牛流行热病毒结构糖蛋白（G）基因的克隆及鉴定

牛流行热是由病毒引起的牛和水牛的急性热性传染病。其G蛋白为81kDa的结构糖蛋白,它位于病毒表面并含有中和抗原位点,可使牛产生免疫保护。本研究利用RT-PCR法从牛流热病毒北京血毒JB76H总RNA中,扩增并克隆了其G蛋白基因（1.9Kb）。限制性内切酶酶切分析结果显示,与澳大利亚分离株BB7721差异较大。脱氧核糖核苷酸序列分析表明,该基因与澳大利亚分离株BB7721同源性高达91％。     

西尼罗病毒NS1基因的原核表达与抗原性鉴定

为进行西尼罗病毒(WNV)NY99株NS1蛋白的免疫学研究,通过PCR方法扩增WNV NY99株NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pMAL-c2X上,构建出重组表达质粒pc2X-NS1,经IPTG诱导得到可溶性的麦芽糖结合蛋白(MBP).NS1融合蛋白(MBP-NS1),其分子质量约为90 ku,约占可溶性菌体蛋白质量的50%.利用直链淀粉树脂柱对MBP-NS1纯化后的重组蛋白的纯度达到60%,westem blot和间接ELISA检测证明纯化的MBP-NS1具有良好的抗原性和特异性,为进一步开展关于WNV NS1蛋白的研究奠定了基础.     

徐州地区牛流行热病毒的分离与鉴定

1991年夏秋之交徐州市各奶牛场暴发牛流行热。为确诊该病,采集了发病高热期抗凝血,进行了病毒分离和鉴定试验。病料经处理后,直接接种于BHK_21细胞,传至第二代可见典型的CPE。电镜下观察到80—150nm弹状病毒颗粒。分离毒的理化特性、核酸类型及中和试验结果均与标准BEFV相一致,证实该分离病毒为牛流行热病毒。     

西尼罗病毒糖蛋白第三结构域的原核表达及鉴定

根据西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)序列设计1对特异性引物,用PCR反应扩增糖蛋白第三结构域(WNVEDⅢ)基因,将PCR产物克隆至pGEX-4T-1原核表达载体上,获得重组表达质粒,将该质粒转化入E.coli DH5α,命名为pG-EDⅢ,鉴定正确后转入transetta表达菌中,经IPTG诱导后纯化重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western-blot方法证实WNV-EDⅢ基因可在大肠杆菌中高效表达,小鼠免疫试验证明该原核表达蛋白有良好的免疫原性。     

表达牛流行热病毒G基因的牛传染性鼻气管炎病毒转移载体的构建

本试验将克隆到 p BLG中的牛流行热病毒 (BEFV)糖蛋白 G基因亚克隆到含有 CMV启动子和 Poly(A)信号尾的 p CR3- Uni载体上 ,获得 p CR3- G重组体 ,酶切后将含有 CMV、G基因和 Poly(A)的目的片段 (约 3.6 kb)插入通用转移载体 pd TK- CMB中 ,获得 pd TK- CMB- G重组体 ;再将含 SV4 0启动子的 L ac Z报告基因也亚克隆到该载体中获得表达 BEFV G基因的pd TK- L ac Z- G转移载体 ,为开发 BEFV/IBRV二联基因工程疫苗奠定了基础     

牛星状病毒ORF2基因遗传进化分析及原核表达

为了解牛星状病毒(bovine astrovirus, BoAstV)ORF2基因的遗传进化并获得原核表达的衣壳蛋白,从牛腹泻粪便中提取总RNA,扩增BoAstV ORF2基因,将ORF2基因克隆至pMD19-T载体中并测序,利用生物信息学软件分析基因的遗传进化。将位于BoAstV衣壳蛋白高度保守区的ORF2-1200基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达载体pET28a-ORF2-1200。将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达并优化诱导条件,经过超声破碎离心并鉴定蛋白可溶性,最后利用亲和层析镍柱对重组蛋白进行纯化和Western blot鉴定。结果表明：ORF2基因全长2 304 bp,编码768 aa, ORF2基因属MAstV-28基因型,与日本毒株Ishikawa24-6亲缘关系最近,与20个参考毒株的ORF2基因氨基酸同源性为53.2%～86.0%。试验成功构建了重组载体,经条件优化,在37℃,1.0 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导6 h情况下蛋白表达量最高,目的蛋白大小55 kDa左右,目的蛋白以包...     

