绵羊痘病毒固原株L2R基因的克隆与生物信息学分析

为分析绵羊痘病毒L2R蛋白的分子特征,本试验提取了绵羊痘病毒固原株（GY）的基因组DNA,设计L2R基因引物,对L2R基因进行扩增,将扩增的基因连接到pGEM-T Easy载体后转化到大肠杆菌Trans 5α感受态细胞,筛选阳性克隆,进行序列测序。利用生物信息学软件对L2R基因序列进行预测分析。结果显示,L2R基因序列含有一个由279个核苷酸组成的开放阅读框,编码92个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质分子质量理论值为10.92 ku,理论等电点为6.56。该蛋白质二级结构组成分别是α-螺旋占69.57%,β-折叠占9.78%,无规则卷曲占8.70%,延伸链占11.96%。多序列比对分析结果显示,不同羊痘病毒分离株L2R序列高度保守。进化树分析结果显示,GY株与NK、TU及SA株在一个分支,表明它们之间亲缘关系较近。本试验结果为进一步研究L2R蛋白的生物学功能和羊痘病毒早期蛋白的分子相互作用奠定了基础。     

山羊痘病毒ORF112基因的克隆与序列分析

山羊痘是由山羊痘病毒(goat pox virus,GTPV)引起的一种急性、热性、接触性传染病,A27L蛋白是山羊痘病毒细胞内成熟病毒粒子重要的免疫保护抗原之一,为检测该蛋白诱导的特异性免疫应答,笔者等开展了山羊痘病毒ORF112基因的克隆与序列分析。结果表明:山羊痘毒株(GTPV-S-1)的ORF112基因序列与不同来源的山羊痘病毒分离株相比较,ORF112基因核苷酸序列的同源性达86.8%以上,说明山羊痘病毒的ORF112基因具有高度保守性。该结果为建立敏感、快速、准确、简单易行的GTPV检测方法和ORF112蛋白的后续研究奠定了基础。     

绵羊痘病毒甘肃流行株ORF121基因的克隆及序列分析

从甘肃景泰疑似羊痘绵羊的皮肤组织中提取基因组DNA,PCR扩增糖蛋白ORF121基因。序列分析表明,该基因由519个核苷酸组成,编码172个氨基酸,分子量为19.9 kua,序列中A+T含量占74.95%,G+C含量仅占25.05%。甘肃景泰株ORF121基因同绵羊痘病毒参考株之间的核苷酸同源性高达99%;与疙瘩皮肤病病毒和山羊痘病毒参考株之间的同源性分别为97%和95.6%。结构预测结果显示,ORF121蛋白具有两个N-糖基化位点和一个跨膜区,且具有极强的亲水性。以上结果表明,ORF121蛋白在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,具有潜在的疫苗或/和诊断价值。     

山羊痘病毒反向末端重复序列的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B-株反向末端重复序列片段,将其克隆至pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-ITR,再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组菌进行序列测定,并将所得序列与GenBank收录的2株山羊痘病毒、3株绵羊痘病毒全基因序列进行比较分析。结果:所测4个毒株序列与GenBank上收录的山羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为100%,与绵羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为98.3%。研究结果表明,山羊痘病毒反向末端重复序列与已收录的羊痘毒株之间该片段的同源性非常高,为今后兽医临床上应用PCR方法检测羊痘病毒提供了另一更为特异、保守的基因片段。     

应用PCR检测山羊痘病毒

初步建立了用于诊断山羊皮肤组织中山羊痘病毒的PCR方法。试验设计了2对引物，用以分别检测山羊痘病毒的特异性基因和α-微管蛋白基因。克隆到的DNA扩增产物的序列与GenBank中收录的序列同源性达到98％。试验表明，用PCR方法可快速检测样品中的山羊痘病毒。     

