鹅细小病毒感染雏鹅血液的蛋白/酶活性及同工酶变异性研究

为了解鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)侵染的病理学致病机理,探究蛋白/酶的分子变异特征,本研究对GPV感染雏鹅血液中的蛋白质、保护酶、蛋白酶活性及其同工酶结构和功能等进行了生化—分子生物学分析.结果显示,GPV感染雏鹅的血液中(血浆和血细胞)蛋白酶活性和蛋白质含量、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)及酯酶(Est)活性分别是对照组的1.46和1.63、1.51和1.49、1.50和1.14、1.36和1.73、1.30和1.53倍.GPV感染雏鹅的血浆中,SOD同工酶增加了2条谱带(134和239);Est同工酶增加2条快区主带,减少了2条慢区谱带;酶蛋白减少1条慢区谱带(304);蛋白质新增加4条主带(131、86、43、33 ku).而血细胞新出现2条POD同工酶谱带(93和203),分别增加了1条(160)中区SOD同工酶谱带、1个快区Est同工酶谱带、2个慢区酶蛋白谱(223和330)和4个蛋白主带(144、104、58、53 ku).提示GPV感染应激与寄主基因表达的蛋白质、保护酶、蛋白酶及同工酶相互网络协作会引起酶的谱型、活性等生化特征变异,直接或间接调控代谢途径与病理生化性能,增强机体对入侵GPV的防御应激性能.因此,蛋白质、保护酶、蛋白酶及同工酶是GPV感染的应激靶标,可作为雏鹅易感GPV致病机制研究的有效标记.     

鹅细小病毒感染雏鹅的主要组织相容性复合体变异性研究

为了探究MHC基因的多态性与抗病性之间的相互关联作用。采用GPVYZ感染雏鹅,经Triton X-100分级分离MHC,将Sephadex G-200凝胶柱在Bio Gel P-100凝胶柱色谱工作站上串联,分步聚集纯化鹅肝脏MHC,SDS-PAGE分析鉴定。结果显示,初级分离的MHC主带区为30~90 ku、35 ku、20 ku,纯化的鹅肝脏MHC的特征蛋白带是30 ku,33 ku,40 ku,42 ku低分子量蛋白,与MHC类分子重链/α和轻链/β一致,提示重链与轻链折叠形成多态性MHC类分子,可作为致病研究的候选标记基因。YZ0明显缺失84 ku、61 ku蛋白主带,YZ组明显缺失45 ku蛋白峰p2和42 ku蛋白峰p1特征带,新增加34 ku峰p2和38 ku蛋白峰p1带;提示GPV感染与鹅肝脏MHC基因表达蛋白发生相互作用,45 ku、34 ku MHC是GPV的敏感蛋白,42 ku、38 ku蛋白带也与GPV的感染密切相关,MHC重链基因是GPV的易感基因。     

鹅细小病毒弱毒株选育的研究

应用番鸭胚成纤维细胞（MDEFC）培育出适应MDEFC增殖并产生细胞病变的鹅细小病毒弱毒疫苗株，同时测定了该弱毒株的部分生物米特性。结果显示：该弱毒株已失去对1日龄雏番鸭的致病性，在雏番鸭体内连续肓传5代，未见毒力反强现象；该弱毒株对MDEFC的TCID50稳定在10^-5-10^-6/0.1ml；1日龄雏番鸭免疫接种后7天攻毒可获100％保护，表明该弱毒株安全、免疫原性良好。     

新型鹅细小病毒研究进展

鸭细小病毒病是由鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)或番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)引起的一种传染病。经典MDPV和GPV毒株引起的病鸭主要症状为腹泻、脚软、渗出性肠炎,三周龄内雏鸭感染发病率和死亡率都很高。但是2008年下半年以来,福建省、浙江省、安徽省及江苏省等地的雏半番鸭和樱桃谷鸭陆续出现一种新型细小病毒病,该病发病率10%~30%,病死率低于3%,临床症状主要为软脚、短嘴和生长障碍。通过对该病病原进行全基因组测序及系统发育树分析,结果发现该病原与鹅细小病毒亲缘性很近。本文通过比较新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,N-GPV)与经典的MDPV和GPV在基因组、感染宿主范围和致病性的区别,为新型鹅细小病毒病的防控提供理论依据。     

