猪Toll样受体5基因cDNA克隆、蛋白质序列分析及其意义

为了解猪Toll样受体5(TLR5)蛋白的结构特征和进化关系,本研究从肠系膜淋巴结组织总RNA中克隆出猪Toll样受体5基因的cDNA序列。序列全长2641bp,其中2571bp的开放阅读框编码856个氨基酸残基的猪TLR5,含17.4%的亮氨酸,并有一段19个氨基酸的信号肽序列;同源性分析结果显示,TLR5在进化过程中具有高度保守性,与人、牛、山羊、绵羊、小鼠和大鼠的氨基酸序列同源性分别为77.5%、79.6%、78.3%、81.0%、69.2%和68.9%。蛋白分子结构预测结果表明,该分子由胞外区(642个氨基酸)、跨膜区(23个氨基酸)和胞内区(191个氨基酸)组成,胞外区具有LRR结构域,胞内区具有TIR结构域,表现出典型的TLR家族结构特征。表明猪TLR5分子具有病原分子模式识别和信号传导的作用,这为其结构与功能的进一步研究奠定了基础。     

水貂TOll样受体5编码区基因的克隆及序列分析

为了解水貂Toll样受体5(TLR5)蛋白的结构特征和遗传演化关系,采用RT-PCR方法从水貂肺脏组织总RNA中扩增出TLR5基因的片段,经拼接获得全长编码区序列。序列全长2 577 bp,编码858个氨基酸,含172%的亮氨酸,并有一段20个氨基酸的信号肽序列。蛋白预测结果表明,该分子具有亲水性,由胞外区(具有LRR结构域)、跨膜区和胞内区(具有TIR结构域)组成,表现出典型的TLR家族结构特征;同源性分析结果显示,与蒙眼貂同源性最高,达97%以上,与海象、大熊猫和北极熊同源性80%以上,与其他物种同源性大都在70%以上。水貂TLR5基因序列的成功克隆为进一步研究其在水貂机体免疫应答中的作用奠定了基础。     

海兰褐蛋鸡体内Toll样受体的分子克隆与序列分析

为了研究海兰褐蛋鸡的先天性免疫机制,根据已报道的鸡的9种Toll样受体（TLR）和其他动物（人、小鼠和猪） TLR9的基因序列,设计特异性引物,从海兰褐蛋鸡体内扩增出11个鸡Toll样受体部分基因片段,与GenBank登录的序列进行比对和分析,同源率达99%以上。同时也证实鸡体内不存在TLR9,但是存在TLR21。     

山羊Toll样受体2基因的克隆及序列分析

为了研究山羊Toll样受体2(TLR2)基因,试验采用RT-PCR技术,根据已发表的牛、猪、绵羊TLR2基因序列的保守区设计1对引物,扩增山羊TLR2基因的cDNA,连接T载体,克隆测序得到长度为2355 bp的序列,提交至GenBank(序列号为Gu984768.1),分析TLR2基因的核酸和氨基酸序列并与其他物种的...     

猪Toll样受体9基因的克隆、序列分析及其结构预测

本研究应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增技术,从猪脾脏淋巴细胞中,克隆了猪Toll样受体9基因(pTLR9).基因序列分析表明,克隆的pTLR9基因ORF为3 093 bp,编码1 030个氨基酸,含18.5%的亮氨酸,含有24个氨基酸的信号肤序列,属于Ⅰ型跨膜受体,具有富含亮氨酸的重复序列(LRR)和Toll/IL-1R同源区结构域;与GenBank上登载的pTLR9参考序列(AY859728)的同源性为99.3%,与牛、马、羊和人的同源性较高,与家鼠、褐鼠的次之,TLR9的演化关系与亲缘关系密切.     

