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为快速检测出食用肉类中掺假物质,确保消费者切身利益,维持正常市场秩序,提升贵州省产品质量监督检验的检测能力,采用实时荧光定量PCR对猪源性成分和牛源性成分进行检测.结果表明:荧光PCR可以用来检测猪、牛等动物源性成分,且检测灵敏度为1％;荧光PCR检测动物源性成分提高了检测效率及灵敏度,降低了假阳性机率.     

基于TaqMan PCR鉴定猪源性成分的引物和探针研发

为了研发具有自主知识产权的猪源性成分检测的引物和探针,比对猪、牛、羊、马、鸡、鸭、兔、鹅等8种动物的线粒体基因组,筛选并设计猪特异性的引物和探针组合进行荧光定量PCR。研究结果表明,所研发的猪源性成分检测的引物和探针仅对猪相关DNA模板有典型扩增曲线,对其他动物来源的DNA模板无扩增,具有高度的猪源性特异性。灵敏度实验表明,利用此引物和探针的检测方法具有高度的灵敏度,可达1 pg级。肉制品中猪源性定量检测实验说明此方法具有较好的定量检测能力。此引物和探针组合适用于猪源性食品和农畜产品的检验检测。     

肉中猪源性成分Real-time PCR定量检测技术

【目的】建立一种快速、准确的肉中猪源性成分定量检测方法。【方法】首先从GenBank数据库中筛选猪特异性的微卫星DNA,根据微卫星DNA核酸序列设计引物,对常见10种动物基因组DNA进行PCR扩增,通过有无扩增产物判断筛选的微卫星DNA对猪源性成分的特异性。然后根据微卫星DNA核酸序列,设计特异性引物和探针,建立猪源性成分Real-time PCR检测方法,采用双标准曲线分别对猪源性成分和总动物源性成分进行定量,计算猪源性成分的百分含量。【结果】筛选到猪特异性微卫星DNA（Accession EF172428）,根据其序列设计的引物SEQ-sus2-F/R只能从猪基因组DNA中扩增出目的条带,其他动物的基因组均无目的条带扩增。建立的Real-time PCR检测方法灵敏度为0.02 ng/25 μL反应体系。该方法能够准确检测出混合DNA样品中猪源性成分和混合肉样品中猪源性成分,百分误差分别约为1.32%和1.06%—7.12%。【结论】本研究利用Real-time PCR技术建立的定量猪源性成分的检测方法可以用来检测猪源性成分在混合样品中的百分含量。     

猪·牛·羊源性成分实时等温扩增检测方法的建立

[目的]建立一种快速检测猪、牛、羊动物源性成分的实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。[方法]针对猪、牛、羊物种ND1、COXⅠ、cytB特异性基因分别设计LAMP引物,通过实时检测荧光强度判断反应结果。[结果]猪、羊源性成分的检测灵敏度为10 pg,牛源性成分的检测灵敏度为1 pg。对模拟掺杂肉制品检测时,掺杂猪肉、牛肉、羊肉的检出限为0.01%。[结论]该研究所建立的LAMP法特异性强、灵敏度高,能有效地对肉制品掺杂的猪、牛、羊源性成分进行检测,可作为肉类鉴别的一种快速检测方法。     

饲料中牛、羊、猪、鸡源性成分的PCR检测方法及其应用

 【目的】建立鉴定饲料中牛、羊、猪、鸡源性成分的PCR方法,进一步完善现有的动物源性饲料检测方法。【方法】根据牛、羊、猪、鸡、鱼以及马的mtDNA的16S rRNA基因序列选用了一对通用引物,初步检测出含有动物源性成分的样品;然后针对牛、羊、猪、鸡4种动物线粒体mtDNA中的保守序列,分别选用了4对特异性引物对检测出的样品进行PCR扩增,扩增的目的片段大小分别为271、274、149和266 bp。【结果】通过利用通用引物、优化PCR反应体系及其条件,建立了从未知样品中简便而快速的检测出是否含有动物源性成分的PCR方法;利用所选的针对不同动物的特异性引物,建立了鉴定牛、羊、猪、鸡这4种动物源性成分的方法,此方法最低检测限可达0.1%。【结论】建立的检测饲料中动物源性成分的方法操作简便,价格低廉,结果准确,可靠,可作为饲料中动物源性成分的鉴定方法之一。     

