鹅黑素皮质素受体-4基因的克隆与序列分析

黑素皮质素受体-4（Melanocortin receptor-4,MC4R）是其黑素皮质素受体MCR（MC1-5R）家族成员之一,属G蛋白偶联受体。它可与瘦蛋白、神经肽、α-黑素细胞刺激素等一起调节动物体重和采食量。参考鸡MC4R基因序列设计引物,克隆并测序了鹅MC4R基因。结果表明,鹅MC4R基因编码区全长996 bp,其核苷酸序列与鸡的同源性为95.3%,与人、牛、猪等哺乳动物同源性在75%-79%;其氨基酸序列与鸡的同源性达到98.5%。构建哺乳类、鸟类和鱼类MC4R基因核苷酸进化树显示,鹅较早地与哺乳类动物分化开来。分析MC4R蛋白的氨基酸残基特性参数表明,MC4R的7次跨膜结构与MC4R的亲水性区域、电荷密度以及氨基酸残基位于表面概率的变化规律相一致。     

飞行时间质谱法检测水牛黑素皮质素受体4基因多态性

应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)检测水牛黑素皮质素受体4(MC4R)基因的多态性(SNPs),为今后建立水牛辅助标记选择策略奠定基础。以水牛MC4R基因序列为模板,利用PCR扩增测序法筛查了水牛MC4R基因13个SNPs。为进一步验证筛选的可靠性,应用MALDI-TOF-MS针对380头水牛检测了8个标记的基因型。结果显示,平均检出率为98.0%,能够准确的检测出3种常见的基因型。所检SNP位点的平均最小等位基因频率(MAF)为0.24,平均杂合度为0.28,平均多态信息含量(PIC)为0.23。本研究建立的基于PCR测序法联合MALDI-TOF-MS检测水牛MC4R基因多态性的方法,具有快速、可靠和准确的特点,为今后开展水牛生产性状基因的SNP分型和检测等研究奠定了基础。     

黑素皮质素受体4基因多态性及与肌内脂肪含量相关性研究

利用PCR-RFLP技术检测75头乌金猪和41头长白猪黑素皮质素受体4(MC4R)基因的第7跨膜结构功能域D298N主效位点的遗传变异,并用最小二乘法模型分析MC4R基因对猪肌内脂肪含量的遗传效应。结果:乌金猪和长白猪MC4R基因第7跨膜结构功能域TaqⅠ-RFLP位点均存在多态性,基因型为AA、Aa和aa。长白猪AA基因型肌内脂肪含量高于Aa和aa基因型,但差异不显著(P0.05);AA基因型对PCR-RFLP的最小二乘值最大,证明该基因在该位点对肌内脂肪(IMF)含量的效应值最大。乌金猪肌内脂肪含量aa基因型显著高于AA和Aa基因型(P0.05),aa基因型对PCR-RFLP的最小二乘值最大,证明该基因在该位点对IMF含量的效应值最大。提示,乌金猪和长白猪的MC4R基因对肌内脂肪的调控是由不同的基因型所控制的。乌金猪可通过提高MC4R基因aa基因型的频率来增加肌内脂肪含量,达到改善乌金猪猪肉品质的目的。     

黑素皮质素受体1（MC1R）基因的研究进展

黑素皮质素受体1(melanocortin 1 receptor,MC1R)基因,也称为促黑素细胞激素受体(MSHR)基因,是由扩散位点(extension locus,E) 编码的,是控制动物黑色素合成的重要基因。作者对MC1R基因结构功能、作用机理、基因的定位与多态性检测进行了综述。     

鸡黑素皮质素受体-4多肽抗体的制备与鉴定

根据GenBank中报道的鸡黑素皮质素受体-4(melanocortin-4 receptor,MC4R)一级结构信息,用TMHMM 2.0和DNAstar软件分析MC4R蛋白的跨膜结构域、二级结构、疏水性、亲水性以及抗原性等,综合考虑抗体设计的其他因素,设计出1段15个氨基酸的多肽.将合成后的多肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联,用与BSA偶联的MC4R多肽免疫新西兰兔,3个月后获取血清,亲和纯化出抗MC4R多肽抗体.通过ELISA法检测效价,Western blot和免疫组化法检测抗体特异性.通过该方法得到了高效价与高特异性的鸡MC4R多肽抗体,ELISA法测定其效价可达到1∶128 000,而且该抗体可用于免疫组化,说明所制备的鸡MC4R抗体具有高特异、高效价等特点,将为鸡MC4R基因的功能研究提供物质基础.     

