马岗鹅TLR3基因选择性剪切体的克隆及生物信息学分析

为了研究鹅Toll样受体3(gTLR3)基因选择性剪切体在抗感染免疫中的作用,根据鸡、人和小鼠TLR3基因序列设计引物,利用RT-PCR和SMART RACE技术,首次克隆了鹅TLR3基因的选择性剪切体。所得基因序列提交GeneBank,登录号:KC292271。结果表明:核酸序列分析表明,鹅TLR3基因选择性剪切体开放阅读框长2283 bp,编码761个氨基酸,该蛋白等电点7.56,分子量为86.29 kD;与鹅、鸡、小鼠、猪、鱼、牛、羊和人的同源性分别为84.71%、74.40%、48.63%、50.38%、40.09%、50.16%、50.71%和50.98%。推导的氨基酸序列分析显示,在其胞外具有LRRs结构域,跨膜区和不完整的TIR结构域,N末端存在信号肽,且可能在26～27位氨基酸处存在裂解位点。胞外区有14个明显的LRR和15个N连接的糖基化位点。文章首次证实鹅TLR3选择性剪切体的存在,为进一步研究该基因的功能和蛋白质的特性奠定了基础。     

朗德鹅TLR4基因的生物信息学分析

为研究鹅TLR4的特征与功能,采用生物信息学方法对朗德鹅TLR4进行分析。结果表明,TLR4蛋白分子式为C₄₃₆₄H₆₈₆₇N₁₁₃₅O₁₂₃₉S₃₂,定位于细胞膜,存在信号肽;含有8个LRR、1个LRR＿CT、1个跨膜结构域以及胞内区的TIR;具有12个潜在的N-糖基化位点和89个磷酸化位点,可能与TIRAP和S100A9等具有相互作用。高级结构预测显示,该TLR4由α-螺旋、β-转角、延展链以及无规则卷曲组成。进化树分析表明朗德鹅与禽类亲缘关系较近,与其他物种则较远。研究表明朗德鹅TLR4蛋白是一种疏水偏碱性蛋白,符合TLRs家族典型结构,但在不同物种间存在一定差异性。     

三黄鸡TLR4基因的克隆及序列分析

为了解三黄鸡天然免疫受体TLR4基因的特点,本试验根据GenBank上已公布的其它品种鸡的TLR4基因序列设计引物,利用三黄鸡肝脏提取总RNA为模板,获得三黄鸡TLR4基因的cDNA全序列.基因序列分析表明,三黄鸡TLR4基因编码区全长2532 bp,编码843个氨基酸,N端含有30个氨基酸组成的信号肽,分子质量为95...     

马岗鹅RIG-Ⅰ基因扩增及序列分析

为研究马岗鹅维甲酸诱导基因Ⅰ(Retinoic acid inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)的基因序列特征,试验扩增了马岗鹅RIG-Ⅰ基因,分析了马岗鹅RIG-Ⅰ基因序列并表达了其蛋白.结果 显示:马岗鹅RIG-Ⅰ基因cDNA的开放阅读框全长为2805 bp,编码934个氨基酸,蛋白分子量约为106.63 ...     

鹅FoxO1基因cDNA序列的克隆及组织表达

为了研究鹅FoxO1（forkhead box O1）基因的功能,根据GenBank已收录的鸡（Gallus gallus）、人（Homo sapiens）和小鼠（Mus musculus）等物种FoxO1基因序列的同源保守区域,设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆鹅FoxO1基因cDNA序列,并对基因序列进行了生物信息学分析。结果表明,成功克隆得到了鹅FoxO1基因cDNA序列,通过BLAST比对,鹅FoxO1基因与原鸡、人、小鼠的核苷酸序列同源性分别为97%、83%、82%,FoxO1基因在四川白鹅中表达水平总体表现为：皮脂＞腹脂＞腿肌＞胸肌＞肝脏。因此,FoxO1基因在多个组织中都有表达,且表达差异较大。     

