1株鸡传染性贫血病毒野毒株对不同日龄SPF鸡的致病性

从山东省某商品代肉鸡场表现生长迟缓的20日龄病鸡群分离到1株鸡传染性贫血病毒(CAV)SDLY08株,通过口服和肌肉注射2种途径分别感染1,7,21日龄SPF鸡,12d后检测CAV对SPF鸡体质量、免疫器官和血液指标的影响。结果表明,于3个不同日龄感染后12d,SDLY08株均可导致增重减缓,胸腺显著萎缩,脾脏肿大,同时还可引起白细胞、红细胞数及红细胞压积的显著减少。且1日龄和7日龄鸡易感性大于21日龄鸡,肌肉注射比口服感染组的致病性更强。     

鸡胚中沉积的尿酸盐对血凝试验的影响

在新城疫La Sota半成品检验过程中,发现接种后培养120 h的活胚,经过-20℃低温速冻1 h,有的鸡胚尿囊液中有尿酸盐产生,且出现的几率比较大,而经过2~8℃低温冷冻24 h的鸡胚,产生白色尿酸盐的几率相对小一些。凡是有尿酸盐产生的鸡胚,均没有血凝现象产生。但用含有尿酸盐的尿囊液接种鸡胚,继续增殖,会有病毒大量复制,试验说明有新城疫病毒存在的尿囊液中,若有尿酸盐沉淀,则血凝现象会被遮盖。     

鸡胚及禽类细胞系在生物医药领域的应用及研究进展

鸡胚因发育过程清楚,长久以来作为基础和应用科学研究领域重要的实验模型,尤其在鸡胚发育早期绒毛尿囊膜阶段,因其血管丰富,是天然的免疫缺陷宿主,是病理学、药理学和肿瘤学等研究领域的理想实验模型。作者简述了发育早期的鸡胚组织结构,并介绍了鸡胚绒毛尿囊膜在肿瘤研究、血管生成、器官移植、烧伤等疾病机理研究中的应用,以及在鸡胚病理模型基础上进行的抗肿瘤药物筛选的应用。重点介绍了鸡胚及禽类细胞系在病毒繁殖和疫苗生产、治疗性蛋白和单抗生产方面的应用研究进展。多种人源病毒、禽源病毒、支原体等可在鸡胚及禽类细胞上增殖,并用于疫苗生产。作者对常用的禽类纤维原细胞和多能干细胞的发展和特点进行了阐述,并总结了商业化的禽类细胞系来源以及部分易感病毒。鸡胚表达系统能够在目的蛋白特定位点产生人源化糖基,减少目的蛋白对人的过敏反应,且禽蛋廉价易得,可作为生产人用单克隆抗体和治疗性蛋白的合适供体。作者介绍了鸡胚及禽类细胞系在生物医药领域应用的最新进展,并对鸡胚作为动物模型在未来的应用进行了展望。     

MTT法测定自制多糖注射剂对鸡胚成纤维细胞和鸡脾淋巴细胞增殖的最适浓度

为探讨自制多糖注射剂（板蓝根、黄芪、淫羊藿的混合多糖注射剂）促进鸡胚成纤维细胞和鸡脾淋巴细胞增殖的最适浓度,用MTT法分别检测加入不同浓度的混提多糖注射剂的鸡胚成纤维细胞和鸡脾淋巴细胞的OD值。结果表明,自制多糖注射剂促进鸡胚成纤维细胞和鸡脾淋巴细胞增殖的最适浓度分别是25μg／ml、50μg／ml。     

CAV与REV共感染SPF鸡对疫苗免疫反应的抑制作用

用1日龄SPF鸡人工感染鸡贫血病毒(CAV)和禽网状内皮增生病病毒(REV),探讨病毒感染对鸡体疫苗免疫反应的影响。结果表明,在用禽流感病毒(AIV,H5和H9)疫苗免疫后,CAV与REV单独感染均显著抑制了鸡体对H5和H9亚型禽流感病毒灭活疫苗的HI抗体反应,在CAV与REV共感染后,这种抑制作用更为明显。CAV单独感染后鸡体对新城疫病毒(NDV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)疫苗的免疫反应受到抑制,但与对照组在统计学上的差异不显著,然而,CAV可以显著加重REV感染对鸡体在NDV和IBDV疫苗免疫后抗体反应的抑制作用。从而证实CAV与REV共感染在疫苗免疫抑制上有协同作用。     

