2011年中国北方H9N2亚型禽流感病毒分离株HA基因进化分析及受体结合性检测

为了解近期中国北方禽源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)流行规律及分子遗传进化特征,本实验对2011年在中国北方家禽中分离到的11株H9N2亚型AIV通过RT-PCR扩增病毒的HA基因片段,进行测序及遗传进化分析,并对这些病毒的受体结合性进行了检测.结果表明:11株H9N2亚型AIV分离株的HA基因在HA1和HA2的氨基酸裂解位点均为PSRSSR/GLF基序,符合低致病性病毒株氨基酸序列特征.多数病毒HA潜在糖基化位点为8个,所有分离株病毒的受体结合位点226位均为L,经红细胞受体结合性试验验证表明这些病毒均同时具有α-2,3和α-2,6受体结合特性,表明目前北方地区流行的H9N2亚型AIV具有感染哺乳动物的潜在威胁.本研究结果对加强H9N2病毒的分子流行病学监测具有重要意义.     

一株鸭源H11N3亚型禽流感病毒的遗传进化分析及对小鼠的致病性研究

为了解H11N3亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性，本研究对2020年在福州市某活禽市场鸭中分离的一株H11N3亚型AIV进行了全基因组测序、遗传进化分析和对BALB/c小鼠的致病性试验。测序结果显示，分离株HA裂解位点为PAIASR↓GLF，符合低致病性AIV分子特征；HA蛋白²²⁶L和²²⁸S突变显示病毒具有结合人源受体(SAα-2,6 Gal)的特征性氨基酸。PB1、PA、NP和M1蛋白均出现对哺乳动物致病性增强的特征性氨基酸。遗传进化分析显示，H11N3 AIV的8个基因节段均属于欧亚分支，其HA基因与A/duck/Fujian/SD061/2017 (H11N3)株HA基因序列相似性最高，而NA基因与A/EN/Fujian/02754/2016 (H3N3)株NA基因序列相似性最高。该病毒内部基因分别与浙江、福建和云南等地鸭和鸡体内分离的H7N9、H7N7、H1N2、H7N2、H7N7和H9N6等亚型AIV相关基因高度同源。小鼠致病性试验结果显示，该病毒未经适应即可在小鼠鼻甲和肺脏中高效复制，表明该病毒株具备感染哺乳动物的能力。上...     

2株鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒HA基因序列分析

为了探究2株鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)HA基因的遗传进化关系,分别对2株鹌鹑源H9N2亚型AIV的HA基因进行了序列测定及遗传进化分析。结果显示,2株鹌鹑H9N2亚型AIV的HA基因核苷酸同源性为97.7%,与参考毒株A/Quail/wuxi/7/2010(H9N2)相比,分别为97.7%、97.0%,均属于h9.4.2进化分支(Y280-like亚群);其推导氨基酸裂解位点均为PSRSSR↓GL,属于低致病性AIV;均存在8个相同的潜在糖基化位点,第313位的糖基化位点正好位于HA蛋白裂解位点附近,可能影响HA的裂解,改变AIV的毒力;受体结合位点第234位均为L,具有结合哺乳动物唾液酸α-2,6受体的特征。结果表明,2株鹌鹑H9N2亚型AIV均为低致病性AIV,但具有感染人的特征,其HA基因均属于大陆H9N2亚型AIV流行谱系的h9.4.2分支。     

一株鸭源H6N6亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及对小鼠的感染性研究

为了解H6N6亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对2015年在广东活禽交易市场分离的一株鸭源AIV DK/GD/S1182/2015(H6N6)进行了全基因组测序、遗传演化分析和对BALB/c小鼠的感染性试验。序列分析显示,该病毒的HA蛋白裂解位点处仅有一个碱性氨基酸,符合低致病性AIV的分子特征;HA蛋白的222V和228S,可以增强病毒对α-2,6唾液酸受体的结合能力。NA蛋白颈部有11个氨基酸的缺失,这将会影响NA的神经氨酸酶活性;该病毒可能是2010年广东H6N6猪流感病毒与2014年广西AIV重组产生。小鼠感染性试验表明,该分离株不需要预先适应就能够在小鼠的肺脏内高效复制,提示该分离株具有感染哺乳动物的潜在风险。本研究对H6亚型AIV监测和相关生物学特性研究具有一定的指导作用。     