鹅GnIH受体基因的克隆及组织表达特性研究

为明确促性腺激素抑制激素(GnIH)及其受体RF酰胺相关肽受体(RFRPR)和神经肽FF受体(NPFFR)在鹅不同组织的表达,探讨GnIH及其受体与鹅繁殖调控间的关系,研究通过逆转录PCR方法获取各基因的cDNA序列,采用实时荧光定量PCR分析GnIH、RFRPR和NPFFR在产蛋期母鹅的卵巢、输卵管、肾脏、肾上腺、眼球、脊髓、延髓、嗅球、视神经叶、大脑、小脑、垂体、下丘脑共13个组织中的mRNA表达水平。序列分析发现,鹅GnIH的2个受体RFRPR和NPFFR高度同源,氨基酸序列相似性达65.35%,具有相似的跨膜结构。荧光定量PCR结果显示,GnIH前体mRNA的主要表达部位是在下丘脑,且在延髓、脊髓、肾上腺、输卵管和卵巢中也有一定的表达。RFRPR和NPFFR两个受体在有GnIH表达的组织中基本都有表达。结果表明,在鹅中,RFRPR更符合GnIH受体的特征,GnIH及其受体可能从下丘脑-垂体-性腺轴的多个环节对鹅的繁殖行为进行调控。     

乌苏里貉TLR8基因的分子克隆、序列分析及组织表达分析

为了解乌苏里貉TLR8基因特点及其在不同组织中的表达水平,本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆其c DNA全长序列,应用生物学软件分析该基因及预测其编码蛋白的特征,并对该基因在乌苏里貉不同组织中的表达水平进行检测。结果显示该基因全长3 191 bp,ORF全长3 117 bp,编码1 038 aa,含有Toll-like受体家族典型的结构域特征。同源性分析显示乌苏里貉TLR8基因核苷酸序列与犬同源性最高,达99.3%,与其他食肉目哺乳动物也具有较高的同源性,在89.2%~92.9%。组织表达分析显示TLR8基因在乌苏里貉各组织中广泛表达但表达量存在差异。本研究结果为进一步研究乌苏里貉抗病毒免疫及育种相关研究奠定了基础。     

鹅ACSL6基因编码区克隆、序列分析及组织表达

为研究长链酯酰辅酶A合成酶6(ACSL6)在鹅中的功能,采用RT-PCR方法对其扩增,并采用荧光定量PCR方法检测其在四川白鹅不同组织中的差异表达。结果表明:实验成功获得了鹅ACSL6基因的编码区序列(GQ449255),序列全长2 097 bp,编码698个氨基酸;鹅ACSL6与鸡该基因在核苷酸和氨基酸水平上都有较高的同源性;鹅ACSL6氨基酸与哺乳动物一样,也存在2个保守功能区(跨膜区和luxE保守区),且在这些区域物种间变异较少;鹅ACSL6在脑组织中有较高表达,在肝脏中表达较少,仍与其在哺乳动物中的表达特性一致。以上研究结果表明,ACSL6基因在物种间比较保守,ACSL6与鹅大脑的发育关系密切,可能与鹅肥肝形成的关系较少。     

鹅MLPH基因分子克隆、组织表达及SNP检测

研究采用RT-PCR和克隆的方法获得鹅黑素亲和素(MLPH)基因的cDNA和基因组DNA序列,采用半定量RT-PCR的方法检测MLPH基因在鹅组织中的表达,并利用DNA池的方法扫描MLPH基因的多态位点。结果显示:鹅MLPH基因cDNA长2 147 bp(GenBank登录号:KU904428),包括17 bp的5′非翻译区、1 992 bp的开放阅读框和138 bp的3′非翻译区。生物信息学分析表明,鹅MLPH基因开放阅读框编码663个氨基酸残基,其分子量为74.62 ku,理论等电点为5.94。推导的MLPH氨基酸序列具有4个卷曲螺旋结构、1个锌指结构域和1个RAB结合域。鹅MLPH基因组DNA长20 540 bp(GenBank登录号:KU904431),按照GT-AG剪接法则,划分为16个外显子和15个内含子。进化树结果分析表明,鹅MLPH与家禽有密切的亲缘关系,特别是与绿头鸭的亲缘关系密切。半定量RT-PCR结果表明,鹅MLPH mRNA在不同的色素沉着组织中表达,如眼睛、背部皮肤、腹部皮肤和脚蹼,而在其他组织中未检测到表达。同时,鹅MLPH基因在外显子11上存在2个碱基突变(c.1506CT、c.1542AG),且分别导致编码的氨基酸改变(p.497ProSer、p.509LysGlu)。该研究结果为鹅MLPH基因的研究奠定基础,为鹅羽毛颜色形成的研究提供参考。     