重组鸡白细胞介素18(rChIL-18)对MDV感染SPF鸡细胞免疫的影响

用马立克氏病病毒（MDV）感染5日龄SPF鸡后,取21日龄和35日龄鸡的淋巴细胞,运用3H-TdR掺入法检测T淋巴细胞对ConA和重组鸡白细胞介素18（rChIL-18）的反应,并用MTT法检测NK细胞和CTL对MD肿瘤细胞系CU147的杀伤活性及rChIL-18和IFN-γ对它们的作用。结果显示,SPF鸡感染MDV后淋转水平显著下降,NK细胞、CTL杀伤活性在感染后21日龄时升高,而在35日龄时NK细胞杀伤活性显著下降。rChIL-18对对照组和感染组SPF鸡的淋转水平和杀伤活性均有提高作用,同样IFN-γ也具有提高NK细胞和CTL杀伤活性的作用。     

多氯联苯对鸡胚性腺发育的毒性和雌性激素作用

研究了内分泌干扰物多氯联苯 (PCB)对鸡胚性分化开始后性腺发育和配子分化的影响。在孵化的第 10天向气室内注入 Aroclor12 5 4或雌激素 ,第 19天取出睾丸和卵巢 ,进行形态学观察。结果显示 ,PCB明显促进卵巢皮质的发育 (P<0 .0 5 ) ,效果类似 17β-雌二醇 (E2 ) ;对睾丸发育也呈现微弱的雌激素样作用 ,生精细胞分化受到抑制 ,细精管管壁显著变薄 (P<0 .0 1) ,而 E2 作用于睾丸会导致睾丸萎缩 ,甚至雌性化 ,睾丸横截面积比对照组显著减少 ,细精管管壁也变薄 (P<0 .0 5 )。PCB的上述雌激素样作用能被克罗米酚 (clom iphen)阻断。此外 ,与 E2 相比 ,PCB对雌性和雄性生殖细胞表现出强烈的毒性作用 ,使大多数生殖细胞发生核固缩和胞质空泡化 ,细胞间隙增大 ,雄性的细精管结构也受到破坏。以上结果表明 ,PCB对鸡胚性腺呈现出毒性和雌性激素的双重作用     

中草药抑制H_5亚型禽流感病毒对鸡胚毒性的研究

根据中医利用解表、清瘟、凉血止血的中草药防治人类流感的原理,选取金银花、北板蓝根、贯叶连翘、双黄连、贯众等五种中草药所制成的制剂进行H5亚型禽流感病毒感染鸡胚后毒力作用的抑制实验。首先对鸡胚接种禽流感H5亚型病毒,然后对感染鸡胚分别注射上述几种中药制剂,再抽取胚液进行HA和HI实验,将其中对鸡源H5-AIV有抑制作用的中草药挑选出来,测定中草药对禽流感病毒的治疗指数(Therapeutic index,TI)。然后采用寇氏法计算药物半数有效量ED50。结果表明,金银花、北板蓝根、贯叶连翘、双黄连、贯众五种中草药制剂在对H5亚型禽流感病毒的鸡胚毒性方面均有较好的抑制作用。     

人参皂苷及其衍生物对鸡胚成纤维细胞最大安全浓度的测定

采用组织细胞培养方法,测试了人参皂苷及其衍生物在鸡胚成纤维细胞(CEF)体外培养中的最大安全浓度。结果显示:药物在高浓度时,对CEF细胞表现出毒性,在中、低浓度时对CEF细胞具有促增殖作用。人参皂苷及其衍生物对CEF细胞的最大安全浓度为分别为375μg/mL和187.5μg/mL。     