金华猪PPARGC1A基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

试验旨在研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α（PPARGC1A）在金华猪和大白猪中的遗传特征和表达情况，探究PPARGC1A基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达模式。以金华猪和大白猪为试验动物，分别提取背脂组织的总RNA，根据GenBank中公布的猪PPARGC1A基因序列（登录号：NM_213963.2）设计编码区和实时定量PCR引物，以猪GAPDH基因和β-actin蛋白作为内参，应用多种生物信息学方法对PPARGC1A基因编码蛋白进行功能分析，并通过实时荧光定量PCR及Western blotting检测其在金华猪背脂中的表达水平。结果表明，金华猪PPARGC1A基因CDS区全长2 361 bp，编码786个氨基酸，该蛋白分子大小90 336.01 u，其中丝氨酸（ser）所占比例最高（13.7%），色氨酸（Trp）所占比例最低（0.8%）。同源性比对结果显示，金华猪PPARGC1A基因与山羊、牛和绵羊的同源性较高，分别为95.0%、94.9%和94.9%，在物种进化中具有较强的保守性；金华猪PPARGC1A蛋白不稳定指数为74.88，属于不稳定亲水蛋白，无跨膜结构，其二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角及无规则卷曲4种结构组成，所占比例分别为26.59%、5.73%、5.73%和61.96%，PPARGC1A蛋白同源建模经折叠、弯曲等一系列复杂的过程获得三级结构模型；实时荧光定量PCR试验和Western blotting试验结果一致，显示PPARGC1A基因在背脂较厚的金华猪中表达量显著低于瘦肉型的大白猪（P<0.05）。本研究为探明PPARGC1A基因对猪脂肪沉积的分子生物学功能提供了理论基础。     

山羊痘病毒PCR/酶切检测方法的建立

为了建立一种快速的山羊痘检测方法,根据山羊痘病毒基因组保守区T3A/T3C基因设计了1对引物,以山羊痘病毒DNA为模板进行PCR扩增并连接到pMD18-T载体进行序列测定,测序结果显示片段长491 bp,与已报道的山羊痘病毒对应序列进行比对,同源性高达98%。特异性和灵敏性试验及PCR产物的酶切位点分析表明,该引物特异性好,敏感性强。本研究建立的山羊痘病毒PCR/酶切检测方法可应用于山羊痘病毒感染的临床诊断。     

山羊痘病毒ITR基因片段的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y和B株ITR基因片段,插入pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,提取重组载体经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上8株羊痘病毒相应序列进行同源性分析。结果经PCR扩增,4株病毒均可得到一条均一的DNA片段,该片段可被内切酶AluⅠ特异酶切,而且该PCR的DNA模板最小检出量为24.40pg。经测序,该基因片段长度为289bp;序列比较发现,4株病毒ITR片段与GenBank上2株山羊痘病毒的核苷酸与氨基酸序列同源性均为100%,与3株绵羊痘病毒分别为98.2%和96.5%,与3株牛疙瘩皮肤病病毒为98.2%～99.3%和96.5%～97.7%。这表明ITR基因片段在羊痘病毒属中较为保守,可以针对ITR基因建立羊痘病毒的PCR检测方法。     

牛支原体新疆分离株oppD/F基因克隆及分子特征分析

试验旨在分析牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列,并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株oppD/F基因序列（登录号：AF130119.1）设计1对引物,应用PCR技术扩增获得分离株oppD/F基因,将oppD/F基因片段克隆至pMD19-T载体中进行测序,在采用生物信息学方法分析其核苷酸序列的基础上对其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、可溶性、信号肽、跨膜域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构和功能等进行分析和预测。结果显示,牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列全长1 617 bp,与Mb PG45株和Mb JF4278株的同源性均为100%,处于同一分支;该基因编码蛋白是由539个氨基酸残基组成,不存在信号肽及跨膜结构,是一种稳定的亲水性蛋白质;oppD/F蛋白存在1个AAA家族结构域,50个潜在的磷酸化位点和3个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高（61.78%）,无规则卷曲次之（20.78%）。功能预测结果显示,oppD/F蛋白在信号传导、受体、结构蛋白、离子通道、免疫应答和胁迫应答等方面的几率均较高。本研究结果为进一步分析牛支原体oppD/F基因的功能提供了一定的理论依据。     