25株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传进化分析

为了解山东省不同地区H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异情况,本研究汇集了2012-2013年间从山东省不同地区发病家禽中分离到的25株H9N2亚型AIV,采用RT-PCR技术扩增其HA基因,并进行测序和遗传进化分析。结果显示,25株病毒HA基因的开放阅读框全长为1 683bp,共编码560个氨基酸,其核苷酸和氨基酸同源性分别为94.5%~100.0%和93.8%~100.0%;遗传进化分析表明25株病毒分离株均属于欧亚分支中的Y280-like亚分支;HA蛋白有7~9个潜在糖基化位点,其中218位糖基化位点缺失,145位新增糖基化位点;25株病毒分离株HA蛋白裂解位点均为RSSR↓GIF,符合低致病力AIV的特征。受体结合位点较保守,234位受体结合位点均为L(亮氨酸),仅198位受体结合位点存在变异。分离的病毒株具有与人唾液酸α-2,6受体结合的特性,此类毒株的流行在公共卫生上值得重视。     

广州市活禽市场7株H9N2亚型禽流感病毒全基因进化分析

为了解广州市活禽交易市场H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异特点和流行情况,本研究对2015年5月~2016年6月分离的7株H9N2亚型AIV进行全基因组的遗传进化分析。结果显示,7株H9N2亚型AIV均属于G57基因型,其中有4株分离株的部分内部基因与人源H7N9亚型病毒株基因的核苷酸同源性在99%以上。HA裂解位点未发现碱性氨基酸的替换,HA潜在糖基化位点存在添加或缺失现象,HA蛋白aa155位和aa226位分别为苏氨酸(T)和亮氨酸(L),具有结合人流感病毒受体能力。NA蛋白颈部存在氨基酸缺失,M1蛋白N~(30)D、T~(139)A、T~(215)A,NS1蛋白P~(42)S等突变可能会增加病毒的致病性。结果表明广州市活禽交易市场H9N2亚型AIV的基因型趋于稳定,但其糖基化位点和受体结合位点等呈现多样化,并且H9N2亚型AIV的内部基因能够为其它亚型AIV提供内部片段,其对养殖行业及人类健康产生潜在威胁,仍需对其进行持续的监测。     

一株多重配H13N8亚型禽流感病毒分子进化以及对鸡致病性研究

2018年对宁夏回族自治区沙湖自然保护区进行禽流感病毒(AIV)流行病学调查中,本研究室分离到一株H13N8亚型AIV。为了解这株H13N8亚型AIV生物学特性,本研究对其全基因组进行了测序及遗传演化分析。结果显示,该病毒HA和NA基因分别来自H13N6和H3N8亚型AIV,内部基因来源于H13N8、H6N2、H13N6、H13N2亚型AIV,是一株多亚型重组AIV,其HA蛋白碱性裂解位点氨基酸序列为ISNR↓GLF,为低致病AIV分子标志。关键氨基酸位点分析显示,其M1蛋白具有N30D和T215A的突变,NS1蛋白具有P42S、L98F和I101M的突变,表明其具有增强对哺乳动物致病性的潜在能力。SPF鸡的感染性试验显示,鸡感染该病毒后不能通过喉头或泄殖腔排毒,在感染鸡各脏器均不能有效复制,其感染鸡的潜在风险较小。本研究对禽流感的综合防控具有一定的指导意义。     

2013年云南省禽流感病毒H9N2亚型监测及其血凝素基因序列分析

为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异情况,本研究对2013年云南省16个地区的3 622份家禽临床样品进行AIV的鸡胚分离和RT-PCR检测,其中分离鉴定到97份H9N2亚型AIV分离株,并选取21个分离株进行HA基因测序及系统进化分析,结果表明:21份H9N2亚型AIV分离株的HA基因核苷酸序列同源性为86.0%~99.4%,均属于欧亚分支的类A/Chicken/Bei Jing/1/1994亚分支,而且又进一步划分为Ⅲ-1、Ⅲ-2两个小分支。其中Ⅲ-2分支为云南地区新出现的进化分支。氨基酸比对分析显示,测序的21个HA基因编码蛋白的裂解位点基序均具有低致病性病毒分子特征;与现用疫苗株相比,HA推导氨基酸序列中存在多个氨基酸位点差异;其中,Ⅲ-1与Ⅲ-2分支的AIV的HA氨基酸序列多个位点存在各自特有的点突变(氨基酸替换),这种变异具有一定的进化(亚)分支特异性。此外,HA基因多个受体结合位点氨基酸存在变异,其中234位氨基酸全部变为L,呈现了人流感受体结合特性;部分糖基化位点、抗原表位关键性氨基酸也存在变异。     

