基因Ⅶ型新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫效力研究

本试验旨在利用杆状病毒表达系统对基因Ⅶ型新城疫病毒（NDV）F基因进行表达研究。RT-PCR扩增F基因,将其克隆到pFastBac HT A载体中,阳性重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得含F基因的重组杆状病毒质粒,重组病毒感染Sf9细胞72 h后,进行SDS-PAGE电泳、间接免疫荧光和Western blotting检测。免疫SPF鸡,间接ELISA测定抗体滴度,攻毒保护试验检测重组F蛋白保护性。结果显示,F蛋白在昆虫细胞中能够特异性表达,该蛋白诱导了高滴度的NDV特异性抗体,具有良好的免疫原性;重组F蛋白免疫组攻击保护率达到90%,明显高于阴性对照组。本研究结果为NDV新型亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

鸭源新城疫病毒的分离与鉴定

新城疫是家禽易感的病毒性传染病,鸡、鸭、鹅、鸽子等都可以发生感染,新城疫病毒是一种高度接触性致病原,传播度速速,是当前危害养禽业的重要病毒性致病原.2019年4月,一家养鸭场发生疑似新城疫病毒感染病例,通过临床和实验室诊断,对鸭源新城疫病毒进行分离和鉴定,为相关疾病诊断和病毒分离鉴定提供参考.     

新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析

构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段.     

新城疫病毒F基因在新型杆状病毒表达系统中的表达及重组病毒的免疫原性

将新城疫病毒（四平株）F基因插入到pFastBac Ⅰ质粒中，构建了重组质粒pFF。pFF转化大肠杆菌DH10Bac后，F基因在助手质粒（helper plasmid)提供转座酶的情况下，通过转座进入Bacmid，构建了重组Bacmid(re-Bacmid)。在含有X－gal/IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上，筛选白色菌落后，提取re-Bacmid转染Sf-9昆虫细胞。在昆虫细胞内，re-Bacmid经复制、表达、装配、形成重组杆状病毒，并表达F蛋白。经SDS－PAGE和Western-blot分析，表达的F蛋白的分子大小为63000，并证明在昆虫细胞内表达的蛋白能部分糖基化。表达的F蛋白约占细胞总蛋白的10％。动物试验证明，约建的重组杆状病毒具有良好的免疫原性。     

鹅源新城疫病毒NA-1株F蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

将含有鹅源新城疫病毒NA-1株F蛋白基因的重组转座载体PFF转染昆虫细胞sf9,28℃培养,待细胞出现明显病变后,收取细胞,反复冻融,接种sf9昆虫细胞,如此再传代1次,收集细胞保留毒种,同时做表达产物的检测,结果表明,表达产物约占细胞总蛋白的10%,并有良好的反应原性。     

新城疫病毒F48E9株MNPF和HN基因的真核表达

将新城疫病毒（NDV）F48E9株的M、NP、F和HN基因克隆到真核细胞表达载体pCAGG上，经酶切、PCR鉴定和序列分析，分别筛选出了含有M、NP、F和HN基因的重组质粒，命名为pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGGHN。纯化后的重组质粒通过脂质体单独转染HeLa细胞，经间接免疫荧光试验检测到了M、NP、F和HN蛋白的表达。pCAGGM、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG—HN重组质粒组合共转染HeLa细胞48h后，可以观察到明显的细胞融合现象。试验结果表明，NDVF48E9株的M、NP、F和HN蛋白均在HeLa细胞内得到了成功表达，同时证明在该表达系统中F蛋白不足以诱导细胞融合。     

新城疫病毒F基因的真核表达及其免疫原性检测

为了探讨F基因在DNA免疫防制新城疫(ND)中的免疫原性,将NDV Z株F基因插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5-H is-TOPO中,构建了真核表达质粒pcDNA NDV ZF。在脂质体作用下将pcDNA NDV ZF转染CEF细胞,用间接免疫荧光试验检测,在CEF细胞中可见有大量F蛋白表达。将重组质粒以100μg/只的剂量肌注免疫SPF雏鸡,经间接ELISA试验检测二免前后的血清,结果证明,pcDNA NDV ZF基因可在SPF鸡体内诱导相应抗体的产生,具有特定的免疫原性。     

一株基因Ⅵ型鸭新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

以一株鸭新城疫病毒NDV-SS分离株基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增其F基因,并进行克隆和序列测定。通过序列分析软件将该毒株F基因氨基酸推导序列与GenBank上已发表的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F基因相关代表序列进行同源性及遗传进化关系分析。测序结果表明,NDV-SS株F基因全长1662bp,编码553个氨基酸,其蛋白裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株特有的序列结构特征。同源性及遗传进化关系分析结果表明,NDV-SS株为基因Ⅵ型毒株,与鸽源新城疫IT-227、Italy-2736分离株具有较高同源性和较近的亲缘关系,推测其可能是由鸽源新城疫病毒变异所产生的。     

小反刍兽疫病毒N基因在昆虫细胞中的表达

为了研发小反刍兽疫病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原物质,参照GenBank公布的小反刍兽疫疫苗株Nigeria75/1的全基因组序列(GenBank登录号:X74443),人工合成表达核蛋白的N基因开放阅读框序列,通过PCR扩增、经引物设计引入的EcoRⅠ和KpnⅠ特异性酶切位点,将N基因克隆于昆虫杆状病毒表...     

