不同类型鸡泄殖腔棉拭子禽白血病病毒p27抗原检测与病毒分离的相关性分析

为探讨泄殖腔棉拭子或种蛋中禽白血病病毒(ALV)-p27抗原检测与病毒分离检测之间的相关性,对不同类型鸡编号后分别对应采集泄殖腔棉拭子或蛋清后以ALV-p27抗原检测试剂盒检测,同时无菌采集抗凝血接种DF-1细胞进行ALV的分离鉴定。结果显示,人工感染A亚群ALV的SPF鸡群泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原检测与病毒分离有很高的吻合率,相对于病毒分离法,119次泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原检测中出现有1例假阳性和3例假阴性;从美国进口的200只祖代肉鸡3次采血DF1细胞分离病毒结果均为阴性,而泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原阳性率依次为4.00%(8/200),2.97%(5/168)和2.61%(4/153),假阳性率为3.30%。相对于病毒分离法,正在实施ALV净化的不同遗传背景地方品系鸡泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原检测的假阳性率高达93.20%~100.00%,还有一定比例假阴性(1/9,1/4,1/3)。本研究大量对应比较的数据表明,相对于血浆病毒分离法,不同类型鸡的泄殖腔棉拭子ALVp27抗原检测法不仅有很高的假阳性率,还有一定比例的漏检率。在种鸡场的ALV净化过程中考虑到成本,不建议以泄殖腔棉拭子作为检测材料。本试验为我国鸡群禽白血病净化检测和临床鉴别诊断提供参考依据。     

禽白血病病毒p27抗原ELISA检测试剂盒的比较与评估

为了更好地进行禽白血病监测与净化,研究使用由蛋清、细胞培养物、胎粪等多种样品组成的样品盘对7种禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）p27抗原ELISA检测试剂盒（国产试剂盒DA、DB、DC,进口试剂盒IA、IB、IC、IDEXX）进行比较。结果显示：从分析特性上看,试剂盒分析特异性均较好,未观察到与其他常见禽源病毒的交叉反应;与IDEXX相比,DA、IA的分析敏感性较高,DB、IC其次,DC、IB较低,对于ALV不同亚群,各种试剂盒分析敏感性差异可达2～3个稀释度;从诊断特性上看,与IDEXX相比,DB、DC和IC的诊断敏感性和诊断特异性均高于90%;DA、IA和IB与IDEXX的诊断敏感性和诊断特异性均高于80%;各试剂盒对于不同类型样品（DF-1细胞培养物、蛋清、胎粪）的诊断敏感性和诊断特异性存在差异;从重复性上看,DA和IA的批内变异系数均在15%以内。综上所述,与IDEXX相比,当前国产p27抗原ELISA检测试剂盒DA和DB、进口p27抗原ELISA检测试剂盒IA和IC的各项性能可满足禽白血病净化各阶段对不同类型样品的检测需求。     

鸡蛋和胎粪禽白血病病毒p27抗原检测试验

本试验选择某品种鸡的快羽系与慢羽系为试验群体,利用ELISA技术检测鸡蛋和胎粪中禽白血病病毒(ALV)p27抗原。试验结果显示:慢羽系鸡蛋中ALV p27抗原阳性率高于快羽系;检测重复鸡蛋数分别为1、2、3枚时,阳性鸡检出比例分别为2.5%、5.0%和6.0%,随着检测鸡蛋数的增加,检出阳性鸡的比例也逐渐增加,检测的准确性也逐渐增加;对慢羽系种蛋3个批次检测时,3批都检出阳性鸡的比例为7.5%,2批检出率为21.4%,1批检出率为39.3%,31.8%的慢羽系在3批中都呈阴性。雏鸡胎粪检测结果显示:慢羽系个体阳性率(5.2%)高于快羽系(1.45%),慢羽系家系后代阳性率(32.0%)高于快羽系(10.9%);当1个家系某批次中检出阳性雏鸡数≥3只时,93.4%的家系会在多批纯繁中都会检出阳性雏鸡。本试验证明了ALV感染鸡只的排毒呈现明显的间歇性,需要多次反复检测才能达到种群净化的目的。     