绿原酸对FAdV-4的抑制作用及其对鸡胚肝脏炎性因子和信号分子表达的影响

试验旨在研究绿原酸对禽腺病毒4型(FAdV-4)的抑制作用及其对鸡胚肝脏炎性因子和信号分子表达的影响。将9日龄SPF鸡胚随机分为7组:对照组、5个不同浓度的绿原酸组和FAdV-4感染组。绿原酸组经尿囊腔注射不同浓度的绿原酸,48 h后与FAdV-4感染组均经尿囊腔接种0.2 mL ELD₅₀为1.36×10⁷拷贝的FAdV-4病毒,对照组注射等体积的生理盐水。用MTT法检测绿原酸的安全浓度(IC₅₀),计算每枚鸡胚接种绿原酸的含量;接种病毒后72 h后,剖检并无菌收集鸡胚肝脏进行病理观察,实时荧光定量PCR法检测病毒载量,ELISA法测定肝脏细胞因子白介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及信号分子磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、核转录因子-κB(NF-κB)和NF-κBp65含量。MTT法测定结果表明,绿原酸对鸡胚成纤维细胞的IC₅₀为28.6 μg/mL,每枚鸡胚接种0.2 mL的绿原酸含量分别为858、429、214.5(≈215)、107.25(≈107)和53.125(≈53) μg。FAdV-4病毒接种72 h后,FAdV-4感染组鸡胚肝脏边缘钝圆、肿大,变脆,呈土黄色或黄色,甚至出现坏死;随着绿原酸浓度增加,绿原酸组鸡胚肝脏肿胀渐不明显,坏死灶和出血瘀点减少;肝脏内病毒明显增殖,载量为7.8 log₂拷贝/mg,107 μg绿原酸即可显著抑制FAdV-4在鸡胚肝脏中的增殖(P<0.05)。炎性细胞因子检测结果表明,与对照组相比,FAdV-4可极显著增加鸡胚肝脏中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量(P<0.01);53 μg绿原酸组IL-1β和TNF-α含量极显著增加(P<0.01),107 μg绿原酸组IL-6和TNF-α的含量均显著增加(P<0.05)。与FAdV-4感染组相比,107 μg绿原酸组IL-1β和TNF-α的含量均极显著降低(P<0.01),215和429 μg绿原酸组IL-6的含量显著降低(P<0.05),858 μg绿原酸组IL-6的含量极显著降低(P<0.01)。细胞信号分子检测结果表明,与对照组相比,FAdV-4可极显著增加PI3K、NF-κB和NF-κBp65的含量(P<0.01);53 μg绿原酸组PI3K、NF-κB和NF-κBp65的含量均显著增加(P<0.05)。与FAdV-4感染组相比,53 μg绿原酸PI3K和NF-κBp65的含量均显著降低(P<0.05);215 μg绿原酸组NF-κB的含量显著降低(P<0.05),NF-κBp65的含量极显著降低(P<0.01);当绿原酸达429 μg时,PI3K、NF-κB和NF-κBp65的含量均极显著降低(P<0.01)。本试验结果表明,绿原酸能够抑制FAdV-4的增殖,且剂量依赖性地抑制炎性因子和信号分子的表达,说明绿原酸可用于鸡抗病毒和炎性相关疾病的防控。     

金英汤及其活性成分体外对鸡胚成纤维细胞最大安全浓度的测定

为了评价中药方剂"金英汤"及其主要活性成分绿原酸、连翘苷和黄芪多糖的细胞毒性,利用鸡胚成纤维细胞来检测药物的细胞最大安全浓度。中药方剂"金英汤"的细胞最大耐受量为0.488 mg/mL(生药浓度),而其主要活性成分绿原酸、连翘苷和黄芪多糖的细胞最大耐受量分别为0.031,0.244和0.488 mg/mL。     