新城疫病毒SX-1株F基因定点突变及真核表达研究

根据已发表的分离自麻鸡的新城疫病毒SX-1株F基因序列,采用PCR体外定点突变技术,设计2对引物,引物中含有突变位点.应用重叠PCR延伸法,分3次PCR扩增F基因,从而得到突变后的F基因,命名为F基因,使改造后的F基因编码的氨基酸裂解位点为112GlyArg-Gin-Gly-Arg-Leu117.在EeoR Ⅰ和Hind Ⅲ位点将F基因与转座载体pFastBac Ⅰ连接,获得重组质粒,并进行PCR、酶切鉴定,核苷酸序列测定正确的pFastBac-F'质粒转化到DH10Bac宿主茵,将目的基因定向插入到Bacmid质粒中,经筛选获得的重组Bacmid F'质粒转染Sf-9昆虫细胞,并进行表达检测,表达产物间接免疫荧光试验阳性,经SDS-PAGE、Western-blotting检测显示,获得分子量约63 ku的蛋白特异条带,说明F'重组蛋白表达成功.     

Expression and Identification of F Gene of Duck Newcastle Disease Virus in Insect Cells

In order to express the F protein of duck Newcastle disease virus (NDV) in insect cells,one pair of specific primers was designed according to the published genome sequences of duck NDV to amplify F gene by PCR,the amplified fragment was cloned into baculovirus expression vector pFastBac1.Then the recombinant vector pFastBac-F was transformed into E.coli DH10Bac competent cells,and the positive recombinant bacmid rBacmid-F was screened according to the resistance and blue-white plague screening.rBacmid-F was transfected into Sf9 insect cells by liposome,once the cytopathic effect was found,the rBac-F could be aquired.The results of Western blotting and indirect immunofluorescence test showed that the recombinant proteins could be recognized by positive serum,indicating that the protein had good reactiongenicity.These results suggested that F protein of duck NDV had been successfully expressed in insect cells,which laid the foundation for the prevention and control of duck Newcastle disease.     

传染性法氏囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

本研究将鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV)JM-1/10株VP2基因克隆至pcDNA-3.1(+)启动子CMV之后,随后将CMV-VP2基因序列一同克隆入杆状病毒表达系统的质粒 pFastBac^TM Daul中构建了pFast-CMV-VP2。将pFast-CMV-VP2转化Escherichia coli DH10Bac感受态细胞,筛选出重组质粒Bacmid-CMV-VP2。用 Bacmid-CMV-VP2转染Sf9昆虫细胞,获得了重组杆状病毒vBac-CMV-VP2。将该重组杆状病毒转导BHK-21细胞,48~72 h后经间接免疫荧光试验(IFA)检测到VP2蛋白具有特异性荧光;样品经Western blotting分析,结果显示目的蛋白得到表达。结果表明,本试验制备的重组 vBac-CMV-VP2 既能在昆虫细胞中表达,也可在哺乳动物细胞中表达。     

1株鸭源新城疫病毒的分离鉴定及生物学特性研究

从广东地区发病鸭中分离到1株新城疫病毒,血凝试验、血凝抑制试验结果表明此分离株具有血凝活性,且这种血凝性可被NDV标准阳性血清抑制,而不能被AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9、EDSV阳性血清抑制;用针对NDV F基因特异性鉴定引物对该分离株进行聚合酶链反应扩增,可扩增出相应的目的片段。由此,初步鉴定该分离株为鸭源新城疫病毒,并命名为NDV/DUCK/SD/2006。另外,通过毒力测定,该毒株的MDT、IVPI分别为51.75 h、2.44,判定为强毒力株。     

新城疫病毒F48E9株融合蛋白基因核苷酸序列分析

通过反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出新城疫病毒国内标准强毒株Ｆ４８Ｅ９的融合蛋白基因的ｃＤ－ＮＡ。经双粘端定向克隆到ｐＵＣ１９的多克隆位点中,采用Ｓａｎｇｅｒ’ｓ双脱氧末端终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列,并推导出其氨基酸序列。Ｆ基因全长为１６６２个ｂｐ,单一的开放阅读框编码５５３个氨基酸的多肽。Ｆ蛋白的疏水构型有三个强疏水区;其裂解位点的氨基酸序列为１１２Ｒ－Ｒ－Ｑ－Ｒ－１１６Ｒ－１１７Ｆ;Ｆ蛋白上共有１２个Ｃｙｓ残基位点和五个潜在糖基化位点。     