2017年上海市活禽市场H9N2亚型禽流感病毒全基因进化分析

为了解上海市活禽市场H9N2亚型禽流感病毒(AIV)分离株的遗传变异情况,本研究对2017年分离的6株H9N2 AIV的8个基因片段进行RT-PCR扩增、克隆和测序,并对获得的HA基因序列进行同源性和关键位点分析.结果显示:6个分离株的HA裂解位点均为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV的分子特征;6株分离株均有8处糖基化位点;受体结合位点除198位和202位有变异外,其它位点均保守,226位氨基酸均为L,228位氨基酸均为G,因此具有与哺乳动物唾液酸α2-6受体结合的特征;所有分离株HA基因核苷酸同源性为93.4%~99.9%,氨基酸同源性为93.8%~99.5%,HA基因进化树显示上述6株分离株均属于近几年在中国鸡群中流行的h9.4.2.5分支;从8个基因片段组成方式分析这6个毒株属于G57基因型.本研究结果为H9N2亚型AIV的防控和疫苗研制提供了科学参考.     

H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白S145N变异株致病性及抗原特性

为确定近年来H9N2亚型禽流感病毒(AIV) HA蛋白S145N点突变对病毒毒力变化和抗原性变异的影响,笔者对从全国不同地区分离的12株H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株和HP疫苗参考株进行了半数鸡胚感染量(EID50)、半数鸡胚致死量(ELD50)、平均鸡胚致死时间(MDT)、雏鸡脑内致病指数(ICPI)、鸡静脉致病指数(IVPI)和8周龄SPF鸡感染排毒试验,并与抗H9N2亚型AIV HP参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性进行测定.结果发现,H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株毒力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长.单抗2A4和F6不能抑制H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞.研究结果表明,H9N2亚型AIV呈现变异趋势,有毒力增强和抗原性变异毒株出现.S145为H9N2亚型AIV HA蛋白的1个抗原位点,是血凝抑制抗体结合的位点,但有该位点漂变导致抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用.这提示该病的防控面临着新的挑战.     

1株鹅源H9N2亚型禽流感病毒分子进化分析及对鹅的致病性

从广东地区鹅群采集的咽喉拭子中分离到1株H9N2亚型禽流感病毒(AIV)并命名为A/Goose/Guangdong/A11/2016(H9N2)(GS/A11)。采用RT-PCR方法扩增出病毒的全基因片段,并进行序列比较及遗传进化分析。推导氨基酸序列分析表明,GS/A11的HA蛋白裂解位点序列为333PSRSS↓GL340,无连续碱性氨基酸,符合低致病性禽流感特征;GS/A11上的Q226L突变提示结合人α-2,6唾液酸受体的能力增加;M2蛋白中出现了与金刚烷抗性相关的S31N突变。基因遗传进化树分析显示,分离株病毒为三元重组基因型。为了解H9N2亚型对鹅的致病性,以106×EID50剂量经静脉注射6周非免疫鹅,攻毒显示,攻毒鹅无明显临床症状,仅表现为局部器官感染,可经喉气管和泄殖腔排毒。研究提示,该株H9N2亚型AIV对鹅无明显致病力,但感染后可持续排毒。该现象为流感病毒在鹅及其他禽类中流行并发生基因重组提供了机会,故应加强鹅H9N2亚型AIV的检测及分子遗传的演变监控。     

6株H9N2亚型禽流感病毒厦门分离株全基因序列测定与分析

为了解分离自厦门市养殖场、活禽交易市场和活禽屠宰场的H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza viruse,AIV)的遗传变异特征,本研究对分离到的6株H9N2亚型AIV进行全基因组序列测定、遗传进化分析和特殊位点的氨基酸分析。结果显示:6株分离株的HA裂解位点均符合低致病性禽流感病毒特征,HA受体结合位点尤其是234位氨基酸突变为L,表现出人流感病毒受体结合特性;NA存在颈部9个核苷酸缺失的高致病性分子特征;内部基因NS1基因发生P42S突变,M1基因发生N30D、T215A突变,M2基因发生S31N的突变,PB1-F2基因发生N66S突变,提示当前分离株已出现耐药性、致病性增强的变化。8个基因片段均属于欧亚谱系,内部基因与H7N9、H10N8、H10N6、H5N6亚型亲缘关系密切。本研究结果为本地区禽流感生物学特性研究和防控提供科学依据。     

