含量(51.03%)高于A+T的含量(48.97%);通过与GenBank中其他物种的FSHβ基因cDNA序列进行同源性比较发现,蒙古羊FSHβ基因cDNA序列与牛、山羊、猪和人的同源性分别为95%、98%、92%和75%;由进化树可以看出蒙古羊与牛的亲缘关系最近,与鸡最远.     

蒙古羊FSHβ基因cDNA克隆与序列分析

为了加快我国肉羊产业发展,提高肉用绵羊的繁殖力,试验以蒙古羊为研究对象,以FSHβ基因作为绵羊高繁殖力的候选基因,采用RT-PCR技术对蒙古羊FSHβ基因的部分序列进行了克隆与序列分析。结果表明:克隆得到的蒙古羊FSHβ基因全长870bp,其编码区为250bp,共编码83个氨基酸,3′非编码区620bp;采用DNASTAR软件分析得到FSHβ基因序列中的A、T、G、C比例分别为27.36%、21.61%、24.94%、26.09%,G+C含量(51.03%)高于A+T的含量(48.97%);通过与GenBank中其他物种的FSHβ基因cDNA序列进行同源性比较发现,蒙古羊FSHβ基因cDNA序列与牛、山羊、猪和人的同源性分别为95%、98%、92%和75%;由进化树可以看出蒙古羊与牛的亲缘关系最近,与鸡最远。     

Cloning and Sequence Analysis of Mongolian Sheep Brachyury Gene

In order to study Mongolian sheep Brachyury gene DNA sequence, main purpose of this article by using the method of PCR, DNA sequence of Mongolian sheep Brachyury gene cloning and the complete Brachyury gene sequences were obtained for the first time.The sequencing with NCBI BLAST function on the site, comparing the results with the published sequences of sheep Brachyury homology was as high as 99%.We compared these sequences with ten Brachyury genes of human, mouse and other animals in GenBank database.The results showed that the most sequences were identical.Mongolian sheep Brachyury shared a 96.30% amino acid homology with Bos taurus, the highest degree of homology indicated a close genetic relationship, and the Caudata had the lowest homology 58.45%.It could be further confirmed by phylogenetic analysis.Moreover, the results showed that Mongolian sheep Brachyury gene sequence of amino acids and other vertebrates Brachyury gene sequence of amino acids were highly conservative.The research results showed that Mongolian sheep Brachyury gene sequences and other vertebrates Brachyury gene sequences were highly conservative.     

Cloning of Full Length cDNA and Tissue Expression Analysis of Hepcidin Gene from Cobia (Rachycentron canadum)

The techniques of homology clone and RACE were used to clone the Hepcidin gene from cobia (Rachycentron canadium).The full length cDNA of Hepcidin gene was 714 bp with a 213 bp 5'untranslated region (UTR),a 228 bp 3'UTR and a 273 bp open reading frame (ORF) encoding a polypeptide of 90 amino acid residues with a predicted molecular weight of 10.03 ku and theoretical isoelectric point of 7.54.The predicted molecular included signal peptide,prodomain peptide and mature peptide.Phylogenetic tree of Hepcidin amino acid sequences was constructed and homology compapison of amino acid sequences showed that homologies were varied from 24.4% to 85.6% with some known Hepcidin amino acids in other fishes and mammals.Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) analysis revealed that Hepcidin gene was expressed in all tissues with different expression levels,which expressed most in liver.The Hepcidin gene expressions in liver,head kidney and spleen were up-regulated after stimulation of LPS and formalin-inactivated Vibrio carchariae.     

军曹鱼Hepcidin基因全长cDNA克隆及其组织表达分析

本试验采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)的方法,得到714 bp的军曹鱼(Rachycentron canadum) Hepcidin基因全长cDNA序列。该序列包括213 bp的5'末端非编码区(UTR)、228 bp的3'UTR及273 bp的开放阅读框(ORF),编码90个氨基酸,预测其蛋白分子质量约为10.03 ku,等电点为7.54,预测的蛋白包括信号肽、前肽和成熟肽。通过构建Hepcidin氨基酸序列的系统进化树并进行氨基酸同源性比对,结果显示军曹鱼与已知鱼类及哺乳动物Hepcidin氨基酸的同源性在24.4%~85.6%之间。实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测结果显示Hepcidin基因在正常军曹鱼组织中均表达,但表达量在各个组织中有所不同,其中以肝脏表达量最高。经脂多糖(LPS)和甲醛灭活的鲨鱼弧菌(Vibrio carchariae)刺激后,肝脏、头肾、脾脏中Hepcidin基因表达均上调。     

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列。序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1650bp,含一个462bp的内含子;其cDNA编码区全长1188bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470。该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点。     