犬瘟热病毒上海分离株M蛋白编码基因的克隆与序列分析

本研究以犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)上海分离株的总RNA为模板,根据GenBank中已报道的CDV M蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,RT PCR扩增M蛋白基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,CDV上海分离株M蛋白基因序列与CDV A75/17 株、Onderstepoort疫苗株等其它7株的同源性在95%以上;编码氨基酸的同源性也高于97%。推测M蛋白是一个保守性非常强的结构蛋白。     

Cloning and Sequence Analysis of A6L Gene of Goatpox Virus

To explore the molecular characteristics of protein A6 from goatpox virus (GTPV), genomic DNA was extracted from goatpox virus Gulang isolate.The specific primers were designed and used to amplify the A6L gene from the genomic DNA by PCR.A PCR product was ligated into pGEM-T Easy vector.After transformation into E.coli DH5α, the positive clones were sequenced and the sequences were analyzed with the bioinformatics softwares.The result showed that A6L gene sequence contained an open reading frame (ORF) of 1128 nucleotides and deduced protein consisted of 375 amino acids with the theoretical molecular weight of 43.68 ku and isoelectric point of 7.50.Analysis of secondary structure of protein A6 revealed that α-helix, β-strand and random coil were 53.30%, 10.24% and 39.46%, respectively.Analysis of multiple sequence alignment indicated A6L gene from different capripoxvirus isolates were highly conserved with identity of more than 97%.The present results laid the foundation for further studies of biological functions of protein A6 and interaction among the early proteins of capripoxvirus.     

Cloning and Bioinformatics Analysis of L2R Gene of Sheeppox Virus GY Strain

To explore the molecular characteristics of protein L2R from sheeppox virus(SPPV), genomic DNA was extracted from SPPV GY strain. The specific primers were designed and used to amplify the L2R gene from the genomic DNA by PCR. Then the PCR product was ligated into pGEM-T Easy vector. After transformation into E. coli Trans 5α, the positive clones were sequenced and the sequences were analyzed by the bioinformatic softwares. The result showed that L2R gene sequence contained an open reading frame (ORF) of 279 nucleotides and deduced protein consisted of 92 amino acids with the theoretical molecular weight of 10.92 ku and isoelectric point was 6.56. Analysis of secondary structure of protein L2R revealed that α-helix, β-strand, random coil and extended strand were 69.57%,9.78%,8.70% and 11.96%,respectively. Analysis of multiple sequence alignment showed that L2R gene from different capripox virus isolates were highly conserved, phylogenetic analysis showed that GY and NK, TU and SA was in a branch, indicating with a close genetic relationship among them. The present results laid a foundation for further studies of biological functions of protein L2R and interaction among the early proteins of capripox virus.     

太行鸡CYP19A1基因克隆及生物信息学分析

试验旨在克隆蛋鸡CYP19A1基因,对其遗传结构进行生物信息学分析并探究其在太行鸡不同组织中及不同产蛋量个体中的表达情况。以河北省太行鸡为研究对象,通过设计引物对CYP19A1基因CDS区进行克隆测序,运用生物信息学软件对其功能结构进行预测。结果显示,CYP19A1基因含有一个1 509 bp的开放阅读框（ORF）,编码502个氨基酸。同源性比对和系统发生树分析结果表明,太行鸡CYP19A1基因与鸭的同源性较高（90.7%）,并且在不同物种间高度保守。对CYP19A1蛋白理化性质进行预测分析发现,该蛋白为亲水蛋白,蛋白分子式为C₂₆₀₂H₄₁₀₃N₆₇₅O₇₁₉S₃₆,分子质量为57.51 ku,理论等电点为5.99,其中含量最高的是亮氨酸（为14.0%）。蛋白质二级结构由α-螺旋、延伸链、β-折叠及无规则卷曲4种结构组成,所占比例分别为58.95%、2.18%、3.93%和34.93%。组织表达谱分析发现,CYP19A1基因在不同组织中均有表达,但其在卵巢中表达量最高。实时荧光定量PCR结果显示,CYP19A1基因在太行鸡高产组卵巢中的表达量显著高于低产组（P<0.05）。上述结果为研究太行鸡CYP19A1基因提供了重要的研究数据,为进一步挖掘太行鸡高产基因提供了参考。     