母鸡蛋清混样检测禽白血病病毒p27抗原的应用研究

为探讨同一母鸡蛋清混样法检测禽白血病病毒p27抗原用于禽白血病净化的可行性,本研究对3个蛋清逐一检测得到的43只阳性鸡和49只阴性鸡,再次进行了混样检测,通过对比2种方法的判定结果,发现混样检测法需结合样品与阳性对照OD值的比值(S/P)≥0.10的阳性判定标准才能够检出所有阳性个体,此外降低S/P阈值会有助于将一部分弱阳性或可疑个体检出。进一步采用蛋清混样检测法对北京油鸡4个品系开展了2～3次的净化流程后,发现1个品系的阳性比例没有变化,而另外3个品系阳性比例持续降低,并且有一个品系(L2系)首次实现了零检出。对4个品系808只公鸡进行了2次全血病毒分离,结果显示阳性率均为0,可疑(S/P≥0.10)比例均低于2%,净化效果显著。本结果充分证实了蛋清混样检测结合S/P≥0.10的阳性标准开展禽白血病净化是行之有效的,为其他品种禽白血病的净化提供参考。     

禽白血病p27抗原检测阳性与病毒分离的相关性比较

本试验以80只300日龄的A品系蛋鸡为试验对象,分5个日龄段按翅号采集蛋清、泄殖腔棉拭子,无菌抗凝血和血清.用ALV p27抗原检测试剂盒检测蛋清和泄殖腔棉拭子.将无菌抗凝血分离血浆接种DF-1细胞,培养一周后用同样方法检测上清收集液,分析该群鸡只在不同日龄段泄殖腔棉拭子阳性、蛋清样本阳性和病毒分离阳性之间的相关性.用ALV-Ab抗体试剂盒检测各日龄段血清的抗体水平.此外,选取某一日龄段蛋清和泄殖腔拭子样本用4个不同厂家的ALV p27抗原检测试剂盒进行检测比较.结果表明,5个日龄段泄殖腔棉拭子平均阳性率为61％,蛋清样本平均阳性率为72.6％,病毒分离平均阳性率为48.8％.5个日龄段ALV的抗体阳性率一直为零;4个厂家的ELISA试剂盒对同一批样本的检测结果表明,IDEXX试剂盒的敏感度最高.本试验为外源性鸡白血病病毒检测及鸡白血病净化其方法的应用、试剂盒的选择、减少判定的误差、提高净化效果提供了一定的科学依据.     

国家三类新兽药 禽白血病病毒p27抗原夹心ELISA检测试剂盒

一、主要成分与含量二、作用与用途用于检测蛋清、泄殖腔棉拭子(胎粪)和细胞分离病毒上清中的禽白血病病毒p27抗原。三、用法与判定1.用法(1)洗涤液的配制使用前,将浓缩的洗涤液恢复至室温(20℃-25℃),并摇动使结晶溶解,然后用超纯水作10倍稀释(例如:每板用40ml浓缩液加上360ml水),即1x洗涤液。     

抗禽白血病病毒p27蛋白线性抗原表位的鉴定

为鉴定禽白血病病毒(ALV)p27蛋白中的线性抗原表位,本研究以原核表达的重组p27蛋白免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,将免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,利用间接ELISA方法筛选纯化获得一株能够稳定分泌特异性单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株。Western blot试验结果显示,该MAb可以识别ALV的群特异性抗原p27蛋白。间接免疫荧光试验结果显示,MAb与A、B和J亚群ALV均呈阳性反应。对p27蛋白进行截短表达,利用western blot和间接ELISA进行表位鉴定,确定了MAb所识别的抗原表位位于129LVAITASALQAFRE142。氨基酸序列比对结果显示,本研究所鉴定出的p27表位在A、B和J亚群ALV之间高度保守。本研究为ALV检测方法的建立及其免疫学功能的研究提供了有利的工具。     

同一母鸡三个蛋清混样检测禽白血病病毒p27抗原的可行性分析

为探讨采用母鸡3个蛋清混样开展禽白血病检测与净化的可行性,试验对2014~2016年北京油鸡5个品系30 639只母鸡蛋清禽白血病病毒p27抗原ELISA结果进行了统计与分析。同一母鸡3个蛋清S/P值求平均作为混样的S/P值,以S/P≥0.20、S/P≥0.15、S/P≥0.10为阳性判定标准,分别比较混样法与单独检测的一致性。结果显示:随着净化代次的增加,阳性判定阈值降低,混样法对阳性母鸡检出率逐渐升高。以S/P≥0.10为阳性标准,2016年阳性母鸡检出率为100%,母鸡阴性转为阳性的比例不超过1%,其中2个或3个蛋清S/P值≥0.10的占80%~90%。研究结果充分说明母鸡3个蛋清混样进行禽白血病病毒p27抗原检测理论上是可行的,尤其在净化后期或种群阳性比例不高的情况下,将S/P≥0.10定为阳性标准,不仅可以淘汰阳性个体,而且有助于淘汰弱阳性个体。     