中国新吉细毛羊天然Toll样受体8基因(TLR8)克隆与序列分析

为了解绵羊Toll样受体8(TLR8)蛋白的结构特征和进化关系。本试验采用Trizol法提取新吉细毛羊肝脏组织总RNA,设计ORF区两端兼并引物,RT-PCR方法克隆新吉细毛羊TLR8并进行了系统的生物信息学分析。RT-PCR结果显示,试验获得了大小为3 102bp的片段,包括完整的ORF区2 982bp,编码993个氨基酸(GenBank序列号为:GU936186和GU936187),含15.7%的亮氨酸。同源分析结果显示,TLR8在进化过程中具有高度保守性,与人、家牛、山羊、猪、梅花鹿和小鼠的氨基酸序列同源性分别为79.9%、96.3%、97.6%、84.7%、96.5%和74.2%。蛋白分子功能结构域预测显示,该分子由胞外区(781个氨基酸)、跨膜区(52个氨基酸)和胞内区(160个氨基酸)组成,其中胞外区具有LRR结构域,胞内区具有TIR结构域,且绵羊较人类多了LRR3和LRR12结构域。进化分析显示TLR8分子与不同物种间的进化关系符合真实物种间的进化顺序。试验结果表明新吉细毛羊TLR8分子具有病原分子模式识别作用,为其结构和功能的研究奠定了基础。     

牦牛Toll样受体8和9基因克隆及组织表达分析

为了解牦牛Toll样受体8(TLR8)和9(TLR9)蛋白的结构特征及其基因的组织表达规律,丰富牦牛TLRs基因研究的理论数据,应用RT-PCR方法克隆牦牛TLR8、TLR9基因,并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR技术构建组织表达谱。结果显示,两个基因cDNA全长分别为3 102bp和3 090bp。牦牛TLR8和TLR9基因与野牦牛、黄牛和绵羊之间的同源性都很高,均在95%以上。牦牛TLR8和TLR9蛋白都具有胞外LRRs功能域、胞内区TIR结构域、低复杂度区;另外,TLR8还具有1个C端富集亮氨酸重复序列(LRRCT)和跨膜结构域。两个基因在10个组织中均有不同程度的表达,在肾脏中表达量最高,而在大肠中表达量最低。本研究成功克隆了牦牛TLR8和TLR9基因的完整编码区,并揭示了它们在各组织器官的表达规律,为进一步研究TLRs在牦牛体内的免疫机制奠定了基础。     

牦牛Toll样受体10基因的克隆与分析

旨在获得牦牛TLR10基因序列并进行生物信息学分析,同时分析其组织表达谱,为进一步研究牦牛TLR10基因的功能提供资料。以GenBank中牛TLR10基因序列设计引物,在牦牛脾组织中克隆出牦牛TLR10基因,应用半定量RT-PCR技术检测该基因组织表达情况。生物信息学分析表明,牦牛TLR10基因编码区全长2 328bp,编码氨基酸776个,分子质量196.3ku,理论等电点为4.94;TLR10编码的蛋白整体带负电荷,并表现为亲水性;进化树与同源性分析表明,牦牛与黄牛的同源性最高,达到99.4%,与水牛、绵羊、梅花鹿等哺乳动物遗传距离很近。组织表达谱显示牦牛TLR10基因在12个组织中均有表达。结果显示,牦牛TLR10基因高度保守,具有稳定的抗原特征。     

梅花鹿天然Toll样受体9基因克隆与序列分析

Trizol法提取梅花鹿肝脏总RNA,采用ORF两端兼并引物,RT-PCR方法克隆梅花鹿天然Toll样受体9基因（TLR9）并进行系统的生物信息学分析。RT-PCR结果显示,梅花鹿TLR9基因的mRNA长4 043bp,含有800bp左右的5’UTR,完整ORF编码1 081个氨基酸（GenBank序列号为：HQ260632）。同源性分析显示梅花鹿TLR9基因编码区与其他物种高度同源,但5’UTR区存在基因结构的变异。功能结构域分析显示不同物种间TLR9结构域相对保守但也存在细微差别,结构域的差别导致梅花鹿TLR9蛋白胞外区马蹄形弧顶内侧空间结构由人类TLR9蛋白的弧形改变为梅花鹿TLR9蛋白的三角形。进化分析显示TLR9基因分子进化关系与物种间真实进化相一致。     