鹅细小病毒

鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV),在我国原称为小鹅瘟病毒(Gosling plague virus),属于细小病毒科(Parvovirus),细小病毒属(Parvovirus),是引起3—30日龄雏鹅急性、亚急性败血性传染病的病原体。     

鹅细小病毒分子生物学研究进展

论述鹅细小病毒基因组的结构特点、非结构蛋白与结构蛋白的结构和功能以及分子生物学诊断与防治等方面的研究近况,并对其有待研究的几个方面进行说明。     

鹅细小病毒诊断与防治的研究进展

鹅细小病毒病或称小鹅瘟(GooseParvovirus,GPV),是由鹅细小病毒引起的雏鹅和雏番鸭的一种急性或亚急性败血性传染病。该病于1956年由方定一教授首次在江苏扬州发现。20世纪60年代中后期,在亚洲、欧洲、美洲等国家相继报道该病的发生与流行。该病主要侵害3～20日龄的雏鹅,也感染雏番鸭,传播快,发病率和死亡率较高,特征表现为水样腹泻,渗出性肠炎,乃至腊肠样栓塞。     

Study on the Oxidase/Dehydrogenase Enzymes and Isozyme from Tissues and Organs of Goslings Infected by Goose Parvovirus

The enzyme was efficient active gene product of catalyzing metabolic pathway.Stress environment and genetic basis led the differences of isozyme structure or activity, which specific changes of the kinds and activities of enzyme were showed in different tissues and developmental stages.Here, lactate dehydrogenase (LDH), alcohol dehydrogenase (ADH), peroxydase (POD) and catalase (CAT) were respectively extracted from brain, heart, liver, lung and spleen tissues and organs of goslings infected by goose parvovirus (GPV) and control group.The results of PAGE and biochemical analysis showed that there respectively were 3 and 1 slow-zone CAT isozyme bands deletion in liver and spleen of goslings infected by GPV.There respectively were 1 new enzyme band of POD isozyme in the brain, heart and spleen of goslings infected by GPV, but 1 enzyme band of POD isozyme deletion in the lung of goslings infected by GPV.It only showed 1 to 2 slow-zone LDH and ADH isozyme bands in organ and tissue of goslings infected by GPV, and deleted 1 slow-zone ADH isozyme band in the lung of goslings infected by GPV.The activity of ADH from goslings infected by GPV were reduced 13.61% to 61.08%, but increased 1.2 times in the heart of goslings infected by GPV.The activity of POD, CAT and LDH from goslings infected by GPV were higher 1.2 to 6, 1.5 to 3.5, 2 to 2.5 times than that of control group, respectively.The activity of CAT reduced 40.29% and 94.68% in the brain and lung of goslings infected by GPV.The activity of LDH reduced 75.93% and 91.81% in liver and lung of goslings infected by GPV.Those results indicated that the interaction of GPV stress and host oxidase/dehydrogenase enzyme gene expression resulted in the biochemical characteristics variation of activity and isozyme patterns of oxidase/dehydrogenase enzyme, and directly or indirectly affected metabolic approach and physiological pathological function on goslings infected by GPV.Therefore, sensitive oxidase/dehydrogenase was the effective marker of pathological mechanism on investigation of virus genotype interaction with genetic susceptibility of the host.     

番鸭细小病毒和鹅细小病毒生化及基因组特性的比较

番鸭细小病毒莆田株（MPV-P）和鹅细小病毒莆田株（GPV-P）分别感染的番鸭胚尿囊液经氯仿处理、PEG沉淀和Sepharose4B柱纯化。纯化样品在电镜下观察，均见到实心和空心2种病毒粒子。病毒粒子呈圆形，立体对称，无囊膜，直径为20-24nm。经SDS-PAGE分析，MPV和GPV均呈现3条结构蛋白带。MPV结构蛋白的相对分子质量约为VP1 89000、VP2 78000和VP3 61000，其中VP3为主要结构蛋白。GPV要相对分子质量与MPV有微小差别。MPV和GPV核酸均为单链DNA，长度约为51000bp。分别以MPV核酸和GPV核酸为模板，加到无引物的DNA聚合酶Ⅰ大片段合成体系中，合成产物经1%琼脂糖凝胶电泳，均可见长度约为5600bp的双链DNA带，证明MPV和GPV核酸的3'末端具有发夹结构。对这2种病毒核酸及经Klenow合成的双链核酸进行限制性内切酶分析，两者的酶切结果明显不同，表明MPV和GPV核酸在一级结构上存在明显差异。以上结果证明，MPV和GPV不但在致病性上有显著养异，而且在核酸结构上也有明显差异。     

