羊乳腺上皮细胞的形态观察

用组织块培养法获得山羊乳腺细胞原代培养物,并根据山羊乳腺成纤维细胞与上皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同将二者分离纯化。对细胞形态进行光镜观察发现：纯化的山羊乳腺上皮细胞传代至第15代时其生长仍正常。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,呈蜂窝状;部分细胞呈圆饼状,体积较大;部分细胞呈长形。纯化的乳腺上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状,称之为乳球体。     

荔枝ISSR扩增条件优化

对ISSR—PCR扩增荔枝基因组DNA的主要影响因子进行了筛选和分析。试验结果表明：20μl的反应体系中采用20ng的模板DNA,0．15μmol／L ISSR引物、1．25U Taq DNA聚合酶,0．15μmol／LdNTP,以及50～54℃的复性温度为荔枝1SSR。PCR扩增条件的最佳选择。     

石斛属植物ISSR扩增体系的建立与优化

旨在建立并优化石斛属植物的ISSR-PCR反应体系。通过对ISSR-PCR反应体系中主要影响因子模板DNA、dNTP、10×PCR Buffer、引物以及Taq DNA聚合酶分别进行单因素优化,最终建立一套适用于石斛属植物的扩增多态性高、稳定性强、带型清晰的ISSR最佳反应体系。20μL反应体系的适宜浓度及用量分别为：模板DNA 10 ng/μL 3μL,dNTP 2.5 mmol/L 1.5μL,10×PCR Buffer 3.0μL,引物4μmol/L 3.5μL,TaqDNA聚合酶5 U 0.2μL。这一优化体系适用于石斛ISSR分析,为今后遗传多样性与亲缘关系分析、连锁图谱构建、QTL定位、基因定位与克隆等方面的研究提供了技术支撑。     

山羊乳腺上皮细胞的光镜观察

采用电穿孔转化法,将EGFP(增强型绿色荧光蛋白)基因转化体外培养的山羊乳腺上皮细胞。细胞穿孔转化7d后在荧光显微镜下观察。结果显示,EGFP基因成功地转入体外培养的山羊乳腺上皮细胞,EGFP基因获得表达,6种电穿孔参数的转化效果基本相同。     

枇杷ISSR扩增反应体系的优化

采用正交设计对影响枇杷ISSR-PCR的模板DNA、dNTPs、Primer、Taq酶及Buffer(含Mg2+)进行优化。试验结果表明:20μL反应体系中,含模板DNA5ng、dNTPs0.25mmol/L、Primer0.25μmol/L、Taq酶0.5U和10×Buffer(含Mg2+)3μL。此外,从95条ISSR引物中筛选出11条具有丰富的多态性位点的引物,同时优化各引物退火温度。     

奶牛乳腺上皮细胞体外培养条件优化的初步研究

从培养基、细胞接种浓度、冻存液三方面对奶牛乳腺上皮细胞体外培养条件进行了优化。采用台盼兰染色计数方法绘制细胞生长曲线,评定细胞体外生长增殖。结果表明,使用DMEM/F12培养基细胞生长状况最好,DMEM培养的细胞较DMEM/F12生长缓慢,F12其次,RPMI1640培养细胞生长最慢;以1×104的接种浓度于24孔板,细胞生长状态最好,细胞的生长周期经历了潜伏期、对数生长期、稳定期、衰亡期4个生长阶段,生长曲线符合"S"型生长规律;采用胎牛血清(90%FBS+10%DMSO)和培养基(70%培养基+20%FBS+10%DMSO)两种冻存液冻存奶牛乳腺上皮细胞,细胞复苏培养后,胎牛血清冻存的细胞生长状态和增殖速度都明显优于培养基冻存的奶牛乳腺上皮细胞,从培养的第3天开始,2组细胞数量差异显著(P0.05)。本研究结果为建立体外培养体系提供了一定参考。     

濒危植物德保苏铁种子休眠与萌发

利用生物鉴定法、胚的检测、GA3溶液浸种等方法,对德保苏铁种子进行处理,以探讨其休眠和萌发特性及解除休眠的措施。结果表明:种皮透水性差,种子各部位均含萌发抑制物对种子萌发具有一定影响,而胚的未完全发育,则是引起种子休眠的主要原因。GA3有利于打破德保苏铁种子的休眠,在常温下,用1 000 mg/L的GA3溶液浸种24 h,解除休眠效果较好,萌发时间可提前15 d,萌发率达83.33%。     