利用通用引物检测天然宠物饲料中的动物源性成分

[目的]为天然宠物饲料的快速筛查和种类鉴定提供有效的技术支持.[方法]根据动物线粒体细胞色素b基因序列,设计1对通用引物,建立动物源性成分的检测方法.[结果]通过设计并合成通用引物、优化PCR反应体系及其条件,建立了1种检测样品中动物源性成分的简便、快速PCR方法.该检测方法灵敏度高,最低检测限可达0.001％.[结论]该检测方法操作简便、结果准确、灵敏度高,可作为天然宠物饲料中动物源性成分的鉴定方法之一.     

饲料中牛羊源成分的快速筛选

利用荧光定量PCR进行饲料中牛羊源性成分的快速筛选研究,可以快速检测饲料中是否含有牛羊源性成分,避免了常规检测中大量阴性样品带来的巨大工作量,并首次对饲料中牛羊源性成分进行定量分析．推导出计算公式,且灵敏度比常规的PCR检测方法高100倍以上。     

房山区4种动物源性成分PCR检测试验

本研究利用牛、羊、猪、鸡线粒体mtDNA中保守序列16s rRNA,设计一对动物的通用引物,检测了含有动物源性成分的样品,同时设计了针对牛、羊、猪、鸡mtDNA中的保守序列,选择4对特异性引物,扩增得到目的片段大小分别为271 bp、274 bp、212 bp和266 bp。利用通用引物,优化了PCR反应体系及其反应条件,建立了从未知样品中快速获取动物源性成分检测的PCR方法;利用牛、羊、猪、鸡特异性引物,建立了PCR方法快速鉴定牛、羊、猪、鸡这4种动物源性成分的方法。     

同步检测动物源性成分的四重PCR的条件优化和检出限分析

为建立肉制品中牛、羊、猪、鸡动物源性成分的快速高效多重PCR检测方法,利用4对牛、羊、猪和鸡源特异性PCR引物(靶基因序列来源于线粒体基因组)对多重PCR反应条件进行优化,并确定该检测方法的检出限。结果表明:四重PCR方法最佳反应条件为牛、羊、猪、鸡源特异性引物浓度分别为0.16μmol∕L、0.40μmol∕L、0.16μmol∕L、0.16μmol∕L,退火温度58℃,退火时间45 s,循环次数40。在最佳反应条件下,所建立的牛、羊、猪和鸡4种动物源性成分四重PCR的g DNA检出限为25 pg。应用优化后的四重PCR方法对20份市售肉制品样本进行盲样检测,验证鉴别方法的准确性,结果与现行标准的检测结果一致,掺假率达45%。本试验为该4种动物源性成分的快速检测提供了技术支撑。     

基于TaqMan实时荧光PCR检测肉制品中羊源性成分

随着动物源性产品(农产品、食品和饲料)中掺假造假事件不断增多以及动物来源性疾病的传播风险逐渐加大,作为保障食品安全和维护消费者权益的高效检测手段,动物源性成分的定性和定量检测技术已成为国内外的研究热点。本研究通过比对分析8种动物的线粒体全基因组序列筛选出羊源性成分特异性的引物和探针组合进行基于实时荧光PCR技术的羊源性成分鉴定。结果表明,所研发的羊源性成分检测的引物和探针具有高度的特异性,同时具有较好的灵敏度(可检测到1 pg的DNA)。羊肉制品中羊源性定量检测试验结果说明,此方法具有较好的定量检测能力。综上所述,以此引物和探针为基础的检测方法适用于羊源性食品和农畜产品的动物源性成分检测。     