山羊碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1cDNA序列克隆及表达

试验旨在克隆山羊碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1 cDNA序列,探究其表达的组织特异性及其在小肠中的表达发育模式。参考GenBank已发表的绵羊、牛SLC3A1基因mRNA序列设计引物,克隆山羊SLC3A1基因的cDNA序列,采用实时荧光定量PCR的方法分析其在1日龄山羊11种组织及其在1日龄、6月龄、8月龄、10月龄、12月龄山羊十二指肠、空肠、回肠中的mRNA表达情况。结果表明,成功克隆得到了山羊SLC3A1基因cDNA序列,其与绵羊、牛、野猪、人、小鼠、大鼠的同源性分别为99%、97%、88%、86%、80%和79%。SLC3A1基因转录表达有明显的组织特异性,其在1日龄山羊肾脏、回肠、空肠、结肠中表达量依次降低(P<0.05),其他组织中表达量很低。同一月龄山羊,SLC3A1基因在不同肠段的表达量数值上回肠>空肠>十二指肠。SLC3A1基因在不同月龄山羊十二指肠表达量以1日龄山羊为最高(P<0.05),6~12月龄山羊相同肠段之间表达量无显著差异(P>0.05);空肠表达量随山羊年龄的增加均呈现逐步降低的趋势;回肠表达量在各个月龄山羊之间差异不显著(P>0.05)。结果说明,山羊碱性氨基酸转运载体基因SLC3A1的主要表达部位在肾脏和肠道,推测b^0,+碱性氨基酸转运系统转运氨基酸的主要部位为肾脏和肠道。SLC3A1基因在山羊小肠受肠段和发育阶段的影响,具有不同的表达发育模式。     

山羊RPL27A基因克隆及组织表达特性分析

为研究山羊核糖体蛋白L27A （ribosome protein L27A，RPL27A）基因结构及其相关的生物学功能，试验采集简州大耳羊的14种组织样品（心脏、肝脏、脾脏、背最长肌、皮下脂肪等），利用RT-PCR扩增并克隆获得山羊RPL27A基因序列，通过在线工具进行生物信息学分析；采用实时荧光定量PCR技术检测RPL27A基因在各个组织及不同分化阶段的皮下前体脂肪细胞中的表达水平。结果显示，山羊RPL27A基因CDS区长447 bp，可编码148个氨基酸。生物信息学分析表明，RPL27A基因在不同的物种间具有较高的保守性，RPL27A蛋白是不稳定的亲水碱性蛋白，其与脂代谢及脂肪沉积相关的RPS18、RPL26、RPL34、RPL32、RPL37A等核糖体蛋白存在相互作用，RPL27A蛋白没有跨膜结构域，且无信号肽，亚细胞定位表明其主要存在于细胞质中。实时荧光定量PCR结果显示，RPL27A基因在山羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、背最长肌、皮下脂肪等14种组织中均有广泛表达，且在瘤胃中表达水平最高，在臂三头肌和股二头肌中也存在较高的表达水平，均显著高于其他组织（P<0.05）；RPL27A基因在成脂诱导60 h的山羊皮下脂肪细胞中的表达水平显著高于分化前（P<0.05）。本研究成功克隆了山羊RPL27A基因CDS序列，并揭示了RPL27A基因在山羊14种组织中的表达特性，研究结果可为阐明RPL27A基因对山羊脂肪细胞分化的调控机制提供材料。     