苦瓜基因组DNA的提取及ISSR扩增体系的优化

为了快速获取高质量的苦瓜基因组DNA,以便进行苦瓜白粉病抗性基因分子标记研究,比较了不同的DNA提取方法、不同部位的苦瓜叶片提取基因组DNA的产量和质量,探究了苦瓜基因组DNA提取的最佳方法和叶片的最适部位;研究了ISSR-PCR的退火温度,并采用正交设计法对影响ISSR-PCR的Mg²⁺、dNTPs、Taq酶、模板DNA以及引物浓度等5个因素进行了优化。结果表明,采用改良CTAB法从苦瓜顶端嫩叶中提取的基因组DNA OD260/OD280值在1.8~1.9之间,OD260/OD230值为2.0左右,对DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测,主带清晰,降解较少,产量和纯度均较高,效果较好。优化后的ISSR-PCR反应体系为：2.5μL 10×PCR buffer,2.5 mmol/L MgCl₂,250μmol/L dNTPs,10 ng模板DNA,0.75 U Taq酶,引物浓度0.7μmol/L,反应总体积为25μL,引物UBC826最佳退火温度为53℃。该体系在多次重复中均能获得良好的扩增结果。苦瓜基因组DNA提取的最佳方法为改良CTAB法,最适合的部位为顶端嫩叶。     

枣ISSR扩增体系的建立

以冬枣DNA为研究对象,利用单因素试验,分析了Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶含量、引物浓度、模板DNA含量以及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响,经优化建立了枣属植物最适ISSR-PCR反应体系,25μL反应液中包含1×PCR Buffer、2.0 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTP、1.5 UTaq酶、1.25μmol/L引物和50 ng模板,最适退火温度为58℃。PCR反应体系的建立为应用ISSR标记技术开展枣种群遗传变异分析和构建遗传图谱奠定基础。     

百合属ISSR反应条件优化的研究

建立一个稳定性高、重现性好,适合百合ISSR遗传差异分析的PCR反应体系。设定反应体系中各因子的不同浓度并进行PCR扩增,依据稳定性高、重现性好的原则,对该反应体系进行调整与优化,最终建立稳定可靠的ISSR反应体系。适于百合ISSR-PCR反应的最佳体系(25μL)为：40 ng模板DNA,2.0 mmol/L Mg²⁺,1.5 U TaqDNA聚合酶,0.8μmol/L引物,200μmol/L dNTPs;扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性1 min,51.8℃退火1 min,72℃延伸2 min,共35个循环;最后72℃延伸8 min。所建立的百合ISSR反应体系具有稳定性高、重现性好、检测多态性能力强等特点,为应用ISSR标记技术进行百合属植物遗传多样性分析和品种分子鉴别等研究奠定了技术基础。     

文冠果ISSR反应体系的建立及优化

为了建立文冠果ISSR-PCR最佳反应体系,从而为文冠果遗传多样性研究提供理论依据,从定西巉口林场文冠果人工林内选取健康嫩叶为试验材料,通过单因子试验研究了影响ISSR-PCR反应各因素的浓度,分析因子包括模板DNA用量、退火温度、dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度及TaqDNA聚合酶用量等。通过研究,找出了各因子合适的条件,建立并优化了文冠果ISSR反应体系,即20μL总反应体系含模板DNA约30 ng,Mg²⁺2.5 mmol/L,引物0.2μmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,Taq聚合酶1 U。试验结果表明,在此反应体系下可得到多样性好、条带清晰的图谱。     

正交设计优化扁蓿豆ISSR反应体系的研究(英文)

以扁蓿豆(Medicago ruthenica)为试材,采用改良的CTAB法提取DNA,利用正交设计L16(45)探讨10×PCRBuffer(含Mg2+)、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶及模板DNA用量对扁蓿豆ISSR-PCR反应的影响,正交试验的结果采用直观分析和方差分析相结合。建立了扁蓿豆的ISSR-PCR优化反应体系,在25μL反应体系中,TaqDNA聚合酶1.5U,10×PCR Buffer(含Mg2+)2.0 mmol/L,模板DNA0.5 ng/μL,dNTPs 0.6 mmol/L,引物0.9μmol/L。同时探讨引物HZD09211的最适退火温度为52.3℃。2个不同引物对20份扁蓿豆材料DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示该体系具有较高的稳定性。     

不结球白菜SRAP反应体系的建立与优化

以菜薹基因组DNA为模板,通过正交试验设计,从Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物及模板5种因素4个水平对不结球白菜SRAP反应体系进行优化,建立了适合不结球白菜的SRAP-PCR优化反应体系.利用该优化体系,选用30对芸薹属SRAP引物,对5份不结球白菜的基因组进行扩增,筛选出7对具有2条以上特异扩增条带的SRAP引物,验证了该优化体系的稳定性.     

