pGEX-4T-1-cMC4R原核表达载体的构建与表达

[目的]构建犬MC4R基因编码区的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。[方法]以Beagle犬基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的片段,利用LP Recco PCR克隆技术将目的片段直接重组到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化到E.coliDH5α,筛选阳性克隆,BamHI、XhoI酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R转化到E.co-liBL21内,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE检测犬MC4R蛋白的表达。[结果]成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R,经DNA测序证实插入序列与设计基本一致,只有777位碱基T变成了C,这是由于犬MC4R编码区存在的多态性引起,对表达的犬MC4R蛋白序列无影响。大肠杆菌诱导后表达出犬MC4R融合性蛋白。[结论]成功构建犬MC4R原核表达载体,此重组体能在E.coliBL21内表达犬MC4R融合蛋白,为进一步获取犬MC4R的单克隆抗体奠定物质基础,也为研究犬MC4R蛋白的结构和生理功能提供帮助。     

鸡IFN-γ表达载体的构建

[目的]构建鸡IFN-γ的表达载体。[方法]采用PCR方法从pcDNA-ChIFN-γ重组质粒中扩增得到鸡IFN-γ基因,将目的基因定向克隆至能够在大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达的pQE trisystem载体内,转化大肠杆菌M15菌株,以IPTG诱导表达8×H is-tag标签蛋白并对其进行纯化。[结果]通过SDS-PAGE检测方法表明,ChIFN-γ基因片段成功表达。[结论]鸡IFN-γ的表达载体成功构建。     

鸡γ-干扰素基因的克隆与原核表达

应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,通过一对自行设计的引物,从经ConA诱导活化的鸡脾淋巴细胞的RNA中扩增出一特异性基因片段,其大小约为500 bp.该片段经酶切和测序鉴定为鸡IFN-γ基因.将其插入原核表达载体pGEX-4T-1, 并导入大肠杆菌BL21细胞中,经IPTG诱导培养,获得分子量约为43 000的蛋白带,表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到表达.     

鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的表达

构建鸡γ-干扰素基因(lFN-γ)的融合表达质粒,并在原核系统表达。根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,使用prim er5设计一对特异性引物,通过RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆出鸡γ-干扰素基因并对其进行测序。测序结果表明,鸡γ-干扰素基因全长495bp,具有一个完整的开放阅读框,编码164个氨基酸,与国外发表的序列同源性为100%。将序列连接到原核表达载体pET28 a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明鸡γ-干扰素表达蛋白大小为20.8KD,并以包涵体形式表达。为鸡γ-干扰素生物制剂或疫苗佐剂的开发奠定基础。     

Smad家族成员2/3/4原核表达载体构建和融合蛋白纯化

目的 构建针对Smad家族相关系列原核表达载体,观察其相应蛋白诱导表达纯化情况.方法 PCR扩增Smad2/3/4全长及截短片段,定向插入pGEX-6P-1载体中,构建原核表达重组质粒pGEX-6P-1-Smad2/3/4.经酶切和测序正确后,重组质粒转化表达菌株BL21(DE3),异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达;上清经GST-Sepharose4B亲和纯化,SDS-PAGE考-马斯亮蓝染色鉴定.结果 原核表达载体pGEX-6P-1-Smad2/3/4构建成功,SDS-PAGE证实Smad3A和Smad4存在包涵体,而上清中GST-Smad3(B-D)和GST-Smad2可被纯化.结论 构建的融合蛋白原核表达载体通过诱导和纯化后得到GST-Smad3截断融合蛋白(B-D)和GST-Smad2.     

大肠杆菌外膜蛋白A在原核表达载体中的克隆表达

对大肠杆菌的外膜蛋白A基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达,为大肠杆菌重组疫苗的构建奠定基础.以大肠杆菌分离株308-2菌株基因组DNA为模板,用PCR法对基因ompA进行扩增,产物与T载体连接,经测序鉴定正确后与表达载体pET32a(+)连接构建表达ompA的重组质粒,将此重组质粒转化入表达宿主E coli Ros...     