番鸭ERBB4基因组织表达、克隆及序列分析

试验旨在检测受体酪氨酸蛋白激酶4(receptor tyrosine protein kinase 4,ERBB4)基因在番鸭不同生理状况下脑组织中的相对表达水平,分析其生物信息学功能,探究ERBB4基因是否影响鸭的攻击行为。运用实时荧光定量PCR方法对番鸭的纹状体、下丘脑中ERBB4基因的相对表达量进行检测,通过RT-PCR扩增并克隆ERBB4基因CDS核心区后测序,分析其同源性及遗传进化关系,并结合生物信息学分析工具预测ERBB4蛋白的理化特性、亚细胞定位、信号肽、二级结构、三级结构等。结果显示,ERBB4基因在番鸭两个脑组织中都有一定的表达,在攻击行为番鸭脑组织中的表达量高于正常组,在纹状体中的表达量略高于下丘脑。ERBB4基因核苷酸与氨基酸序列同源性比对显示,ERBB4基因在不同物种间具有一定的遗传多样性,与绿头鸭亲缘关系最近。ERBB4蛋白为亲水性稳定蛋白,氨基酸序列的N端不存在信号肽,存在5个富含呋喃样半胱氨酸(FU)结构域和1个酪氨酸激酶(TyrKc)蛋白结构域,亚细胞定位于细胞质;空间结构以右手α-螺旋和无规则卷曲为主。综上,ERBB4基因可能在番鸭神经系统中发挥重要作用,本研究结果为进一步深入探讨ERBB4基因在番鸭攻击行为中的作用机制提供了参考资料。     

番鸭ERBB4基因组织表达、克隆及序列分析

试验旨在检测受体酪氨酸蛋白激酶4（receptor tyrosine protein kinase 4,ERBB4）基因在番鸭不同生理状况下脑组织中的相对表达水平,分析其生物信息学功能,探究ERBB4基因是否影响鸭的攻击行为。运用实时荧光定量PCR方法对番鸭的纹状体、下丘脑中ERBB4基因的相对表达量进行检测,通过RT-PCR扩增并克隆ERBB4基因CDS核心区后测序,分析其同源性及遗传进化关系,并结合生物信息学分析工具预测ERBB4蛋白的理化特性、亚细胞定位、信号肽、二级结构、三级结构等。结果显示,ERBB4基因在番鸭两个脑组织中都有一定的表达,在攻击行为番鸭脑组织中的表达量高于正常组,在纹状体中的表达量略高于下丘脑。ERBB4基因核苷酸与氨基酸序列同源性比对显示,ERBB4基因在不同物种间具有一定的遗传多样性,与绿头鸭亲缘关系最近。ERBB4蛋白为亲水性稳定蛋白,氨基酸序列的N端不存在信号肽,存在5个富含呋喃样半胱氨酸（FU）结构域和1个酪氨酸激酶（TyrKc）蛋白结构域,亚细胞定位于细胞质;空间结构以右手α-螺旋和无规则卷曲为主。综上,ERBB4基因可能在番鸭神经系统中发挥重要作用,本研究结果为进一步深入探讨ERBB4基因在番鸭攻击行为中的作用机制提供了参考资料。     

鸡PDKPDK4基因的克隆及组织差异表达研究

丙酮酸脱氢酶激酶4(PDK4)基因在动物机体的糖-脂代谢过程中起着重要的调节作用。为揭示PDK4基因对家禽生长和脂肪沉积的影响,以快速生长型肉鸡(隐性白羽洛克鸡)和慢速生长型肉鸡(杏花鸡)为试验对象,采用分子克隆、生物信息学分析和实时荧光定量PCR等方法,克隆鸡PDK4基因并分析其多态位点及在不同生长速度肉鸡组织的表达差异。克隆获得杏花鸡PDK4基因全长3 473 bp序列,并筛查到22处核苷酸多态性位点。生物信息学分析结果表明鸡PDK4蛋白与哺乳动物该基因蛋白序列之间的同源性较高,与爪蟾、斑马鱼的同源性较低;实时荧光定量PCR结果表明PDK4基因在不同生长速度的肉鸡组织中的表达存在较大差异,从组织表达来看,PDK4基因在脂肪组织中(皮脂和腹脂)的表达高于下丘脑和肝脏;从品种来看,PDK4基因在杏花鸡各组织的表达高于隐性白洛克鸡。可见,PDK4基因对家禽的生长和脂肪沉积有重要影响,是影响家禽生长和脂肪沉积的重要候选基因。     