砂珍棘豆ISSR-PCR反应条件优化研究

以砂珍棘豆(Oxytropis racemosa Turcz.)DNA为材料,应用分子标记技术,分析了DNA模板浓度、Mg2 浓度、引物浓度和dNTP浓度对ISSR-PCR扩增结果的影响,经优化试验建立了砂珍棘豆ISSR-PCR反应体系.20 μL PCR反应液含有的组分和终浓度分别为:20 ng DNA模板,1 U Taq酶,0.24 μmol/L引物,2.0 mmol/L MgCl2,0.15 mmol/L dNTPs.     

橡胶草及其近缘种ISSR反应体系及扩增程序的优化

本研究旨在建立和优化橡胶草及其近缘种ISSR (Inter-simple sequence repeat)反应体系和扩增程序。以橡胶草及其近缘种叶片为供试材料,采用单因素试验方法,正交试验方法 L16(44)和极差分析方法,对橡胶草ISSR-PCR反应中4个主要影响因素(dNTP浓度, DNA浓度,引物浓度和Taq DNA聚合酶浓度)进行优化,并在最优反应体系的基础上进行引物和退火温度的筛选。结果表明:dNTP和DNA对PCR扩增结果有较为显著的影响,引物和Taq酶的浓度变化对扩增结果无显著影响。最后确定橡胶草及其近缘种ISSR-PCR反应体系(20.0μL)为:双蒸水14.2μL,10×Buffer (含Mg2+) 2.0μL,DNA模板50.0 ng,10 mmol/L引物1.2μL,2.5 mmol/L dNTP 1.6μL,5 U Taq DNA聚合酶0.1μL。PCR扩增程序为:94℃5 min,94℃45 s,退火1 min,72℃70 s,45个循环,72℃10 min,4℃保存。本研究为橡胶草及其近缘种的遗传多样性和交配系统等后续研究提供理论参考。     

克氏原螯虾ISSR体系优化

为了获得最佳的克氏原螯虾ISSR-PCR 反应体系,采用单因素实验法将反应体系的Taq 聚合酶、 dNTPs和Mg2+ 3 个主要因素设定5 个梯度,根据每个因素量的变化对扩增结果产生的影响进行了研究,最后确定最佳反应体系为：总体积10 μL,1 μL 10×Taq Buffer、dNTPs 浓度0.6 mmol/L、0.6 U Taq DNA polymerase、MgCl2浓度1.8 mmol/L、20 ng DNA,引物浓度0.8 μmol/L。     

食用向日葵SSR-PCR反应体系的优化

为建立食用向日葵分子标记反应体系,以食用向日葵四叶期叶片为DNA模板提取材料,采用单因素试验和正交试验设计,对SSR-PCR反应体系中的6因素(10×PCR Buffer、Mg2+、d NTPs、引物、Taq DNA聚合酶和DNA模板)在5水平上进行正交优化试验,并比较了不同浓度Mg2+、Taq DNA聚合酶、模板DNA对扩增效果的影响,结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响为Mg2+Taq DNA聚合酶(引物)DNA模板10×PCR Bufferd NTPs。最终建立食用向日葵SSR-PCR最佳反应体系为:在总体系为20μL的SSR-PCR反应体系中包括10×PCR Buffer 0.2mmol/L、Mg2+2.0 mmol/L、d NTPs 1.8 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.2 U、DNA 50 ng、引物1.5 mmol/L。     

大豆SSR技术反应体系的优化

以大豆为材料,研究了PCR反应体系的主要成分模板DNA浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq酶浓度及退火温度对大豆SSR扩增结果的影响,探索影响SSR扩增结果的各因素的最佳用量及引物的退火温度。结果表明:在试验设计范围内,DNA浓度和dNTP浓度对扩增影响较大,引物浓度在0.05~0.2μmol/L范围内对扩增影响较小,Taq酶浓度对扩增有一定影响,引物要有其扩增适宜的退火温度。确立了适合大豆SSR分子标记研究的优化体系。最终确定总反应体系为20μL,模板DNA 20 ng,dNTP 200μmol/L,引物0.15μmol/L,Taq酶0.5 U,10×Taq Buffer 1.5 mmol/L,ddH2O补至20μL。     

椰子ISSR体系优化

本实验旨在获得最佳的椰子ISSR－PCR反应体系,以海南本地高种和马来西亚高种为实验材料,采用单因素实验法将反应体系的五个主要因素设定五个梯度,根据每个因素量的变化对扩增结果产生的影响进行了研究;并利用梯度PCR仪得出引物807的最适退火温度为56.0℃;最后确定最佳反应体系为：总体积20μL,Taq聚合酶1.0U、Mg2＋浓度即10×Taq Buffer用量2.5mmol/L、模板DNA用量50ng、dNTPs浓度0.2mmol/L、引物浓度0.8μmol/L。