小尾寒羊ACAA1基因CDS克隆及组织表达谱分析

为探索乙酰辅酶A酰基转移酶1（acetyl-coenzyme A acyltransferase 1,ACAA1）基因的生物学功能,明确该基因在小尾寒羊不同组织中的表达差异,试验采集小尾寒羊心脏、肝脏、胃、十二指肠、小肠、背最长肌、皮下脂肪组织,提取总RNA,根据GenBank中公布的绵羊ACAA1基因序列（登录号：XM_004018227.3）设计引物,利用RT-PCR和分子克隆技术获得小尾寒羊ACAA1基因完整CDS,并对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测该基因在小尾寒羊不同组织中的表达差异。结果显示,小尾寒羊ACAA1基因CDS长为1 071 bp,编码356个氨基酸;小尾寒羊ACAA1基因氨基酸序列与绵羊、山羊同源性最高,约为100%,与食蟹猴、狒狒和野猪的同源性均为93.0%;系统进化树结果显示,小尾寒羊与绵羊、山羊位于同一分支,亲缘关系较近,与穿山甲、狒狒的亲缘关系较远;各物种间同源性较高,保守性较强。ACAA1蛋白分子质量约为36.92 ku,分子式为C₁₆₀₃H₂₆₃₈N₄₅₈O₅₀₁S₁₈,理论等电点为7.48,半衰期为30 h,消光系数为9 440,稳定系数为40.88,脂溶系数为92.67,亲水性氨基酸残基约占58%,为不稳定的碱性脂溶性亲水蛋白;不存在跨膜结构与信号肽,不是分泌蛋白;主要分布在过氧化物酶体,存在25个磷酸化位点、3个潜在的N-糖基化位点和4个O-糖基化位点。ACAA1蛋白二级结构含有α-螺旋（37.92%）、β-折叠（12.64%）和无规则卷曲（49.44%）,三级结构预测结果与其一致。实时荧光定量PCR结果显示,ACAA1基因在小尾寒羊不同组织中均有表达,其中在肝脏、皮下脂肪、小肠中表达量相对较高。本试验结果为进一步探索小尾寒羊ACAA1基因生物学功能及筛选与肉质性状相关的候选基因提供依据。     

梅花鹿S100A16基因的克隆及生物信息学分析

为探索梅花鹿（Cervus nippon）S100A16基因序列及生物学特性，本研究根据GenBank数据库中牛、绵羊S100A16基因序列设计引物，以梅花鹿鹿茸顶端组织cDNA为模板，采用RT-PCR技术和分子克隆技术成功获得梅花鹿S100A16基因的cDNA序列。生物信息学分析发现，梅花鹿S100A16基因CDS区全长312 bp，编码103个氨基酸；蛋白含有11个磷酸化位点，有跨膜结构域，无信号肽，为在细胞内发挥作用的稳定蛋白；蛋白仅在C端含有S100蛋白家族经典的EF螺旋结构域，由12个氨基酸组成，N端EF螺旋结构域由15个氨基酸组成；蛋白C端含有FGF-1蛋白结合位点；梅花鹿S100A16蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成；三级结构显示该蛋白有2个Ca²⁺结合位点；梅花鹿S100A16蛋白氨基酸序列与东欧马鹿同源性最高，为100%，与其他部分物种S100A16蛋白氨基酸序列构建系统进化树，分析表明S100A16基因在进化上比较保守，符合功能基因的特点。研究结果为进一步揭示梅花鹿S100A16基因的功能及表达机制提供依据。     

Cloning and Sequence Analysis of Lin28 Gene Coding Region from Sheep

The assay was aimed to study the function of Lin28 gene of sheep,in this study,according to the Lin28 gene mRNA sequence of mice,pigs,cattles and human in GenBank,the degenerate primer was designed.Total RNA was extracted by Trizol from intestine of 100 d sheep embro,and CDS sequence of the gene was amplified by RT-PCR using the primer.Using a series of bio-software such as DNAMAN,BioEdit and NCBI BLASTn,PlantsP,ScanProsite online and so on,we analyzed the homologies between nucleotide and deduced amino acid sequences,constructed phylogenetic tree,analyzed protein functional domains and deduced three-dimensional structure of amino acid sequence.The results showed that the sequence of sheep Lin28's CDS including stop codon,was in a length of 630 bp,encoded 209 amino acids.Analysis of homology showed that sheep Lin28 gene also shared 53.8%,55.2%,70.2%,88.3%,88.7%,89.2%,89.5%,90.5%,95.9% and 98.9% nucleotide homologies and 76.5%,67.9%,93.2%,99.3%,97.7%,99.3%,99.3%,98.5%,99.3% and 100.0% amino acid identities with Xenopus laevis,Danio rerio,Gallus gallus,Bos taurus,Equus caballus,Felis catus,Sus scrofa,Homo sapiens,Rattus norvegicus and Mus musculus,respectively.Two zinc finger domains and one cold shock domain could be found by bioinformatics analyzing.The successful cloning of Lin28 revealed that the gene in the structure and function was very conservative and helpful to study gene function and its role in somatic reprogramming in future.     