猪Toll样受体2基因的克隆和序列分析

本研究从猪肠系膜淋巴细胞中，克隆了猪Toll样受体2基因（pTLR2）。基因序列分析表明，克隆的pTLR2基因ORF为2358bp，编码785个氨基酸，合15．01％的亮氨酸，合有一段21个氨基酸的信号肽序列；与GenBank中登录的pTLR2序列（NM213761）的同源性为99．2％；与牛、马、绵羊和人的同源性较高，与家鼠、中国仓鼠相比次之．而与鱼类的最低。蛋白分子结构预测表明，该分子由胞外区（588个氨基酸）、跨膜区（23个氨基酸）和胞内区（174个氨基酸）组成，其胞外结构域由多个串联重复的LRR基序（XLXXLXLXX）组成，而胞内区合有与人白细胞介素1受体（IL-1R）高度同源的区域即TOLL／IL-1受体同源区（TIR），说明pTLR2分子具有病原分子模式识别和信号传导的作用，这为其结构与功能的进一步研究奠定了基础。     

Molecular Cloning,Sequence Analysis and Tissues Expression Profile of Part of Mink Toll-like Receptors (TLRs) Genes

The present study was aimed to explore the potential role of Toll-like receptors (TLRs) on the mink immunity, and accumulate alternative genetic material for the mink breeding for disease-resistant.Four pairs of primers were designed according to ferret TLR sequences in GenBank to obtain the sequences of TLR genes (TLR4, TLR6, TLR7 and TLR8) of mink and then performed bioinformatics analysis of these sequences.In addition, the expression of TLR4 and TLR7 genes in various tissues in young and adult minks were analyzed by RT-PCR. Sequence homology analysis showed that mink had higher homology with carnivora (ferrets, polar bear, panda, walrus, seals, dog, tiger and cat) which had the nearest perimeter in the phylogenetic tree.Tissue expression analysis showed that TLR4 and TLR7 were widely and differently expressed in variety tissues of mink.Interestingly, the expression of TLR4 and TLR7 in young mink were much higher than that in adult mink.     

Cloning,Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of Mink Interleukin-4 Gene

In order to obtain high purity of interleukin 4 (IL-4) protein,the specific primers were designed and synthesized according to the mink IL-4 gene sequence in GenBank. The IL-4 gene was amplified by RT-PCR using total RNA of the lymphocyte isolated from the peripheral blood that induced by phytohemagglutinin (PHA). The length of IL-4 gene sequence was 399 bp which encoded 132 amino acids. Phylogenetic analysis revealed that the amino acid sequences homology between mink and ferret was 99.2%,90.0% with Ailuropoda melanoleuca and Canis familiaris. Prokaryotic expression vector pProEX-HTb-IL-4 was constructed and induced by IPTG. The recombinant protein of 15 ku was isolated by SDS-PAGE and detected by Western blotting. Highly purified recombinant protein of mink IL-4 was obtained by His-Trap HP affinity columns method. This research laid the foundation for the further studies on the biological function of mink IL-4 gene.     