黑素皮质素受体4(MC4R)基因多态性与动物生长性能的相关性研究

黑素皮质素受体4(Melanocortin 4 receptor,MC4R)是G蛋白偶联受体(G Protein coupled receptors,GPCRs)超家族的一个成员,在动物的体重、能量稳态和采食量的调控中具有重要作用。综述了MC4R基因的结构与定位、生物学功能以及MC4R基因与动物生长性能的相关性研究进展。     

猪食欲肽受体2激动剂细胞筛选模型的建立及对天然中药提取物受体激动剂的筛选

本研究旨在构建猪食欲肽受体2（pOX2R）的真核表达载体,探究其对天然中药提取物的药理学活性。将成功构建的pcDNA3.1（+）-myc/pOX2R和报告质粒PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]分别瞬时转染HEK293T细胞,利用萤火虫荧光素酶报告基因检测法测定阳性细胞株在不同浓度激动剂Orexin A和Orexin B以及颉颃剂TCS作用下胞内cAMP水平。将目的质粒与报告质粒稳定共转染CHO-K1细胞,利用G418和潮霉素B进行抗性筛选,获得6株阳性细胞株和5株阴性细胞株。对具有促进食欲作用的18种天然中药材的36种提取物进行筛选,并用瞬时共转染了pcDNA3.1（+）-myc/pOX2R和PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]的HEK293T细胞作为研究对象,对阳性提取物进行剂量效应分析。结果显示,Orexin A与Orexin B单独作用细胞时,可以使萤火虫荧光素酶的活性提高,呈明显的剂量效应关系,当与颉颃剂TCS联合作用时,TCS可以颉颃激动剂对受体的激活作用。通过优化药物刺激时间和二甲亚砜（DMSO）用量后,建立了以pOX2R为靶点的稳定、可靠的激动剂细胞筛选模型。经过初筛和复筛,得到了甘草水提物、白莲子和山药醇提物3种可以使阳性细胞荧光素酶表达量升高的提取物。提取物在一定浓度范围内可以刺激胞内荧光素酶的表达,呈剂量效应关系。以上结果为筛选出可以提高猪生产效率的先导化合物及相关药物研究提供参考依据。     

黑素皮质素受体1(MC1R)在不同毛色羊驼皮肤组织中的表达与定位研究

旨在通过研究黑素皮质素受体1(MC1R)在羊驼皮肤组织中的定位与表达,探讨其在羊驼毛色形成中的作用机制及与毛色的相关性。选用成年白色羊驼与棕色羊驼为研究对象,采用免疫组织化学方法及免疫印迹法(Western blotting),对MC1R在羊驼皮肤中的表达进行定位和定量分析。结果,(1)免疫组化结果显示,MC1R蛋白在白色和棕色羊驼皮肤表皮、毛囊周围外根鞘组织、毛乳头以及毛球周围都呈阳性着色。在棕色羊驼,阳性表达部位主要分布于毛球顶部及表皮,呈强阳性着色。在白色羊驼,阳性表达部位主要在外根鞘及表皮,毛球部表达呈弱阳性。MC1R在棕色羊驼皮肤组织中极显著表达(P<0.01)。(2)Western blotting结果显示,羊驼皮肤组织粗蛋白提取物中存在分子量约35ku与兔抗MC1R多克隆抗体发生免疫阳性反应的蛋白条带,且棕色羊驼平均蛋白表达量显著高于白色羊驼,差异极显著(P<0.01)。MC1R在羊驼皮肤组织中的定位与表达量的不同与羊驼毛色表型之间存在一定的相关性。     