H6亚型禽流感病毒厦门分离株全基因序列分析

为了解2017年分离自厦门市某活禽屠宰场的H6N6亚型禽流感病毒(AIV)的遗传变异特征,本研究对分离到的4株H6N6亚型AIV进行全基因组序列测定、遗传进化分析和特殊位点的氨基酸分析。结果显示:4株分离株的HA裂解位点和受体结合位点均符合低致病性AIV特征,但其中1株分离株NA存在颈部11个氨基酸的缺失。NS1发生P42S突变、M1发生N30D、T215A突变、M2发生V27I的突变。8个基因节段均属于欧亚谱系,内部基因与H5N1、H5N6、H6N1及H6N2 AIV亲缘关系密切。本研究结果表明,4株H6N6分离株均表现为低致病性AIV特征,但也存在与耐药性、毒力增强等相关的突变,基因来源呈现多样性。本研究结果为本地区AIV生物学特性研究及其疾病防控提供科学依据。     

14株H9N2亚型禽流感病毒分离株的HA和NA基因序列分析

为了解浙江省H9N2亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的分子特征和遗传变异情况，本试验对2012—2021年分离到的14株H9N2亚型AIV分离株进行HA和NA基因序列测定和分析。结果显示：14株分离株的HA和NA基因均属于Y280分支，HA核苷酸同源性为91.5%～99.4%,NA核苷酸同源性为89.0%～98.7%,其与疫苗株CK/SS/94、CK/F/98、CK/6/96和CK/1/00的HA核苷酸同源性为86.0%～91.1%。14株分离株HA蛋白裂解位点氨基酸组成均为RSSR↓GLF;受体结合位点主要表现为K141N、A142T、T155N、H183N和V190T突变，其中第226位和第228位全部为L和G,可与α-2,6唾液酸受体结合，具有感染人的特性；蛋白潜在糖基化位点均为6个，主要变异表现在第200～202位1个位点缺失和第295～297位1个位点增加；抗原相关位点主要表现为G82E、S137D、D145G、N159G、A160D、T192R和N193D突变，此外，有5株出现D160N突变。14株分离株NA蛋白存在6个潜在糖基化位点，其中1株...     

2017—2020年中国部分地区H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传进化和分子特征分析

为了解当前国内H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的遗传进化和分子特征变化,试验在2017—2020年间,从国内多个地区的发病鸡场分离获得了39株H9N2亚型AIV,并对其HA基因进行了测序和分析。结果显示：39个分离株的HA基因同源性较高,在进化关系上均属于目前的流行分支h9.4.2.5,与早期的分离株遗传距离较远;近年随着疫苗株的更新,H9N2亚型AI疫苗株和流行株之间的同源性处于上升趋势;39个分离株的HA蛋白裂解位点附近第2位氨基酸均发生A→S的突变,受体结合位点第191位氨基酸出现新变化（N→S/H）,第198位氨基酸呈现多样性（T/V/A）,第234位氨基酸均由Q突变为L,由于第220位氨基酸、第315位氨基酸分别发生T→V/I和P→S的突变,从而在第218～220位和第313～315位分别缺失了和增加了一个潜在N-糖基化位点。综上所述,近几年H9N2亚型AIV在流行过程中遗传进化相对稳定,但在一定程度上仍然发生了一些适应性突变,有毒力增强的可能性,并且增加了感染哺乳动物甚至是人类的风险。     

吉林省长春市城乡活禽市场H9N2亚型禽流感病毒的检测与分子遗传进化分析

H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)通过为其他流感病毒提供内部基因或直接跨越种间屏障感染人，而活禽市场是H9N2亚型AIV传播的主要传播途径之一。为了解吉林省长春地区城乡活禽市场H9N2亚型AIV流行特点和趋势，对2021年9月至2023年4月在4个城乡活禽市场分离到3株代表性H9N2亚型AIV进行了分子遗传进化分析。结果显示3株毒株HA蛋白裂解位点均为PSKSSR↓GLF,其受体结合位点的第226位氨基酸由Q突变为L,可与α,2-6唾液酸受体结合，具有感染人的特性。分子遗传进化分析显示3株毒株的HA基因归属于BJ-94谱系中h9.4.2.5亚分支；NA基因归属Y280谱系；PB2、M基因均属于G1谱系；剩余内部基因均属于F-98谱系。研究结论丰富当前国内H9N2亚型AIV的流行病学研究，提示需加强病毒变异监控和新疫苗研发。     