龙岩市地方优良种禽原种场禽白血病p27抗原检测与分析

用酶联免疫吸附试验法对长汀河田鸡原种场、武平象洞鸡原种场、龙岩山麻鸭原种场共686份蛋清样本及801份泄殖腔棉拭子进行禽白血病p27抗原检测。结果为：龙岩山麻鸭的蛋清样本和泄殖腔棉拭子均未检出ALV核酸;鸡蛋清样本阳性率为12.8%（80/626）,明显高于泄殖腔棉拭子阳性率8.9%(66/741);鸡原种场180日龄蛋清样本和泄殖腔棉拭子阳性率均最高,平均阳性率分别为15.0%和11.3%。表明：龙岩市境内地方优良鸡原种场中有禽白血病感染现象。     

公鸡精液和肛拭子样品禽白血病抗原检测对比研究

本研究对2014—2015年某地方品种5个品系12个批次共1 512只公鸡的精液和肛拭子样品进行了禽白血病p27抗原ELISA检测和对比分析,结果发现二者的一致性平均为83%左右。当精液和肛拭子抗原阳性率越高时,二者的一致性越差。经过两个世代的净化,无论是精液还是肛拭子p27抗原平均阳性率都下降了4个百分点左右。因此,需要采取精液结合肛拭子ELISA检测的方法,共同检测淘汰阳性个体。对公鸡进行单一检测方法难以满足净化需要。     

抗禽白血病p27抗原单克隆抗体的制备与鉴定

检测p27抗原的检测试剂在禽白血病的研究和防治方面有着极其重要的作用.为研究国产的禽白血病诊断试剂,利用禽白血病各亚群病毒的p27蛋白很保守的特点,我们将原核表达的禽白血病p27蛋白作为抗原,免疫8周龄的BALB/C小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,获得三株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株.通过Western-blotting和ELISA的结果分析证明,三株单抗与原核表达得p27蛋白和禽白血病各亚群病毒反应,而不与禽流感病毒等反应.可以看出,这三株单抗在ALV的抗原分析、血清学诊断和疫苗质量监测以及禽白血病污染细胞检测等方面有着极其重要的应用价值.     

不同检测材料对ELISA检测禽白血病病毒-p27抗原结果的影响

为探讨不同检测材料对ELISA检测禽白血病病毒(ALV)-p27抗原结果的影响,试验首先对180日龄地方品种母鸡的泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原进行ELISA检测,选取部分阳性鸡和阴性鸡进行分组试验,采用ELISA对试验鸡血清、蛋清和病毒分离的细胞培养液进行ALV-p27抗原检测,采用RT-PCR方法检测血液ALV特异性基因。结果显示,阳性组中以血清、蛋清和细胞培养液作为ELISA ALV-p27抗原检测材料,其检测阳性率均低于泄殖腔棉拭子,血清检测的阳性个体包含全部蛋清和细胞培养液ELISA检测的阳性个体。ELISA检测数据的相关性分析显示,只有血清和细胞培养液检测数据间存在显著性相关,线性关系方程为Y(细胞上清)=1.8439X(血清)-0.1469,R²=0.937;阳性组中ALV-p27基因检测阳性率低于泄殖腔棉拭子,但高于血清、蛋清和细胞培养液,其包含所有血清ELISA检测的阳性样品;外源性ALV-J gp85基因阳性率仅为29.17%,且阳性样品均属于血清ELISA阳性样品。综上所述,成年鸡以泄殖腔棉拭子作为ELISA ALV-p27抗原检测材料存在假阳性结果,蛋清和细胞培养液作为检测材料存在漏检的可能,血清作为ELISA检测材能够更准确地反映成年鸡群ALV感染状态。     

应用Dot-ELISA检测禽白血病病毒抗原的研究

以鸽抗鸡劳氏肉瘤病毒(RSV)血清IgG作为包被抗体及酶标抗体的双抗体夹心法Dot-ELISA,检测禽白血病病毒抗原,其特异性及敏感性与澳大利亚ELISA(用兔抗AMV-P_(27)血清IgG作为包被抗体及酶标抗体)相同。可用以检测卵清中禽白血病病毒抗原及用鸡胚或鸡胚细胞生产的各种疫苗中污染的禽白血病病毒抗原。     

禽白血病病毒p27基因在毕赤酵母中的表达

为获得禽白血病病毒p27蛋白,利用DNA重组技术,将扩增的p27基因亚克隆至酵母表达载体pPIC9K中,并将制备的酵母表达质粒电转至毕赤酵母细胞GS115中,通过SDS-PAGE和Western blot技术检测p27蛋白在不同条件下的表达情况,同时对诱导表达条件进行系统的优化.结果表明,成功构建出pPIC9K-p27...     