水貂白细胞介素-4基因的克隆、序列分析与原核表达

为了获得高纯度的白细胞介素-4（IL-4）蛋白,对分离得到的水貂外周血淋巴细胞经植物血凝素（PHA）诱导后,提取淋巴细胞总RNA,根据GenBank中登录的雪貂IL-4基因序列,设计并合成特异性引物,通过RT-PCR扩增获得了水貂IL-4基因序列全长399 bp,编码132个氨基酸,与雪貂氨基酸序列同源性高达99.2%,与熊猫、犬同源性均为90.0%。将编码成熟蛋白基因构建到原核表达载体pProEX-HTb,IPTG诱导后,SDS-PAGE及Western blotting结果显示,IL-4表达产物为15 ku的包涵体蛋白。通过His-Trap HP亲和层析预装柱变性、复性洗脱可获得高纯度的重组IL-4蛋白。本试验为水貂IL-4基因的进一步研究奠定了基础。     

Toll样受体研究进展

Toll-like receptors(TLRs)是存在于机体的一类重要的模式识别受体,在机体天然免疫中起着重要的作用.TLRs还是连接天然免疫和适应性免疫的桥梁.目前TLR1-9研究的较清楚和详尽.不同TLRs识别的病原体相关分子模式各不相同.TLRs介导的机体信号传导途径分为MyD88依赖性和非MyD88依赖性.多种生物TLRs已被克隆和表达,通过进化分析,脊椎动物的TLRs可被分为6大基因家族,识别相似PAMP的TLRs聚为一簇.TLRs编码序列和功能是高度保守的.     

雪山草鸡血管紧张素转换酶2(ACE2)基因克隆、结构特性分析及其表达特征研究

旨在克隆血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2,ACE2）基因,分析其结构特性和表达特征。本试验以45和90日龄的健康雪山草鸡为研究对象,利用PCR技术扩增ACE2基因的编码区序列;运用生物信息学方法对其结构特征进行分析;通过TA克隆构建黄羽肉鸡ACE2编码区序列质粒标准品,使用绝对定量方法测定ACE2基因在45和90日龄雪山草鸡公母鸡各组织中的表达特性。结果,克隆得到2 427 bp的编码区序列,共编码808个氨基酸,与白羽肉鸡一致,但是在黄羽肉鸡序列中存在大量突变位点造成编码氨基酸发生变化。同源性比较发现,其与红色原鸡的同源性为99%,其次为绿头鸭88%,与其它动物的同源性为73%~76%。生物信息学分析发现,ACE2属于I型跨膜蛋白,即分泌型蛋白,信号肽位于1~17 aa,含有46个蛋白质磷酸化位点。定量结果发现,小肠中ACE2表达量显著高于其它组织。法氏囊、气管、胆囊和脾中ACE2表达量较低,脾中表达量最低。母鸡空肠、盲肠、脾和肺中ACE2基因表达量显著高于公鸡。公鸡肾和心中ACE2基因表达量显著高于母鸡。90日龄雪山草鸡的十二指肠、空肠、肺、脾和回肠组织ACE2基因表达量均显著低于45日龄雪山草鸡,在法氏囊和肾组织中结果呈相反趋势。通过克隆获得了雪山草鸡ACE2基因编码区序列,生物信息学分析发现,雪山草鸡ACE2基因在家禽中较为保守;ACE2基因表达规律呈现出在雪山草鸡肠道组织中高于其他组织,母鸡中高于公鸡,随着时间表达水平呈下降趋势。研究结果为开展ACE2基因在黄羽肉鸡肠道中的功能研究奠定了理论基础。     

猪ApoA5基因cDNA的克隆、序列分析及组织表达研究

旨在克隆猪ApoA5基因cDNA全序列,并对其进行序列分析,研究该基因的组织表达规律.试验以山西马身猪肝脏组织为材料,采用RT-PCR与RACE技术,对猪ApoA5基因的cDNA进行克隆,并对其进行了生物信息学分析.采用荧光定量PCR检测并分析了ApoA5 mRNA在2个猪种(马身猪和大白猪)中多个组织的表达规律.结果表明:猪ApoA5基因cDNA全长1 917 bp,包括1 092 bp的开放阅读框(ORF),24 bp的3'-UTR和801 bp的5'-UTR;编码区(CDS)共编码364个氨基酸,与牛、马、人、犬、猴、兔、褐鼠和小鼠氨基酸序列的同源性分别为81.7％、80.0％、78.3％、77.5％、76.5％、73.6％、67.1％和66.7％;ApoA5 mRNA除了在肺脏和脾脏中未检测到外,在其他8种组织中均有表达,其中在肝脏组织中高丰度表达,在皮下脂肪与背最长肌中中等表达,低量表达于小肠、肾脏、心脏、胰脏和胃,并且在皮下脂肪与背最长肌中ApoA5 mRNA的表达量存在显著的品种差异.猪ApoA5基因在动物进化中比较保守,ApoA5 mRNA的表达量受到组织和品种影响,推测ApoA5基因对脂肪沉积性状有一定的影响.     