福建白羽肉鸡鸡毒支原体的分离鉴定及最小抑菌浓度测定

为了解福建白羽肉鸡中鸡毒支原体（MG）对临床常用药物的敏感性,本研究从2个商品代白羽肉鸡养殖场采集了疑似患慢性呼吸道病（CRD）的鸡喉拭子40份,接种于适宜的支原体培养基上进行纯化。通过对菌株生物学特性分析、细菌形态学观察、PCR测序及动物回归试验进行鉴定,并利用最低抑菌浓度（MIC）测定了分离株对临床常用抗菌药的敏感性。结果显示,本试验成功获得2株MG,命名为MX和HY。将分离株接种于含有酚红的支原体液体培养基中能分解葡萄糖产酸使培养基颜色由红变黄;固体培养基于低倍镜下观察到典型的"荷包蛋"状菌落;分离株经过Dienes染色后的菌落中心呈致密深蓝色,边缘淡蓝,且30 min后不褪色,并具有较强吸附红细胞的能力,呈现典型MG培养特征;动物回归试验和分离株pvpA基因测序结果显示,2株MG分离株均具有较强致病性,证实其与R株的亲缘关系最近;药敏试验结果显示,MX和HY对泰妙菌素、氟苯尼考和泰乐霉素表现出了高度敏感性,其次是盐酸恩诺沙星、盐酸大观霉素,而对具有与泰乐霉素类似分子结构和抗菌谱的畜禽专用抗生素替米考星敏感性较差,此差异可能与临床上长期应用该药有关。研究结果表明,福建地区商品代白羽肉鸡中存在致病性MG流行,泰妙菌素可以作为临床防治MG的首选药物。     

海藻硫酸多糖和中药复方对鸡胚接种H9N2亚型禽流感病毒的作用

为探讨海藻硫酸多糖（sulfated polysaccharide from algae,SPA）及中药复方提取液（compound extracts of Chinese medicine,CECM）对H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的作用,将SPA及CECM以3种不同加药方式作用于接种了H9N2亚型AIV的10日龄SPF鸡胚中,无菌收集鸡胚尿囊液,测定血凝效价,检测2种药液对H9N2亚型AIV的预防、治疗及直接灭活作用。结果显示,SPA及CECM的最大安全浓度分别为50和200 mg/mL;3种不同加药方式下,不同浓度SPA及CECM均能极显著降低鸡胚尿囊液中H9N2亚型AIV的血凝效价（P<0.01）,以直接灭活作用组的血凝效价降低幅度最大,预防作用组和治疗作用组次之。预防作用组,CECM高剂量组（200 mg/mL）的抗病毒效果显著优于SPA各剂量组（12.5、25和50 mg/mL）及CECM低、中剂量组（50和100 mg/mL）（P<0.05）;治疗作用组,SPA高剂量组（50 mg/mL）及CECM中、高剂量组（100和200 mg/mL）抗病毒效果显著优于SPA低剂量组（12.5 mg/mL）（P<0.05）;直接灭活作用组,SPA及CECM的抗病毒效果均佳,CECM各剂量组的抗病毒效果与SPA各剂量组差异极显著（P<0.01）。结果表明,SPA和CECM对10日龄鸡胚几乎无毒副作用;SPA及CECM均能显著抑制H9N2亚型AIV在鸡胚尿囊液中的增殖,以直接灭活作用组的抗病毒效果最佳,其抗H9N2亚型AIV作用的强弱与药物浓度、用药和病毒的感染时间顺序密切相关。     

硒缺乏对鸡血清组胺和5-羟色胺含量的影响

为探讨硒缺乏对鸡血清中组胺和5-羟色胺浓度变化的影响,将40只鸡随机分为低硒试验组(饲喂低硒日粮0.032 mg/kg)和正常对照组(硒含量为0.229 mg/kg).分别在30、45、60和75日龄断头处死进行取样,用ELISA法对雏鸡血清中组胺和5-羟色胺浓度进行检测和对比分析.结果表明:缺硒组血清中组织胺和5-羟色胺浓度与对照组差异极显著(P<0.01),缺硒组不同龄间差异极显著(P<0.01).在整个试验期内,缺硒组血清中硒含量和组胺浓度呈时间-效应关系;随日龄增加,缺硒组5-羟色胺浓度逐渐升高,在60日龄时达高峰而后降低,而对照组在60日龄后则趋于平稳.缺硒刺激肥大细胞脱颗粒,释放炎性介质组胺,使血清中浓度升高.但5-羟色胺属中枢神经递质,严重缺硒引起神经损伤,使其分泌受抑,含量降低.     