扬州鹅NPFFR1基因CDS区克隆、生物信息学分析及组织表达检测

本研究旨在对鹅促性腺激素抑制激素受体基因(NPFFR1)进行克隆及生物信息学分析,并检测其在鹅不同组织中的表达。利用鸡NPFFR1基因为种子序列,采用RT-PCR方法克隆出扬州鹅NPRRF1基因,并通过相关软件对基因序列进行生物信息学分析。结果显示:共发现扬州白鹅NPFFR1基因的两种剪接形式:剪接体1的ORF大小为1 200 bp,编码399个氨基酸;剪接体2的ORF大小为432 bp,编码143个氨基酸,相对剪接体1缺失31 bp。对其进行生物信息学分析发现,鹅NPFFR1基因与鸡NPFFR1基因CDS序列同源性为92.8%,其产物是一种不稳定、疏水性蛋白,主要分布在细胞膜上;蛋白质跨膜结构预测显示鹅NPFFR1蛋白含有7个跨膜结构,属于跨膜蛋白,无信号肽片段。对产蛋末期母鹅10个组织样品的cDNA实时定量PCR结果显示,NPFFR1基因在各组织中均有表达,在下丘脑中表达最高,其次是腹脂、小肠、卵巢、胃、垂体、心脏、肌肉,在肾脏以及肝脏中表达很低。研究结果为今后探究鹅NPFFR1蛋白的相关功能及与其他蛋白质的相互作用提供了理论依据,同时为扬州鹅生殖轴调控产蛋性能的机理研究提供参考。     

鹅CAT-4基因的简并引物设计及克隆

CAT-4是生物体内重要的氨基酸转运蛋白,通过CodeHop法来克隆鹅CAT-4基因片段,为今后对CAT-4基因的研究提供依据。结合BlockMaker、CodeHop、NCBI、Blastp、ClustalW2等生物信息学资源和DNAMAN、Oligo6.0等生物软件,设计鹅CAT-4基因的简并引物,对所涉及的CAT-4基因片段进行克隆。此次试验成功地克隆了鹅脑组织中的CAT-4基因,并且获得了CAT-4基因编码的cDNA部分序列,其长度为450 bp。结果表明,CodeHop法设计简并引物,能够提高引物特异性,减少假阳性率,有利于试验成功。     

西农关中奶山羊PDCD4基因的克隆与组织表达分析

旨在研究程序性细胞死亡因子4(PDCD4)基因与奶山羊乳腺发育的关系。应用RT-PCR技术克隆PDCD4基因编码区(CDS)序列,并进行生物信息学分析,运用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测不同组织mRNA相对表达量。结果表明：克隆获得的关中奶山羊PDCD4基因CDS序列长1 410 bp,编码469个氨基酸,分子质量为51.8 ku,分子式为C₂₂₄₅H₃₆₀₆N₆₃₆O₇₃₀S₁₉,理论等电点为5.03;编码蛋白含有4个N-糖基化位点、6个O-糖基化位点及53个潜在的磷酸化位点;PDCD4蛋白为亲水性酸性蛋白质,无信号肽,无跨膜结构域;系统进化树显示PDCD4蛋白的氨基酸序列在不同物种间相似度较高,奶山羊与绵羊、牛、猫、猪、弯角大羚羊、美洲白尾鹿等同源性均在90%以上,其中与绵羊的亲缘关系最近;蛋白互作分析显示PDCD4蛋白能与EIF4A1、EIF4G1、PTEN、EIF4A2、EIF4B、RECK、GMPS、EEF1G等蛋白相互作用;qRT-PCR结果显示PDCD4...     

句容四季鹅GH基因的克隆和表达分析

本文对句容四季鹅与浙东白鹅不同周龄体重进行比较,发现:不同周龄四季鹅与浙东白鹅相比差异均极显著。在屠宰指标上,除腹脂重和肌胃重外,腺胃重差异显著,其余差异均极显著。垂体中GH表达量与肾脏相比差异极显著(P<0.01),与腹脂、下丘脑、胸肌相比差异显著(P<0.05),其余均不显著。与屠宰指标的相关分析研究中发现下丘脑GH基因的表达与肝重相关系数为0.764(P<0.05)。这可以为我们研究句容四季鹅四季繁殖提供研究基础。     

牦牛酪蛋白基因家族的克隆及组织表达分析

本研究旨在克隆牦牛酪蛋白基因家族(CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3)的CDS区序列,鉴定其在牦牛不同组织中的表达水平。选取4岁龄左右处于泌乳期的健康类乌齐母牦牛3头,屠宰后分别采集乳腺、心脏、肝脏、骨骼肌组织,分别提取组织总RNA并反转录为cDNA,设计酪蛋白基因家族特异性引物扩增酪蛋白基因家族序列,进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR法分别检测酪蛋白家族基因mRNA水平。结果显示,克隆得到CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3基因cDNA序列分别为919、832、805和715bp,其CDS区全长分别为645、669、690和585bp,分别编码214、222、259和194个氨基酸残基。类乌齐牦牛酪蛋白基因家族与黄牛亲缘关系最近,其次是印度水牛,而与单胃动物猪的亲缘关系最远。组织表达结果显示,酪蛋白基因家族在组织中广泛表达,其中在乳腺组织中的表达量最高,其次是骨骼肌组织。在乳腺组织中CSN1S1、CSN1S2、CSN2基因之间表达量差异不显著(P0.05),但CSN2基因表达量显著高于CSN3基因(P0.05)。以上结果为酪蛋白基因家族在牦牛乳腺蛋白质代谢调控机制的研究提供了参考依据。     