牛疙瘩皮肤病病毒ORF132基因的克隆及其原核表达

为原核表达牛疙瘩皮肤病病毒(LDSV) ORF132并对该基因进行生物信息学分析,本研究采用PCR扩增LSDV的ORF132基因,将其亚克隆至pGEX-6p-1载体中,构建重组质粒pGEX-LSDV-ORF132.生物信息学分析表明,LSDV的ORF132与Neethling vaccine LW1959株LW132、NI-2490株LSDV132和NW-LW株LD132的相应推导氨基酸同源性分别为100％、100％和94.4％,与山羊痘病毒、绵羊痘病毒相应推导氨基酸的同源性为20.7 ％～36％.SDS-PAGE和western blot分析表明,pGEX-LSDV-ORF 132在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导主要以包涵体形式存在,其重组蛋白大小约为48.95ku,并且与特异性抗体具有抗原反应活性.     

Prokaryotic Expression and Antigenic Characterization Identification of G Gene for Bovine Ephemeral Fever Virus

In order to explore specific candidate gene of antigens and diagnostics development for the bovine ephemeral fever virus (BEFV), the target gene sequences were derived from G gene by PCR amplification using two specific primers.The PCR products were digested by Xho Ⅰ and Nde Ⅰ and cloned into pET-30 vector, and the recombinant plasmids (480-pET-30, 1107-pET-30) were transformed into E.coil BL21 (DE3) cells, the D_{600 nm} of positive strains were 0.6 to 1.0.The recombinant strains were induced by IPTG (1.0 mmol/L) at 37 ℃.The characteristics of the target proteins were analyzed using SDS-PAGE and the immunogenicity was analyzed through Western blotting.At the same time, the target proteins were used as coating antigens to do ELISA and all rabbits were inoculated with recombinant proteins.The results showed that the expression feature of 1 107 bp gene fragment of G gene for the first time was segmented in vitro as well as has nicer biological activity and specificity, and it more be suitable as a candidate gene for molecular vaccine and diagnostics development.This study provided the theoretical foundation of the establishment of diagnostics technique and vaccine for BEFV.     

牛呼吸道合胞体病毒G蛋白抗原区原核表达及反应原性鉴定

本研究旨在获得重组牛呼吸道合胞体病毒（BRSV） G蛋白并对其进行反应原性鉴定。从NCBI上找出G基因的核苷酸序列，分析其抗原区域，利用Primer Premier 5.0软件设计1对特异性引物，利用RT-PCR方法扩增BRSV G基因片段，将目的片段连接到克隆载体pMD19-T后，对其进行双酶切鉴定和测序。将双酶切后的目的片段进行胶回收，构建重组质粒pET-32a-G，将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，用Ni-IDA亲和层析法纯化经IPTG诱导表达的蛋白，并测定其浓度；通过SDS-PAGE和Western blotting方法对该蛋白进行分析与鉴定。结果显示，本试验成功克隆出大小约为567 bp的G基因，获得分子质量约为40 ku的可溶性重组蛋白，优化诱导条件后用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定，在16℃、IPTG浓度1.2 mmol/L、诱导4 h时蛋白表达量最大；通过Western blotting检测发现，重组蛋白可与山羊源BRSV标准阳性血清发生特异性反应，说明该蛋白具有反应原性。综上，本研究成功表达并纯化了BRSV G蛋白，为建立BRSV抗体间接ELISA检测方法和BRSV亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

牛冠状病毒S基因的序列分析及原核表达

为了解牛冠状病毒（bovine coronavirus,BCoV）的S基因变异情况并建立ELISA检测方法,本研究对采自不同牛场的新生犊牛腹泻（CD）和成年牛冬痢（WD）腹泻样本提取总RNA,反转录合成cDNA,利用PCR扩增S全基因和S1基因。将S1基因目的片段连接表达载体pET-32a （+）,并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经PCR、双酶切及测序验证正确后,进行IPTG诱导表达。结果显示,CD与WD分离株S基因核苷酸为98.4%,CD和WD分离株与参考毒株BCoV-ENT株核苷酸同源性最高,分别为98.4%和98.5%,CD分离株与参考毒株SUN5株的同源性最低,为97.5%,WD分离株与FRA/EPI/Caen/2003/13同源性最低,为97.3%。通过比对可知,分离株与已知毒株之间存在较大差异,为疫苗候选毒株筛选提供依据。本试验同时构建了pET-32a-S1表达载体,在0.2 mmol/L IPTG诱导5 h时,重组菌能在大肠杆菌BL21感受态细胞中产生大量的S1融合蛋白,获得约58 ku表达产物。本试验成功表达了S1蛋白,并对BCoV进行了核苷酸进化分析,为疫苗免疫效果评价方法的建立奠定了基础。     