硒缺乏对鸡血清组胺和5-羟色含量的影响

为探讨硒缺乏对鸡血清中组胺和5-羟色胺浓度变化的影响,将40只鸡随机分为低硒试验组（饲喂低硒日粮0．032mg／kg）和正常对照组（硒含量为0．229mg／kg）。分别在30、45、60和75日龄断头处死进行取样,用ELISA法对雏鸡血清中组胺和5-羟色胺浓度进行检测和对比分析。结果表明：缺硒组血清中组织胺和5-羟色胺浓度与对照组差异极显著（P〈0．01）,缺硒组不同日龄间差异极显著（P〈0．01）。在整个试验期内,缺硒组血清中硒含量和组胺浓度呈时间-效应关系;随日龄增加,缺硒组5-羟色胺浓度逐渐升高,在60日龄时达高峰而后降低,而对照组在60日龄后则趋于平稳。缺硒刺激肥大细胞脱颗粒,释放炎性介质组胺,使血清中浓度升高。但5-羟色胺属中枢神经递质,严重缺硒引起神经损伤,使其分泌受抑,含量降低。     

束缚应激对小鼠小肠5-羟色胺表达的影响

为了探讨束缚应激对小鼠小肠5-羟色胺(5-HT)表达的影响,试验将小鼠随机分为对照组和束缚应激处理组,每日称小鼠体重,并采用免疫组织化学法对小鼠小肠内5-HT免疫阳性细胞进行检测。结果表明:处理组小鼠体重明显降低,小肠内5-HT免疫阳性细胞数显著高于对照组(P<0.05)。说明束缚应激可使小鼠小肠5-HT免疫阳性细胞表达增加。     

禽网状内皮组织增生病病毒感染对SPF雏鸡法氏囊细胞Bcl-2和C-myc基因表达及凋亡的影响

【目的】 探究禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)感染禽类后导致免疫器官发生细胞凋亡的机理。【方法】 以1日龄SPF雏鸡为试验对象,将100只SPF雏鸡随机均分为REV感染组和未感染病毒的对照组,REV感染组雏鸡经腹腔感染500 μL REV稀释液,对照组雏鸡经相同途径注射等量灭菌生理盐水,于病毒感染后第1、7、14、21、28和42天,2组雏鸡随机各抽取5只,心脏采血处死雏鸡后快速摘取法氏囊。分别应用HE染色和病理切片成像系统测定分析法氏囊细胞核浆比,TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒测定凋亡细胞数,免疫组化法测定Bcl-2和C-myc阳性细胞数量,实时荧光定量PCR和ELISA法分别检测法氏囊Bcl-2和C-myc 基因mRNA表达和蛋白含量。【结果】 ①REV感染1日龄SPF雏鸡后21~42 d,其法氏囊淋巴细胞凋亡百分比显著或极显著高于对照组雏鸡(P<0.05;P<0.01);②SPF雏鸡感染REV后21和28 d,其法氏囊细胞核浆比显著低于对照组雏鸡(P<0.05);③REV感染SPF雏鸡法氏囊中Bcl-2和C-myc阳性细胞数在病毒感染后21和28 d显著高于对照组雏鸡(P<0.05);④REV感染SPF雏鸡后21 d,其法氏囊Bcl-2和C-myc 基因mRNA表达极显著高于对照组雏鸡(P<0.01)。⑤SPF雏鸡感染REV后,其法氏囊中Bcl-2蛋白含量较对照组雏鸡有不同程度的增加,其中21和28 d分别差异极显著(P<0.01)和显著(P<0.05),病毒感染组雏鸡的C-myc蛋白含量也始终高于对照组雏鸡,且21和28 d极显著增高(P<0.01)。【结论】 REV感染所致SPF雏鸡法氏囊细胞Bcl-2和C-myc的mRNA表达以及蛋白含量异常均与病毒感染导致的法氏囊细胞凋亡密切相关,而法氏囊细胞凋亡数量增加与REV感染引发的机体免疫机能抑制密切相关。     