鹅GnRH基因CDS区克隆、序列分析及原核表达

本研究旨在了解鹅GnRH基因的CDS区序列及其蛋白表达情况,研究鹅GnRH蛋白的生理功能,为进一步阐明GnRH蛋白影响鹅繁殖性能的调控机制提供理论基础。采用RT-PCR方法从溆浦鹅下丘脑扩增获得GnRH基因的CDS区序列,将测序正确的DNA序列定向克隆到pET28a(+),构建表达载体pET28a-GnRH,并转化至BL21(DE3)大肠杆菌表达目的蛋白,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测和Western blot分析。结果显示:获得的溆浦鹅GnRH基因CDS区部分序列,含有270个核苷酸,编码前体蛋白中的90个氨基酸;溆浦鹅GnRH基因CDS区在大肠杆菌中得到高效表达,GnRH基因CDS区的目的蛋白为9 900,最终测得菌体湿重为0.6g/L,纯化后得到的蛋白为20~30mg/L;清晰检测到GnRH基因表达的蛋白特异带,试验获得的抗体对原核表达的GnRH蛋白具有特异性反应;鹅GnRH基因在动物进化中高度保守,研究得到的鹅GnRH前体蛋白可为进一步研究GnRH基因的生物功能以及其对鹅就巢、产蛋等繁殖性状的影响奠定基础。     

牦牛酪蛋白基因家族的克隆及组织表达分析

本研究旨在克隆牦牛酪蛋白基因家族(CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3)的CDS区序列,鉴定其在牦牛不同组织中的表达水平。选取4岁龄左右处于泌乳期的健康类乌齐母牦牛3头,屠宰后分别采集乳腺、心脏、肝脏、骨骼肌组织,分别提取组织总RNA并反转录为cDNA,设计酪蛋白基因家族特异性引物扩增酪蛋白基因家族序列,进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR法分别检测酪蛋白家族基因mRNA水平。结果显示,克隆得到CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3基因cDNA序列分别为919、832、805和715bp,其CDS区全长分别为645、669、690和585bp,分别编码214、222、259和194个氨基酸残基。类乌齐牦牛酪蛋白基因家族与黄牛亲缘关系最近,其次是印度水牛,而与单胃动物猪的亲缘关系最远。组织表达结果显示,酪蛋白基因家族在组织中广泛表达,其中在乳腺组织中的表达量最高,其次是骨骼肌组织。在乳腺组织中CSN1S1、CSN1S2、CSN2基因之间表达量差异不显著(P>0.05),但CSN2基因表达量显著高于CSN3基因(P<0.05)。以上结果为酪蛋白基因家族在牦牛乳腺蛋白质代谢调控机制的研究提供了参考依据。     

鹅副粘病毒F基因的克隆及遗传变异分析

以鹅副粘病毒LN-7-02株基因组RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出F基因片段,并克隆至T载体.经质粒PCR及酶切鉴定后,对阳性克隆进行测序.测序后拼接得到F基因上游539bp核苷酸序列,并推导出ATG后1～374bp氨基酸序列.序列分析表明,LN-7-02株F蛋白裂解位点区的氨基酸组成为112R-R-Q-K-R-F117,与禽Ⅰ型副粘病毒(APMV-1)强毒株特征相符.将LN-7-02与AMPV-1株CH2000、F48E9和LaSota进行同源性比较,结果LN-7-02与CH2000、F48E9和LaSota的同源性分别为91.8%、86%和84%,表明该毒株相对于经典的AP-MV-1在F基因上已发生了较大变异.根据国内外70株APMV-1的F基因核苷酸序列绘制系统发育进化树,结果疫苗株Lasota属于基因Ⅱ型,经典株F48E9属于我国特有的基因Ⅸ型,而LN-7-02株与鹅副粘病毒JS-9-01、ZJ-100和GD-QY97同属于APMV-1基因Ⅶ型.