禽白血病/肉瘤病毒群特异性抗原p27的分离纯化及其抗体的制备

采用细胞培养法增殖禽白血病/肉瘤病毒(ALV/RSV)A亚型,然后对其进行超速离心浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化病毒,再采用电泳分离与电洗脱收集相结合的方法纯化p27蛋白.经检测,提取的p27蛋白具有良好的抗原性与免疫原性.用该蛋白免疫家兔制备的兔抗p27抗体,经ELISA方法检测其效价可达1:6400以上.     

茶花鸡禽白血病病毒血清抗体的调查和p27抗原排毒规律的研究

为了解西双版纳地方品系茶花鸡禽白血病(Avian leukosis,AL)的感染情况及p27的排毒规律,试验应用ELISA法对395份茶花鸡血清样本进行ALV-A/B亚群和ALV-J亚群抗体检测;并对1,14,35,42,70,105日龄按翅号对应采集的泄殖腔棉拭子及238日龄按翅号对应采集的蛋清跟踪检测ALV p27抗原。结果表明:茶花鸡ALV-A/B亚群和ALV-J亚群抗体阳性率分别为5. 57%和35. 44%;跟踪调查发现,茶花鸡分别在1日龄和238日龄达到排毒高峰。说明1日龄和238日龄是茶花鸡AL净化的最佳检测时间。     

种蛋中禽白血病病毒P27抗原检出率与鸡群禽白血病发病率的相关性研究

本研究旨在观察种鸡群所产种蛋中禽白血病病毒P27抗原检出率与种鸡群发病状况及其下一代鸡群禽白血病发病率的相关性,为鸡群净化和禽白血病预警提供参考依据.对国内海兰褐蛋鸡等品系不同祖代及父母代共7个种鸡场所产种蛋的P27抗原进行了检测,对部分种鸡场的ALV-A/B和ALV-J抗体进行了检测和病毒的分离鉴定,对各种鸡群孵化后下一代鸡群的禽白血病发病状况和客户投诉情况进行了追踪调查.7个种鸡场所产种蛋中P27抗原检出率为0%～12％,P27抗原检出率与种鸡群的发病状况及其子代鸡群的发病状况和客户投诉情况密切相关,即种蛋中P27抗原检出率越高,种鸡群发病情况越严重,下游客户鸡群发病率和投诉率越高.种鸡群的种蛋P27检出率与种鸡群及其孵化后鸡群的禽白血病感染状况具有较好的吻合性,可以作为开展ALV的流行病学调查和禽白血病感染风险评估的重要指标.     

禽白血病病毒抗原检测能力比对样品的制备

研究制备了禽白血病病毒抗原检测能力比对样品。禽白血病病毒(ALV)经56℃1h灭活后,采用商品化试剂盒进行初步定值,并用DMEM稀释制备出强、弱阳性和阴性样品,分装后保存。采用ELISA方法进行比对样品均匀性和稳定性检验,并发送32个实验室进行测试,所有参试实验室的检测结果符合定值范围。结果显示制备的比对样品均匀性和稳定性良好,满足检测能力验证要求。     

禽白血病病毒p27基因的原核表达及生物信息学分析

为了进一步研究禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)p27蛋白的结构与功能,并获得具有反应原性的重组蛋白p27,试验通过PCR技术克隆p27基因,构建克隆载体pMD19-T-p27,并应用生物信息学软件对获得的p27基因序列进行分析,构建重组表达载体pET-28a-p27,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,通过SDS-PAGE和Western-blot对获得的重组蛋白p27进行分析。结果表明:通过PCR技术克隆获得ALV p27基因,并成功构建了克隆载体pMD19-T-p27;生物信息学分析发现,p27蛋白由239个氨基酸组成,分子式为C_(1140)H_(1853)N_(323)O_(339)S_6,理论等电点为6.23,无信号肽和跨膜区,含有8个丝氨酸磷酸化位点和13个苏氨酸磷酸化位点,无糖基化位点,共有9个抗原表位,二级结构和三级结构中以α-螺旋为主;成功构建了重组表达载体pET-28a-p27,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中高效表达;诱导6小时时蛋白质表达量最大,分子质量约为27 ku,且以可溶性为主;重组蛋白p27具有较好的反应原性和特异性。说明试验获得了具有反应原性的重组蛋白p27,为建立禽白血病快速诊断方法和新型疫苗的研发提供了理论基础。