一株新疆野鸟源新城疫病毒的分离鉴定、F基因克隆及遗传进化分析

为了解新疆野鸟新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）感染情况,分析其分子特征和基因变异特点,防止新城疫的暴发和蔓延,本试验用9日龄SPF鸡胚进行病毒的分离传代,HA、HI试验和RT-PCR方法对位于"东非-西亚迁徙线"福海县的野鸟进行了NDV检测,分离到1株野鸟源NDV,并命名为NDV/Pintail/CH（XJ）/01/2016。结果表明,该NDV分离株F基因ORF长1 662 bp,编码553个氨基酸,F基因碱性裂解位点序列为¹¹²G-R-Q-G-R-L¹¹⁷,符合弱毒株特征;遗传进化分析显示,NDV/Pintail/CH（XJ）/01/2016与乌克兰鸽源分离株Doneck/3/968、比利时鸭源分离株Simeonovgrad核苷酸同源性均为99.7%,属于NDV ClassⅡ基因Ⅱ型。而上述3株病毒均与疫苗毒La Sota具有较高同源性（99.5%~99.8%）。本研究结果为家禽NDV外流进入自然环境提供了论据。     

Isolation and Identification,F Gene Cloning and Evolutionary Analysis of Newcastle Disease Virus Isolated from Wild Birds in Xinjiang

In order to understand inflection of Newcastle disease virus (NDV) of Xinjiang wild birds, through analysis of molecular characteristics and genetic variation, to prevent the outbreak and spread of Newcastle disease, isolation of the virus was performed in 9 days old specific pathogen free (SPF) chicken embryos, detected the wild birds in Fuhai county which was located in the migration line of East Africa-West Asia by HA, HI test and RT-PCR method. And then 1 strain of NDV from wild birds was isolated, named as NDV/Pintail/CH(XJ)/01/2016. As the result, ORF of F gene from the NDV isolate was 1 662 bp, encoding 553 amino acids. The motif of the cleavage site was ¹¹²G-R-Q-G-R-L¹¹⁷, which was consistent with the characteristics of avirulent NDV strains. The phylogenetic analysis showed that NDV/Pintail/CH(XJ)/01/2016 nucleotide sequence homologies of F gene between reference strain Doneck/3/968 and mule Simeonovgrad strain homology were high and reached 99.7%, it belonged to genotype Ⅱ of Class Ⅱ NDV. All of the three viruses had high homology to the vaccine strain La Sota,which were 99.5% to 99.8%. According to this research conclusion we provided evidence that poultry NDV outflowed into the natural environment.     

鸭源新城疫病毒TH-1株的分离鉴定及遗传进化分析

试验从吉林省通化某地发病死亡鸭子病料中分离到1株具有血凝性的病毒,通过血凝试验、血凝抑制试验、血清中和试验及融合蛋白(F)基因的扩增测序,初步鉴定为新城疫病毒,命名为TH-1株。该病毒鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)及6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)分别为53.4 h、1.85和2.575,表明该新城疫病毒为强毒。F蛋白多肽裂解位点为112-RRQKRF-117,符合新城疫强毒株裂解位点氨基酸序列,进一步证明该毒株为新城疫强毒株。F基因核苷酸及氨基酸同源性比对发现,TH-1株与中国野鸭源新城疫病毒分离株mallard China HLJ株的同源性最高,核苷酸同源性达到了99.3%,同为新城疫基因Ⅶ型毒株,与目前新城疫流行的主要基因型Ⅶ型相一致,为鸭源新城疫的有效防制提供了理论基础。     

1型鸭肝炎病毒E53株VP1基因在昆虫细胞中的表达及产物分析

根据1型鸭肝炎病毒E53株基因组序列设计并合成一对特异性引物,RT-PCR扩增VP1基因,将其定向克隆至pFastBacTMHTB载体,转化至DH10BacTM感受态细胞中,蓝白斑筛选获得重组穿梭质粒rBacmid-VP1,重组质粒在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒。结果表明VP1蛋白在昆虫细胞中获得表达,表达产物能够与兔抗1型鸭肝炎病毒VP1蛋白多抗血清和鸭肝炎病毒阳性血清发生特异性反应。在昆虫细胞中表达VP1蛋白为VP1功能的研究及鸭肝炎病毒抗体的检测提供了物质材料。     

新城疫病毒F48E9株NP基因的克隆与序列分析

根据NDV NP蛋白已知基因序列设计合成了一对引物，利用RT-PCR扩增出了F48E9株NP基因1598bp的片段，将该片段克隆到pMD18-T Vector上，并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定，结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子。为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性，采用Sanger's双脱氧末端终止法对阳性重组子进行核苷酸序列测定，获得了F48E9株NP基因片段的基因序列，利用DNASIS分析软件，将F48E9株与La Sota株的相应序列进行比较，其核苷酸序列同源性为88.2%。至此，我们获得了F48E9株NP基因的全长克隆。