4个黄牛群体黑素皮质素受体1(MC1R)基因变异研究

为了评价E(extension)座位对牛毛色性状的影响,采用DNA序列分析和PCR-RFLP技术对云南地区4个黄牛群体(3个本地群体和1个引进品种)的黑素皮质素受体1(MC1R)基因的编码区进行了基因特征分析和群体变异检测。结果,在文山黄牛、昭通黄牛和短角牛中发现E+和e2种等位基因,检测到E+/E+、E+/e和e/e3种基因型。在文山黄牛中E+和e等位基因的频率分别为0.54和0.46,在昭通黄牛中分别为0.70和0.30;而在迪庆黄牛中共检测到E+、ED和e3种等位基因,它们的频率分别为0.76、0.14和0.10,该群体存在E+/E+、ED/ED、E+/ED、E+/e和ED/e5种基因型,未发现e/e型个体。与所研究个体的毛色性状相联系,发现E座位对牛的毛色有重要影响,E+和ED等位基因与黑色表型有关,而e等位基因与红色表型有关,但黄色、棕色和红色表型还与其它座位基因相关联。     

MC4R基因表达及其与鸡屠宰性状的相关分析

根据鸡MC4R mRNA和看家基因β-actin mRNA序列,分别设计1对引物,以半定量RT-PCR法研究不同品种鸡肾上腺中MC4R基因mRNA表达水平,并分析了其与屠宰性状间的相关关系。结果表明,京海黄鸡公鸡MC4R基因在肾上腺中的表达水平显著高于尤溪麻鸡公鸡(P<0.05);京海黄鸡公鸡的胴体重、胸肌重、腿肌重与MC4R基因在肾上腺中表达水平存在极显著相关(P<0.01);尤溪麻鸡公鸡的胴体重与MC4R基因在肾上腺中表达水平存在极显著相关(P<0.01),胸肌重、腿肌重与MC4R基因在肾上腺中表达水平存在显著相关(P<0.05)。     

MC4R基因表达及其与鸡屠宰性状的相关分析

根据鸡MC4R mRNA和看家基因β-actin mRNA序列,分别设计1对引物,以半定量RT-PCR法研究不同品种鸡肾上腺中MC4R基因mRNA表达水平,并分析了其与屠宰性状间的相关关系。结果表明,京海黄鸡公鸡MC4R基因在肾上腺中的表达水平显著高于尤溪麻鸡公鸡（P＜0.05）;京海黄鸡公鸡的胴体重、胸肌重、腿肌重与MC4R基因在肾上腺中表达水平存在极显著相关（P＜0.01）;尤溪麻鸡公鸡的胴体重与MC4R基因在肾上腺中表达水平存在极显著相关（P＜0.01）,胸肌重、腿肌重与MC4R基因在肾上腺中表达水平存在显著相关（P＜0.05）。     

Study on Melanocortin-4 Receptor mRNA Expression in Goats Grazed in Leigongshan Mountain Area

In order to understand the differential expression among tissues or breeds of grazed goat,β-actin gene was used as control,the expression levels of melanocortin-4 receptor (MC4R) mRNA in 7 tissues of Qiandongnan small Xiang goat,Guizhou White goat,Guizhou Black goat,Qianbei Ma goat and Nanjiang Yellow goat were detected by Real-time fluorescence quantitative PCR technique with double standard curve method.The results showed that MC4R mRNA was expressed in all 7 tissues of 5 grazed goat breeds,the expression levels of subcutaneous fat and kidney were the highest,the expression levels of liver was the second,the expression levels of lung and heart were the third,and the expression levels of semimembranosus muscle and longissimus muscle were the lowest.There were no differences of the expression level of MC4R mRNA in liver among different breeds.In subcutaneous fat,kidney,lung,heart,semimembranosus muscle and longissimus muscle,the highest expression levels of MC4R mRNA were all observed in Guizhou White goat.The results suggested that for grazed goats,the expression levels of MC4R mRNA existed tissue differences,and except for the liver,it existed breed differences,too.This research laid a basis for molecular marker assisted selection of growth traits,carcass traits,and meat quality traits of grazed goat.     