GPV感染雏鹅的保护酶活性与同工酶变异性研究

酶是催化代谢途径的高效活性基因产物,应激环境和遗传基础的不同导致同工酶结构或活性差异,使不同组织和发育阶段的酶种类和活性表现特异性变化。采用生化分析实验技术和PAGE分析GPV感染雏鹅保护酶(POD、ES、SOD)的活性及同工酶特征变异,结果表明,GPV感染雏鹅的脑、心、脾组织新出现1条POD同工酶带,肺组织消减1条同工酶带;GPV感染雏鹅的肝、肺、心组织SOD同工酶谱带新增加2条,脑、脾组织新增加1条,脑、心、脾分别缺少慢区、中区、快区酶带;GPV感染雏鹅的心、脾组织ES同工酶分别出现2、3条新酶带,脑、肝、肺组织新出现1条酶带;POD、SOD、ES活性不同程度分别增强1.2~6倍、1~1.7倍、1~2倍,肝中最显著(6,1.7,2倍)。提示GPV感染应激与寄主保护酶基因表达的互作作用,引起酶的谱型、活性等生化特征变异,直接或间接调控代谢途径与病理生化性能,因此,保护酶是GPV感染应激的敏感酶,可作为GPV与宿主易感性互作致病机制研究的有效标记。     

Study on the Isozyme Variability and Activity of Protein/Enzymes from Gosling Blood Infected with Goose Parvovirus

In order to understand the pathogenesis of GPV (goose parvovirus),and explore the molecular variation of protein/enzyme,the protein,protective enzymes (Est,POD,SOD,protease) and isozyme from goslings blood infected with GPV were analyzed by biochemistry and molecular biology.The results showed that the activity of protease,content of protein,the activities of POD,SOD and Est (in plasma and blood corpuscle) from goslings infected with GPV were 1.46 and 1.63,1.51 and 1.49,1.50 and 1.14,1.36 and 1.73,1.30 and 1.53 times than that of control group,respectively.In the plasma of goslings infected with GPV,2 bands (134 and 239) of SOD isozyme appeared,2 fast-zone enzyme band appeared and 2 slow-zone enzyme band deleted in Est isozyme,1 slow-zone zymoprotein band (304) deleted and 4 new main protein bands (131,86,43 and 33 ku) appeared.In the blood corpuscle of goslings infected with GPV,2 new enzyme bands (93 and 203) of POD isozyme,1 medium-zone enzyme band (160) of SOD isozyme,1 fast-zone enzyme band of Est isozyme,2 slow-zone zymoprotein band (223 and 330) and 4 new main protein bands (144,104,58 and 53 ku) appeared.These results indicated that the interaction of GPV stress and host protein/enzymes and isozyme gene expression would result in the biochemical characteristics variation of activity and isozyme patterns of protein/enzymes,and directly or indirectly affect metabolic approach and pathological biochemical function on goslings infected with GPV,and enhance the defense and stress ability of GPV.Therefore,protein/enzymes and isozyme might be sensitive enzyme of GPV infection stress,and were effective marker of pathological mechanism on investigation of virus genotype interaction with genetic susceptibility of the host.     

鹅细小病毒VP3基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

为真核表达鹅细小病毒（GPV）融合蛋白VP3基因,本研究通过PCR扩增GPV FY89株VP3基因,并将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac/HBM-TOPO中,经双酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-VP3,将经PCR鉴定正确的rBacmid-VP3转染Sf9昆虫细胞,连续传代后,细胞病变明显。SDS-PAGE分析结果表明成功表达了分子质量约为61 ku的VP3蛋白;Western blotting分析结果表明重组VP3蛋白具有良好的抗原性。     