鸡胚肠上皮细胞Toll样受体的表达谱研究

为明确鸡胚肠上皮细胞中Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)的表达情况,本研究采用嗜热菌蛋白酶分离培养18日龄鸡胚的肠上皮细胞,在形态学观察及免疫细胞化学法鉴定基础上,采用RT-PCR方法检测其TLR表达谱,并对不同品种鸡胚肠上皮细胞TLR表达谱进行了比较研究。结果表明,应用嗜热菌蛋白酶消化法得到的鸡胚肠上皮细胞生长状况良好;采用低速离心和差速贴壁进行纯化,得到90%以上纯度的鸡胚肠上皮细胞;纯化后的细胞经形态学观察及细胞角蛋白单克隆抗体鉴定为阳性;10种TLR在鸡胚肠上皮细胞上均有mRNA表达,但其丰度存在明显差异;不同品种鸡胚肠上皮细胞TLR表达谱均无显著差异。     

水貂肠炎细小病毒的分离鉴定及其VP2基因的序列分析

本试验从疑似细小病毒感染的病死水貂中分离到1株病毒。经PCR鉴定、细胞培养、蛋白质电泳鉴定最终确定为水貂肠炎细小病毒(MEV),命名为MEV-WFD。对该分离病毒的衣壳蛋白VP2基因进行克隆测序分析,结果表明此病毒VP2基因3处碱基发生点突变,其中一处的突变导致第328处氨基酸残基由疏水性丙氨酸(Ala)变为亲水性苏氨酸(Thr)。将此株病毒VP2基因与GenBank上公布的所有MEV的VP2基因碱基序列进行同源性比较及进化树分析,结果表明该病毒与ZYL-1、MEV/LN/-10和Manzhouli的VP2基因同源率最高,为99.8%;进化树构建结果表明,该病毒与6株已公布的病毒属于同一进化分支。     

水貂酪氨酸酶(TYR)基因克隆、SNPs筛查及其皮肤组织mRNA差异表达分析

旨在克隆和分析水貂酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因编码区,揭示该基因编码区SNPs及其皮肤组织mRNA差异表达规律与水貂毛色表型的关系.本研究采集7月龄雄性金州黑水貂、名威银蓝水貂和红眼白水貂共计301个样本的血液,利用聚合酶链式反应(PCR)方法对水貂TYR基因5个外显子进行分段克隆,并拼接获得其完整编码...     

牛干扰素-γ基因的克隆、序列分析及表达研究

为了使干扰素-γ(interferon γ,IFN-γ)在牛结核等疾病的诊断和防制方面取得更有效的应用,试验采用RT-PCR法从云南本地黄牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增牛IFN-γ(BoIFN-γ)基因,测序并进行序列分析;然后亚克隆至pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。序列分析结果表明,克隆的IFN-γ基因与GenBank中荷斯坦牛IFN-γ序列同源性达99.60%。表达产物经SDS-PAGE分析,在大小约23 ku处可见目的蛋白表达条带,与预期结果一致;用ELISA检测,表达的蛋白具有明显的生物学活性,在菌体中的含量为244 ng/mL。本试验结果为牛IFN-γ蛋白的进一步研究和应用奠定了基础。