藏猪黑素皮质激素受体-4基因TaqI多态性分析

藏猪是我国青藏高原特有的小型原始地方猪种,文中采用PCR-RFLP技术分析了藏猪黑素皮质激素受体-4(MC4R)基因TaqI酶切位点多态性。结果表明:藏猪MC4R基因TaqI酶切位点优势基因型为11,基因型频率达93.56%,与国内梅山猪、二花脸猪、民猪和金华猪等较接近,与汉普夏、大白、杜洛克等外种猪差别较大。     

鸡胚骨骼肌细胞增殖和融合培养模型的建立

本实验建立了鸡胚骨骼肌细胞增殖和融合培养模型,增殖和融合培养液分别为添加5％胎牛血清(FCS)和添加10％FCS+0．5％鸡胚浸出液的DMEM培养液。结果表明:培养的骨骼肌细胞增殖和融合情况良好,可存活1周以上。胰岛素(INS,10-1 000 ng/mL)处理48 h显著促进骨骼肌细胞增殖,而100-1000 ng/mL INS处理96 h可显著促进骨骼肌细胞融合。该模型可用来研究激素、生长因子或营养物质对骨骼肌细胞增殖和分化的影响。     

稳定表达犬瘟热病毒Nectin4受体的Vero细胞系构建

为提高病毒的分离效率,本试验设计构建了能够表达犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV）上皮细胞Nectin4受体的Vero细胞。为增加蛋白定位的准确性并易于鉴定,使用Igκ信号肽替换原有信号肽序列并添加了HA标签,在Nectin4 ORF后串联IRES-Puro序列并连入pCI-Neo真核表达载体,得到完整的转染载体pCI-N4。不同浓度嘌呤霉素孵育Vero细胞得到最小筛选浓度为6 μg/mL。pCI-N4重组质粒转染Vero细胞后使用6 μg/mL嘌呤霉素筛选,5~7 d后出现具有抗性的细胞簇,有限稀释法连续单克隆纯化3代后获得稳定表达的细胞系。构建细胞系传代至15代能检测到Nectin4 mRNA转录,Western blotting检测筛选细胞得到约60 ku目的蛋白表达,间接免疫荧光检测显示纯化细胞蛋白表达丰度高且表达均一,激光共聚焦观察Nectin4目的蛋白定位于细胞膜,说明筛选的Vero-Nectin4细胞系能够稳定表达,表达蛋白能够满足作为CDV受体的结构要求。临床CDV阳性病料经研磨滤菌处理后接种构建细胞系能够产生典型的合胞体细胞病变,Vero对照组盲传3次未有病变。分离毒株TICD₅₀=10^-5.9/0.1 mL。构建的Vero-Nectin4细胞系可用于CDV分离。     

鸡TLR4基因表达水平与沙门氏菌感染关系的研究

为了研究鸡TLR4（toll like receptor 4）基因表达在调控鸡沙门氏菌感染中的作用,80只3日龄SPF鸡按随机分为2组,处理组经口注射鸡白痢沙门氏菌悬液10⁸ CFU/mL 0.50 mL,对照组注射同剂量生理盐水。每个处理组分别在感染后1、3、7和14 d随机取8只鸡处死,迅速取脾脏样品用于RNA提取。采用SYBR GreenⅠ染料实时荧光定量PCR（QPCR）,比较处理组和对照组TLR4基因mRNA相对表达量的变化。结果显示,在4个时间点,与对照组相比,处理组TLR4基因高表达,差异显著(P<0.05);尤其在感染后3和7 d,差异达到极显著水平(P<0.01)。结果表明,鸡沙门氏菌感染后,TLR4基因mRNA表达上调,TLR4基因在沙门氏菌感染中发挥重要作用。