聚合酶链式反应技术在食品源性分析中的应用

[目的]比较不同聚合酶链式反应(PCR)技术在食品源性分析中的应用,分析引物、荧光染料和探针的特点及其发展前景。[方法]介绍PCR、荧光定量PCR技术,比较该技术及荧光标记基团的特性,及其在食品源性成分鉴定方面的实际应用。[结果]通过完善DNA提取方法、优化反应体系、设计特异性引物或探针均能有效提高PCR检测的灵敏度及准确性。[结论]采用PCR、荧光定量PCR技术能有效地实现食品中源性成分鉴定,且方法具有高灵敏度、高特异性、高效率等优势,能满足实验室对食品中源性成分的检测分析。     

猪源性成分的PCR检测技术优化研究

为确定食品和饲料中的猪源性成分,本试验优化了PCR检测猪源性成分的反应体系.试验采用20 μl的PCR反应体系,分别测定Taq DNA聚合酶为0 U、1 U、2 U、3 U时;25 m mol/L的MgCl2为0、2、4、6μl时;dNTP为0、0.1、0.2、0.4μl时,其他PCR反应因素为最大量的结果.结果表明:优化的猪源性成分PCR反应体系中Taq DNA聚合酶、25 mmol/L MgCl2、dNTP适宜浓度分别为2 U,2μl,0.4μl.优化后的反应体系对猪肉DNA最低检测浓度为0.04ng/μl.本研究优化出的猪源性成分PCR反应体系经二重PCR反应技术进行验证,不仅快速,简便,准确性与灵敏度高,并且经济、高效.     

食品和饲料中猫源性成分实时荧光PCR检测方法

采用实时荧光PCR方法对食品和饲料中猫源性成分进行TaqMan探针检测.结果表明:该检测方法具有特异性强、灵敏度高的特点,在动物和植物材料基质中,均能检出0.01％的猫源性成分,适用于市售食品和饲料中猫源性成分的检测.     

基于PCR-LFB的羊源性成分检测方法建立

为建立基于样品DNA快速制备、PCR-LFB的羊源性成分检测技术,为动物源性成分的检测提供新思路。进行动物源性成分DNA快速提取,针对绵羊线粒体基因组序列设计基因特异性引物及探针进行PCR扩增,制备LFB对羊源性成分核酸扩增物进行检测。结果表明:样品DNA快速制备技术操作简单、耗时少;PCR-LFB对羊基因组DNA检测灵敏度为常规琼脂糖凝胶电泳的10倍,特异性为100%,对9种商业化羊肉样品均可检出。建立的羊源性成分PCR-LFB检测技术,具有简单、快速、准确的特点。     

基于TaqMan探针的实时荧光LAMP检测肉制品中鸭源性成分研究

本研究建立1种基于TaqMan探针的实时荧光环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）(TaqMan—LAMP)检测方法,用于肉制品中鸭源性成分的快速鉴别。以鸭线粒体cytb基因的保守序列设计特异性引物,优化并建立基于TaqMan探针的实时荧光LAMP检测方法,对该方法进行特异性、灵敏度试验;同时与《GB/T38164—2019常见畜禽动物源成分检测方法 实时荧光PCR法》作比较,对市售肉制品进行检测,验证本方法的准确性。所建立的TaqMan-LAMP检测方法特异性强,仅鸭肉基因组DNA呈现特异性扩增曲线,30 min内完成检测,灵敏度为0.001%(w/w),重复性好,批次内变异系数CV为1.99%,对47份肉制品进行检测,检测结果与国标法相比,相对敏感性、特异性和符合率均为100%。本研究建立的鸭源性成分TaqMan-LAMP检测方法检测快速、特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于肉制品中鸭源性成分的快速检测。     