传染性支气管炎病毒对鸡免疫反应及重组禽β-防御素11和12抗病毒作用的研究

【目的】探究呼吸型传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）对蛋鸡免疫反应的影响及重组禽β-防御素（avian β-defensins,AvBDs）的抗病毒作用。【方法】试验将70只7日龄SPF白来航鸡随机分为2组,每组35只。攻毒组通过滴鼻点眼途径接种呼吸型IBV强毒（CK/CH/LSD/05I）,对照组以相同途径接种等剂量灭菌PBS。定时观察临床症状14 d并记录,在攻毒后12 h、36 h、3 d、7 d和14 d 2组各随机选取5只鸡心脏采血处死,检测血清抗体水平并收集部分气管和肾脏进行组织病理学检测。采集法氏囊、脾脏、肾脏和气管,提取RNA,运用实时荧光定量PCR方法检测组织中IBV的病毒载量、Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）及信号转导分子、AvBDs基因表达量变化。将重组AvBD11和AvBD12转染鸡胚肾细胞（chicken embryo kidney,CEK）并在病毒感染细胞后6、12、24、36和48 h收取细胞上清和细胞用于提取RNA,通过实时荧光定量PCR方法检测病毒载量。【结果】感染呼吸型IBV强毒后,鸡出现轻微呼吸道症状,剖检无明显病理变化。在感染14 d后,鸡血清抗体水平转阳且阳性率为100%。实时荧光定量PCR结果显示,对照组均未检测到病毒,攻毒组仅在感染14 d后的气管中检测到病毒且病毒载量低。与对照组相比,攻毒组脾脏中TLR1、TLR5、AvBD9和AvBD12基因表达量在感染后7 d均显著升高（P<0.05）,攻毒组法氏囊中TLR1、TLR2、TLR3、AvBD5和AvBD9基因表达量及气管中核转录因子-κB p65（NF-κB p65）、NF-κB c-Rel、AvBD5、AvBD9、AvBD11和AvBD13基因表达量在感染14 d后均显著升高（P<0.05）。体外抗病毒结果显示,与转染空载体组相比,转染AvBD11的CEK细胞在感染24和48 h后病毒载量显著下调（P<0.05）,细胞上清的病毒载量在感染48 h后显著下调（P<0.05）;转染AvBD12的CEK细胞在感染12和24 h后病毒载量显著下调（P<0.05）,细胞上清的病毒载量在感染12和48 h后显著下调（P<0.05）,说明重组AvBD11和AvBD12在CEK细胞中具有抗IBV活性。【结论】呼吸型IBV强毒感染机体后增强了相关受体的基因表达和信号转导,上调了AvBDs基因表达,加强了机体免疫反应。重组AvBD11和AvBD12具有抗病毒作用,为无抗饲料的配制及研究提供了新思路。     

氟西汀和5-羟色胺对肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

为探讨5-羟色胺转载体(5-HTT)在肉鸡肺动脉高压综合征发病中的机制,采用MTT比色法、流式细胞术及Hoechst33258荧光染色法研究5-羟色胺(5-HT)和5-HTT抑制剂氟西汀对体外培养的肉鸡肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖与凋亡的影响,发现氟西汀能够抑制5-HT促PASMC增殖的作用;氟西汀能明显促进PASMC的凋亡,但氟西汀和5-HT共同作用于细胞,PASMC凋亡率明显少于氟西汀单独处理组。表明5-HTT在调节肉鸡PASMC的增殖和凋亡方面起重要作用,有可能参与肺动脉高压肉鸡肺血管重构的形成。