2011～2014年广西H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传变异分析

为了解H9N2亚型禽流感病毒广西分离株的遗传变异情况,采用RT-PCR技术扩增了10株从2011~2014年广西不同地区分离的H9N2亚型AIV的HA基因片段,并对所得序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,10个毒株的HA基因全长1 683 bp,编码560个氨基酸;10株分离株的裂解位点均为PSRSSR↓GLF,为典型低致病性禽流感病毒的特征序列。10株分离株234位氨基酸均为L,具有与哺乳动物唾液酸α-2,6受体结合的特征。分离株与参考毒株HA基因的核苷酸与氨基酸同源性均较高,分别为79.3%~98.7%和85.0%~98.6%,均属欧亚种系,其中与A/Duck/Hong Kong/Y280/97亲源关系较近。研究结果从分子水平上证明H9N2亚型禽流感病毒近年来未发生较大变异。     

10株H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的序列分析

为了解中国目前H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)血凝素(HA)基因的遗传变异情况,对中国不同地区分离的10株H9N2亚型AIV的HA基因进行扩增、克隆和测序,并对所获得的HA全序列进行同源性和遗传进化分析。结果表明,10个分离株的裂解位点均为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV的分子特征;10个分离株有7~9个潜在糖基化位点,由于基因突变有些HA基因出现了新的糖基化位点;与参考株相比,发现了4个抗原表位的突变,这些表位的突变可能引起病毒致病性的改变;受体结合位点除198位有变异外,其他位点均较保守;6株病毒234位氨基酸均为L,具有与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特征;10个分离株HA基因与国内疫苗株的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为90.4%~99.2%和92.2%~98.7%;10个分离株同属于欧亚谱系中的A/duck/Hong Kong/Y280/97群,但差异显著,为此本试验又将其分为4个不同的亚群。人工感染排毒试验结果表明,BJ15和NJ17分离株在鸡体内具有较强的复制能力,排毒周期较长且排毒量也较大,而S145N的漂变导致在145-147位氨基酸多出1个糖基化位点NGT,可能是分离株复制能力增强的原因。     

2011～2014年安徽省发病鸡群H9亚型禽流感病毒HA基因的遗传进化分析

为了解安徽省发病鸡群H9N2亚型禽流感病毒(Avian infl uenza virus,AIV)的变异情况,本研究对2011~2014年安徽省发病鸡群的368份组织样品进行AIV的鸡胚分离和RT-PCR检测,分离鉴定到17株H9N2 AIV。对这17株进行HA基因测序及系统进化分析,结果表明:17株HA基因核苷酸序列的相似性为88.5%~99.6%,属于A/Duck/Hong Kong/Y280/1997病毒亚系。氨基酸比对分析显示,裂解位点326~329位氨基酸为典型的低致病性AIV特征性序列。与A/Chicken/Shanghai/F/98疫苗株相比,17株HA蛋白受体结合位点的226位均为亮氨酸(L),呈现了人流感受体结合特性;5株200位的点突变(T→I),导致了200位潜在糖基化位点的缺失。可见安徽省分离的H9N2 AIV大部分毒株基因序列已发生变异,目前使用的疫苗能否为禽群提供足够的保护力还需要作进一步的研究。     

H3亚型禽流感病毒的分离与鉴定

为了解广西H3亚型禽流感病毒在家禽中的流行情况,对2009~2014年采集的活禽棉拭子样品进行了分离与初步鉴定,共分离纯化出14株H3亚型AIV,通过对HA和NA基因克隆、序列测定,进一步确定11株为H3N2亚型,2株为H3N6亚型,1株为H3N8亚型AIV。对分离株进行鸡胚半数致死量、半数感染量(EID50)的测定与受体亲和性试验,结果显示14株分离株均具有优先结合SA唾液酸α-2,3-Gal受体的能力,属于禽源流感病毒毒株,不具备感染人的潜能。