大肠杆菌原核表达载体pSBET-His的构建

为了构建原核表达载体pSBET-His。pSBETa质粒经XbaI和BamH I限制性内切酶双酶切,获得原核表达载体的骨架。以pET28a(+)为模板,通过高保真PCR法应用T7 promoter引物和T7 terminator引物对pET28a(+)载体T7表达区域进行扩增,PCR产物电泳纯化后经双酶切和纯化获得138 bp含His-Tag序列的片段。将pSBET原核表达载体骨架和含有His-Tag序列的片段进行连接后转入DH5α感受态细胞中,经菌落PCR及酶切筛选构建pSBET-His。成功构建了pSBET-His原核表达载体。应用该载体表达的蛋白质,可采用镍离子亲和层析法进行纯化。该研究为应用pSBET-His载体进行烟草丛顶病毒ORF4的原核表达研究奠定了基础。     

MCL-1原核表达载体构建及重组蛋白表达

[目的]构建日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。[方法]通过PCR方法扩增日本蟾蜍皮肤mcl-1开放阅读框,将其插入到原核表达载体pET-28b中。经菌落PCR、DNA限制性内切酶消化筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功。将pET-28b-mcl-1转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE对重组蛋白的表达进行检测。[结果]原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功;重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。[结论]原核表达载体的构建及重组蛋白的表达,为后续MCL-1的纯化、抗血清的制备及生理功能检测奠定了基础。     

苹果AFL1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

AFL1基因是苹果控制花发育的关键基因之一。在已得到AFL1 cDNA基因的基础上,将AFL1克隆到原核表达载体pET28b中,获得了重组表达质粒pET-AFL1,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21中,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳分析,结果显示,AFL1基因在大肠杆菌中成功表达,表达的AFL1融合蛋白分子量大约为53 kD。     

萧山鸡γ-干扰素(IFN-γ)成熟蛋白基因的克隆、原核表达及真核表达载体的构建

以有丝分裂原ConA诱导鸡脾脏淋巴细胞,用Trizol试剂提取细胞总RNA,利用RT-PCR技术获得了萧山鸡γ-干扰素成熟蛋白基因495 bp的序列,GenBank登录号为DQ470471。序列分析表明,与已经发表的鸡γ-干扰素成熟蛋白基因序列的核苷酸同源性为95%-99.9%。将该cDNA序列构建得到鸡γ-干扰素的原核表达载体pET30a-ChIFN-γ,成功在大肠杆菌中表达了分子量20.88 kD的目的蛋白,与预期分子量一致;并构建得到了鸡γ-干扰素的pCI真核表达载体（pCI-ChIFN-γ）。     

鸡γ干扰素基因的分子克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank已发表的鸡γ干扰素cDNA基因序列设计一对引物,以血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法克隆出鸡γ干扰素基因,把它与融合表达载体pET32a相重组。通过对阳性宿主菌的不同时间的诱导摸索出最佳表达时间。     

玉米组氨酸三聚体核苷结合蛋白基因ZmHINT1的克隆及其原核表达载体构建

通过RT - PCR方法和基因克隆技术对玉米黄早4HINT 1基因进行了分子克隆和序列分析.结果表明,黄早4 HINT 1 cDNA全长为729 bp,氨基酸序列与动物HINT 1有较高的相似度,并且包含HITN1蛋白家族保守的活性位点区域.同时,为进一步研究玉米HINT1基因的理化性质及生物功能,利用PET - 28...     