肉制品中羊源性成分PCR检测方法的建立及其应用

根据羊特异性线粒体DNA片段,设计合成一对引物,并以生、熟羊肉为材料,建立了肉制品中羊源性成分的PCR检测方法,并用于生、熟羊肉的鉴定。PCR扩增产物DNA片段大小为295 bp。用Sau3AⅠ限制性内切酶进行酶切鉴定,酶切产物为204 bp和91 bp。PCR产物和酶切产物的片段大小与预期目标相符,其检测灵敏度达到0.225 pg DNA。合成的羊源性DNA引物可以扩增出羊肉的目的 DNA片段,而对马、狗、驴、兔和猪等14种动物DNA无扩增效果。利用该法对83份羊肉制品进行鉴定,检出率为100%。结果表明,该法快速简便,且具有较高的特异性和敏感性,可用于市售牛肉制品中牛源性成分的鉴定。     

广西反刍动物饲料和动物源性饲料产品中牛羊源性成分监测

为了监测广西反刍动物饲料和动物源性饲料产品中的牛羊源性成分,掌握动物饲料安全情况,农业部饲料质量监督检验测试中心（南宁）于2005～2009年,应用实时荧光PCR和PCR对广西南宁、柳州、防城港、北海、钦州、桂林等市974批反刍动物饲料及动物源性饲料产品进行牛羊源性成分的抽样检测。结果表明,2005～2006年共有12批产品被检出含有牛羊源性成分,其涉及所有抽检产品类别和饲料生产、经营、使用3个环节;2007—2009年的抽检合格率均达100％。说明广西的反刍动物饲料和动物源性饲料的牛羊源性成分呈现下降趋势,反刍动物饲料逐步转向安全生产及使用的方向发展。     

Chelex-100快速提取动物源饲料DNA方法的建立

为防止疯牛病疫区反刍动物源性饲料传入我国,非常有必要对贸易往来中的肉骨粉品种来源进行鉴定。本文建立了一种利用Chelex—100快速提取动物源性饲料DNA的方法,用于反刍动物源性饲料的PCR扩增分析。结果显示该方法与GuSCN法、SDS法同样理想,从而实现了对进境饲料的快速检定的要求。该方法检测灵敏度达到牛成分含量为0．1％的水平,具有简单、快捷、灵敏度高的优点。     

利用TaqMan微流控阵列同步检测多种动物源性成分

利用TaqMan微流控阵列(TaqMan~? array microfluidic card)技术,将24种(类)动物物种的实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)的引物探针集合在同一个阵列上,以实现多物种高通量同步检测,并对该方法的重复性、特异性和灵敏度进行验证。用变异系数(coefficient of variation, CV)表示一块阵列板内,同一物种成分检测的重复性。结果显示:66个CV值中,11个低于1%,15个大于2%,其余40个介于1%～2%之间,没有一个物种成分的CV值高于3%。P值显示的是不同阵列板间同一成分检测的重复性,22个物种成分的P值只有1个小于0.05,显示为板间存在差异,其他21种成分的板间差异均未达到显著水平。因此,本研究对多数物种成分的检测,不论板内还是板间都有较好的重复性。特异性检测中未发现TaqMan微流控阵列中出现假阳性的结果,但有2种成分的检测出现了假阴性。TaqMan微流控阵列的检测灵敏度没有高于单重荧光定量PCR,在22个检测样品中,10个物种成分检测的灵敏度降为原来的10%,1个甚至降低为原来的1%,其余11个灵敏度和单重荧光保持一致。总体而言,TaqMan微流控阵列技术在重复性、特异性和灵敏度方面都能满足物种成分真伪鉴定的需求,为同步鉴定多种动物源性成分提供了一种新的方法。     

反刍动物饲料产品和动物源性饲料产品中牛羊源成分检测

利用聚合酶链式反应法(PCR法)对反刍动物饲料产品(预混料、精料补充料、全价配合料等)和动物源性饲料产品(鱼粉、肉粉等)共计350个样品进行了牛羊源成分检测.结果表明,有3个样品检出牛和/或羊源性成分,牛羊源性成分检出率0.86%.其中,反刍动物饲料产品310批次,牛羊源性成分检出率为0.97%;动物源性饲料产品40批次,均未检出牛羊源性成分.