梅花鹿S100A16基因的克隆及生物信息学分析

为探索梅花鹿（Cervus nippon）S100A16基因序列及生物学特性，本研究根据GenBank数据库中牛、绵羊S100A16基因序列设计引物，以梅花鹿鹿茸顶端组织cDNA为模板，采用RT-PCR技术和分子克隆技术成功获得梅花鹿S100A16基因的cDNA序列。生物信息学分析发现，梅花鹿S100A16基因CDS区全长312 bp，编码103个氨基酸；蛋白含有11个磷酸化位点，有跨膜结构域，无信号肽，为在细胞内发挥作用的稳定蛋白；蛋白仅在C端含有S100蛋白家族经典的EF螺旋结构域，由12个氨基酸组成，N端EF螺旋结构域由15个氨基酸组成；蛋白C端含有FGF-1蛋白结合位点；梅花鹿S100A16蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成；三级结构显示该蛋白有2个Ca²⁺结合位点；梅花鹿S100A16蛋白氨基酸序列与东欧马鹿同源性最高，为100%，与其他部分物种S100A16蛋白氨基酸序列构建系统进化树，分析表明S100A16基因在进化上比较保守，符合功能基因的特点。研究结果为进一步揭示梅花鹿S100A16基因的功能及表达机制提供依据。     

Cloning and Expression of Caprine Cationic Amino Acid Transporter Gene SLC3A1 cDNA Sequence

The objective of this study was to clone caprine cationic amino acid transporter gene SLC3A1 and investigate its mRNA expression in different tissues and its development regularity in small intestine.The cDNA sequence of caprine SLC3A1 gene was cloned with the primer which was designed according to mRNA sequence of Ovis aries and Bos taurus in GenBank.Then its expression was quantified by Real-time PCR in 11 tissues from goats at the age of day 1 and duodenum,jejunum and ileum from goats at the age of day 1,month 6,month 8,month 10 and month 12.The results indicated that cDNA sequence of SLC3A1 gene was obtained,and its homology with SLC3A1 gene in Ovis aries,Bos taurus,Sus scrofa,Homo sapiens,Mus musculus and Rattus norvegicus were 99%,97%,88%,86%,80%,79%,respectively.SLC3A1 gene was expressed in all of these collected tissues,whereas the expression level varied from tissues.Specifically,its expression in kidney,jejunum,ileum and colon were significant higher than that in other tissues at the age of day 1 and decreased systematically (P<0.05).The expression of SLC3A1 in small intestine at the same age of goat was ileum>jejunum>duodenum.SLC3A1 gene expression in duodenum at the age of day 1 was significant higher than that at the other ages (P<0.05),it decreased with age in jejunum,and there was no significant difference among ileum with age (P>0.05). In conclusion,SLC3A1 gene and b^0,+ cationic amino acid transporter system were mainly expressed in kidney and intestine.The expression of SLC3A1 gene was differentially regulated and distributed by developmental stages and segments of small intestine in goat.     

山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达与细胞凋亡的相关性

以贵州本地分离纯化的山羊痘病毒为试验材料,感染Vero细胞,通过台盼蓝、吖啶橙/溴乙锭荧光染色分析细胞的死亡及凋亡比例;经特异性PCR从山羊痘病毒基因组中分离出山羊痘病毒抗凋亡蛋白样基因,基因长531bp,含有完整的编码框,与绵羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的相似性为97%,因此确定为山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因。进一步研究山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因在Vero细胞中的表达,结果显示,病毒感染Vero细胞24h时没有检测到凋亡现象,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的mRNA水平最高;感染48h时,Vero细胞的凋亡率上升到13%,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达量随之下降。结果表明,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达量与Vero细胞的凋亡呈负相关,有助于病毒在细胞内的生存和侵染等过程。