牦牛铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建及其表达研究

【目的】为解决医用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)来源的限制,利用基因工程方法构建牦牛Cu,Zn-SOD原核表达系统,为重组牦牛Cu,Zn-SOD作为注射用药奠定基础。【方法】RT-PCR扩增牦牛Cu,Zn-SOD编码基因,构建Cu,Zn-SOD/pET22b(+)重组表达载体,并转化到E.coli BL21(DE3)宿主菌,经IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE、活性染色及邻苯三酚法进行检测,采用BradFord方法测定融合蛋白浓度。【结果】本试验成功获得了牦牛Cu,Zn-SOD cDNA,长456bp,编码152个氨基酸。与普通牛SOD编码基因序列cDNA一致率为99.6%,氨基酸序列一致率为98.7%,表达产物分子质量约为32kD。酶粗提取液比活约为35U·mg-1。重组蛋白浓度0.2772(mg·mL-1)。【结论】本研究成功构建了牦牛Cu,Zn-SOD/pET22b(+)原核表达载体,表达量较高、稳定性强,重组表达产物具有较高生物学活性。     

广西三黄鸡γ-干扰素基因真核表达载体的构建及表达

设计1对特异性引物,采用PCR方法从pMD18-TCHIFN-γ重组载体中扩增得到广西三黄鸡γ-干扰素基因,然后将该基因克隆入含有绿色荧光报告基团EGFP的真核表达载体pEGFP-N1中,构建成pEGFP-N1 CHIFN-γ重组质粒,PCR鉴定结果和测序结果均显示,γ-干扰素基因正确地插入到真核表达载体中。使用脂质体转染法将pEGFP-N1 CHIFN-γ转染Vero细胞,荧光显微镜下成功地观察到绿色荧光,说明γ-干扰素基因成功表达。     

牛干扰素-γ基因的克隆与真核表达载体的构建

根据Genebank中已发表的INF-γ蛋白cDNA序列保守区设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术从Con A活化的牛外周血单核细胞中扩增到编码牛INF-γ蛋白基因,其大小为510 bp左右。将该基因克隆到pMD18-T载体中,测序结果与Genebank上发表的INF-γ基因序列进行比较,其同源性为99.8%。将该基因从重组pMD18T-IFN质粒中克隆到表达载体pcDNA3.1(+)质粒中,构建真核表达重组质粒,经酶切和PCR鉴定后表明构建的重组质粒为阳性。     

鸡γ-干扰素的克隆·表达和序列分析

[目的]为鸡γ-干扰素的进一步研究奠定基础。[方法]根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,设计1对特异性引物。利用RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆鸡γ-干扰素基因,并在IPTG诱导下在大肠杆菌中表达重组菌。[结果]克隆的鸡γ-干扰素基因全长495bp,编码165个氨基酸,与国外克隆的鸡γ-干扰素基因序列的同源性为100%。鸡γ-干扰素蛋白含有12个α螺旋,3个β折叠,7个β转角。它具有强抗原性,而第16～23位氨基酸无抗原性。重组蛋白的分子量约18kD,其经IPTG诱导表达4h后,表达量最高,表达产率高达25%。[结论]鸡γ-干扰素具有一定的抗原性,预示其在免疫反应中起一定作用。     

宁乡猪生长激素基因的克隆及其原核表达载体的构建

[目的]研究了宁乡猪生长激素基因(nxGH)的克隆及其原核表达载体的构建。[方法]根据已报道的猪生长激素基因序列设计了1对特异性引物,应用RT"PCR技术从宁乡猪脑垂体中克隆了nxGH编码区序列。[结果]扩增片段全长651 bp,共编码216个氨基酸。该序列与已报道的三元和五指山猪生长激素cDNA基因核苷酸序列同源性为99.85%。将nxGH cDNA序列定向插入pET"32a原核表达载体中,成功构建重组原核表达质粒pET"GH。[结论]为下一步制备宁乡猪生长激素抗体奠定了基础。     

大鼠热休克因子结合蛋白1原核表达载体的构建及表达

以重组克隆载体pGEM—T—hsbp1为模板,PCR扩增hsbp1,用限制性内切酶双酶切、T4连接酶连接、转化BL -21的方法构建pGEX-2TK-hsbp1原核表达载体,实现了hsbp1在BL21中的表达,SDS—PAGE检测表达的融合蛋白主要以可溶形式存在,并利用亲和层析得到融合蛋白。     

斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。