新疆5个品种羊不同月龄MSTN基因mRNA表达水平及其与生长性状相关性分析

为了探讨不同品种绵羊肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)表达水平及其与生长性状(体重、体高、体长、胸围和管围)的关联性,试验采用实时荧光定量 PCR方法比较阿勒泰羊、吐鲁番黑羊、也木勒白羊、哈萨克羊、巴什拜羊不同月龄(初生及1、2、3、4、5月龄)肌肉和脂肪MSTN mRNA的表达水平,运用SPSS 19.0软件分析与其生长性状的相关性.在肌肉中:初生时,阿勒泰羊、哈萨克羊、巴什拜羊MSTN基因mRNA表达水平均明显低于其他各月龄;也木勒白羊3月龄MSTN基因mRNA水平均显著低于其他各月龄(P<0.05);阿勒泰羊、吐鲁番黑羊MSTN基因mRNA在4月龄表达水平最高;哈萨克羊MSTN基因mRNA初生时表达水平最低,5月龄表达水平最高.在脂肪中:也木勒白羊MSTN基因mRNA表达水平初生时显著低于其他各月龄(P<0.05);阿勒泰羊、也木勒白羊、巴什拜羊MSTN基因mRNA 5月龄表达水平最高,巴什拜羊MSTN基因mRNA 5月龄显著高于其他各月龄(P<0.05);哈萨克羊MSTN基因mRNA 2月龄表达水平最高,显著高于5月龄(P<0.05).相关性分析结果发现,MSTN基因mRNA表达水平与生长性状多呈负相关关系.阿勒泰羊在肌肉和脂肪中MSTN基因mRNA表达水平与其生长性状均呈负相关关系;吐鲁番黑羊MSTN基因mRNA在肌肉中的表达水平与体高、体长呈负相关,其余均呈正相关;也木勒白羊MSTN基因mRNA在肌肉中的表达水平与胸围、管围呈正相关,在脂肪中表达水平与体长呈正相关,其余均呈负相关;哈萨克羊在肌肉和脂肪中除与体长呈正相关外,其余均呈负相关;巴什拜羊在肌肉中MSTN基因mRNA表达水平与体长、管围呈正相关,其余均呈负相关.MSTN基因mRNA在不同月龄不同品种间的表达水平存在差异性,无固定表达模式;且与生长性状多呈负相关关系,与部分体尺性状呈正相关关系.MSTN基因mRNA表达水平可能与生长性状和骨骼生长有直接关系.     

Cloning,Bioinformatics and Expression Pattern Analysis of Buffalo MC1R Gene

The aim of this study was to clone and analyze the expression pattern of buffalo MC1R gene.A pair of specific primers was designed according bovine MC1R sequence (GenBank accession No.:JN123363.1),with genome DNA of swamp buffalo,White swamp buffalo,Murrah buffalo and Yellow cattle as template,MC1R was amplified by PCR.Then relative expression level of MC1R gene of swamp buffalo,White swamp buffalo,Murrah buffalo and Yellow cattle was analyzed using QRT-PCR,and protein expression was detected by Western blotting method.The results showed that the 954 bp coding region of buffalo MC1R gene was successfully cloned and sequenced,which code for 317 amino acids.The MC1R gene nucleotide sequences and amino acid sequences of swamp buffalo,White swamp buffalo,Murrah buffalo and Yellow cattle were highly conserved.Five polymorphic sites were found between White swamp buffalo and swamp buffalo of MC1R gene,including 476 T→C,618 G→C,881 G→A,930 G→A and 931 A→G,which caused three nonsynonymous mutation sites of Phe159Ser,Glu310Ala and Asp294Ala.The QRT-PCR result showed that relative expressions of MC1R gene of Murrah buffalo,swamp buffalo and Yellow cattle were significant higher than that of White swamp buffalo (P<0.05).The Western blotting results revealed that MC1R protein expression level in swamp buffalo was higher than that of White swamp buffalo.In conclusion,there were amino acids mutation in White swamp buffalo MC1R gene,and MC1R gene relative expression of White swamp buffalo was lower than that of other buffalo,which was the main reason of lacking of melanin production in White swamp buffalo.