鹅细小病毒安徽分离株NS和VP基因的克隆及序列分析

为研究安徽省鹅细小病毒（goose parvovirus,GPV）的遗传变异特征,本研究通过PCR扩增获得GPV基因AH,并与天鹅、番鸭、雁鹅等宿主的GPV相应基因序列进行了比对。序列分析可见,AH基因包括完整的NS和VP基因,长度分别为1 884和2 199 bp,分别编码2个非结构蛋白和3个结构蛋白。遗传进化分析显示,安徽分离株AH基因与重庆分离株毒株RC16及安徽分离的强毒株Y、E、Yan-2等基因序列的遗传距离较近;而与安徽分离的鸭源细小病毒株DS15和匈牙利分离株Virulent B,尤其是与疫苗株SYG61v遗传距离较远。同源性分析结果表明,AH-NS基因与毒株RC16核苷酸序列同源性最高,为99.6%;与疫苗株SYG61v同源性最低,为94.3%;AH-VP基因与毒株RC16的核苷酸序列一致,而与毒株DS15同源性仅为95.2%。安徽GPV AH基因序列与强毒株的基因位点一致,在VP3基因的第797、1 141、1 144、1 169和1 185 bp处分别为G、A、G、C、T,结合该毒株引发疾病的严重程度,符合高致病力毒株特点。本试验结果表明,GPV同源性普遍较高,宿主范围较广泛,对不同品种水禽均有较强的侵染力。     

鹅细小病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达及纯化

将鹅细小病毒 (GPV) VP2基因插入原核表达载体 p PROEX- HTb,获得重组表达质粒 p PROEX- HTb- VP2。将其转化大肠杆菌 DH5α,用 IPTG诱导表达 ,表达菌体蛋白中可产生与预期大小相符的约 72 0 0 0的蛋白。以光密度扫描对该表达产物进行定量分析 ,表达产物约占菌体总蛋白的 14 %。经 His- tag金属螯合层析纯化 ,获得纯度较高的 6 His- VP2融合蛋白。 Western- blot结果表明 ,所得蛋白与鹅抗 GPV高免血清有较好的免疫反应性 ,说明在 VP2的 N端融合 6个组氨酸不影响其与特异抗体结合的活性。     

区别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的PCR-RFLP方法的建立

根据GenBank登录的鹅细小病毒（GPV）和番鸭细小病毒（MDPV）非结构蛋白（NS）基因特征,本研究设计1对特异性引物对GPV和MDPV基因组DNA进行PCR扩增,目的片段大小均为810 bp,并对PCR产物进行切胶回收。用EcoRⅠ酶对GPV和MDPV特异性胶回收产物进行酶切鉴定,结果显示MDPV经EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳检测片段为2段,大小为530和280 bp;而GPV经EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变。本研究建立了一种快速区别GPV和MDPV感染的检测方法,可对番鸭感染水禽细小病毒的情况进行快速鉴别诊断。     

鹅细小病毒VP1-VP3非重叠区基因的克隆与序列分析

通过克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)分离株VP1-V3非重叠区基因,并对其进行序列分析,为鹅细小病毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断奠定理论基础.进行鹅胚病毒增殖,收集尿囊液,提取基因组,参考发表的B株序列,设计合成一对引物,经PCR扩增,克隆VP1-VP3基因,筛选阳性克隆,对其进行序列测定及同源性分析.结果表明,克隆的基因片段为901 bp,VP1-VP3基因共594 bp,编码198个氨基酸;弱毒株之间亲缘关系很近,核苷酸同源性99.5％～100％,氨基酸同源性98.5％～100％;强毒株与B株亲缘关系较近,核苷酸同源性96.6％,氨基酸同源性97.5％;弱毒株与强毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性92％～93％,氨基酸同源性96％～97.5％;弱毒株与B株亲缘关系最远,核苷酸同源性92.5％～93％,氨基酸同源性93.9％～95.5％.说明强毒株与弱毒株之间核苷酸序列存在差异.     

鹅细小病毒BC1105株的分离鉴定

2011年5月中旬在吉林省白城地区的某养鹅场疑似小鹅瘟病死雏鹅的肾脏、肝脏、脑和脾脏组织中分离到1株病毒,选用未免疫小鹅瘟疫苗的健康母鹅所产的14日龄鹅胚,进行鹅胚接种试验,连续传代、血凝试验、琼脂扩散试验、电镜观察、PCR鉴定和动物回归试验,初步确定该病毒为鹅细小病毒,命名为BC1105株。