牛流行热研究进展

牛流行热,又称为三日热,是由虫媒弹状病毒牛流行热病毒(BEFV)引起的牛和水牛的一种传染病.该病会导致牛发热、四肢僵硬、跛行,通常又会完全恢复.其会引起感染动物的死亡,母牛流产,致使奶牛产奶量下降、公牛体重和生殖能力下降.作者结合国内外对牛流行热病毒的研究,从发病历史、流行病学、病原学、临床症状、致病机理、诊断、防控等方面阐述了牛流行热的研究进展,旨在为该病的深入研究提供参考.     

牛流行热病毒JB76H株G蛋白基因核苷酸序列分析

通过反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）,从中国北京分离株牛流行热病毒ＪＢ７６Ｈ基因组ＲＢＡ中扩增出主要保护性抗原糖蛋白Ｇ的cＤＮＡ。采用Ｓanger’s双脱氧末端终 止法测定cＤＮＡ片段的核苷酸序列,并推导出氨基酸序列。Ｇ基因全长为１８７２个碱基,单一的开放阅读框架阅读框架编码６２３个氨基酸的多肽。将测得的序列与澳大利亚六个分离株进行比较,发现我国分离株与渊大利亚分离株间同源性为９１％,低于澳大利亚各分     

非洲猪瘟病毒主要抗原p54-1的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

为进一步深入研究非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p54蛋白的主要抗原表位及抗原性质,本试验根据GenBank中p54基因序列（登录号：NC_001659.2）设计表达区域特异性引物,PCR扩增后连接表达载体pGEX6p-1构建pGEX6p-1-p54-1原核表达质粒;将该质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,切除GST标签后采用阴离子柱纯化目的蛋白并鉴定;将纯化蛋白与佐剂混合乳化后作为免疫原,免疫小鼠制备p54-1蛋白多克隆抗体;采用ELISA和Western blotting检测抗体的效价和反应特性。结果显示,重组p54-1融合蛋白以可溶形式表达,切除标签后的纯化蛋白能够与ASFV阳性血清发生反应,而与PRRSV和PCV3不发生反应。利用该蛋白免疫获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1：128 000。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体能够识别ASFV p54蛋白。表明本研究成功获得了较高纯度的p54-1蛋白,制备的p54-1多克隆抗体具有较高反应性和特异性,为后续非洲猪瘟双抗夹心ELISA检测方法的建立提供依据。     

牛乳头瘤病毒2型L1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

试验旨在表达牛乳头瘤病毒（BPV）的L1衣壳蛋白,并制备其多克隆抗体。对疑似牛乳头状瘤的病料进行病理组织学检查,采用L1基因简并引物FAP59/FAP64进行扩增,然后设计特异性引物,将衣壳蛋白L1基因亚克隆至pET-30a （+）表达载体中,构建重组原核表达载体pET30a-BPV2-L1,在E.coli Rosetta^TM（DE3） pLysS宿主菌中表达重组蛋白rBPV2-L1,并以纯化的rBPV2-L1蛋白为免疫原制备兔抗BPV2-L1蛋白多克隆抗体,随后间接ELISA检测其效价,并进行间接免疫荧光试验分析。病理组织切片观察结果显示,病变部分表皮细胞增生、角质过度并出现细胞挖空等BPV感染的组织病变情况;序列分析确定BPV分离株的基因型为2型,L1基因编码区长1 494 bp,可编码一个含有497个氨基酸的衣壳蛋白,蛋白分子质量为55.5 ku;与各型BPV的L1氨基酸序列系统进化树分析结果显示,其与BPV2-SW01（GenBank登录号：KC878306.1）、BPV2（GenBank登录号：KX113620.1）处于同一遗传进化分支,且属于Delta属成员;诱导表达的rBPV2-L1蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中;间接ELISA法检测多克隆抗体效价高达1：163 840,间接免疫荧光分析表明,兔抗BPV2-L1多克隆抗体能与瞬时表达的BPV2-L1蛋白发生特异性反应。以上结果证实,本研究成功克隆、表达了BPV2 L1基因,且重组蛋白rBPV2-L1具有较好的免疫原性,所制备的BPV2-L1蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性,为进一步研究BPV2亚单位疫苗奠定基础。