抗禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体的病毒中和作用

通过血凝抑制(HI)和鸡胚中和试验(VN)证实，本实验室制备的抗禽流感H9M2单抗11A5和11B2株可特异性地抑制H9亚型禽流感病毒的血凝特性，而与禽流感H5和H7亚型以及其他具有血凝性感染禽类的病毒(如新城疫等)不反应。两株单抗腹水HI效价均达到15Log2。中和试验表明：上述两株单抗均可有效抑制H9N2病毒在SPF鸡胚中的增殖，使病毒失去血凝活性．测得11A5和11B2株腹水对H9N2禽流感病毒的半数保护量分别为10^-3.35和10^-4.58。该单抗的研制成功对于进一步建立快速鉴别诊断禽流感H9亚型病毒具有重要意义。     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆与表达

根据已知H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因序列,设计、合成PCR引物。自H9N2亚型禽流感病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶扩增血凝素基因,采用Invitrogen定向表达系统进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组血凝素,分子质量约75 ku。采用阳性血清经免疫印迹及ELISA分析重组血凝素的免疫反应性,结果表明,重组血凝素能与H9N2亚型病毒抗血清发生特异性结合,具有良好的免疫反应性。     

高效表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建及免疫效力试验

将禽流感病毒血凝素 H9A基因克隆入插入载体 p FG11S中 ,通过酶切鉴定获得了正向转移载体 p FG11SHA;将其与禽痘病毒疫苗株 (w FPV)共转染鸡成纤维细胞 (CEF) ,通过蓝白斑筛选纯化得到重组病毒 r FPV- Ps- HA;以间接免疫荧光法证实 HA基因得到了表达。将该病毒经颈部皮下免疫 1日龄 SPF鸡 ,免疫后 15 d以 H9亚型禽流感病毒 F株翅静脉攻毒 ,攻毒后第 5天采集泄殖腔棉拭子样品进行病毒分离。将此重组病毒与以痘苗病毒 P7.5启动子表达相同基因的重组病毒 r FPV- P7.5 - HA作比较 ,结果表明 ,r FPV- Ps- HA相对于 r FPV- P7.5 - HA明显抑制了病毒的排出 ;攻毒后第 2、5、7、9、11天分别对 r FPV- Ps- HA、油乳剂灭活苗免疫鸡进行泄殖腔、气管排毒规律的检测 ,发现疫苗组均能很好地抑制排毒 ,攻毒对照组泄殖腔的排毒率明显高于气管排毒率     

两株表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力

将H9亚型禽流感病毒（AIV）HA基因插入到具有新复制非必需区的通用型质粒载体pP12LS中构建转移载体pP12LSH9A,再分别转染预先感染不同毒力的2种鸡痘病毒（FPV）282E4株和LP株的鸡胚成纤维细胞,经系列蓝斑筛选纯化,获得了2种重组鸡痘病毒（rFPV）,分别命名为rFPV282—12LSH9A和rFPVLP-12LSH9A。将这2株rFPV在SPF鸡和带有高水平抗H9亚型AIV母源抗体的商品鸡上分别进行免疫效力试验。结果：rFPV282—12LSH9A和rFPVLP-12LSH9A在SPF鸡上的排毒保护率均为100％（10／10）,在商品鸡上的排毒保护率分别为88％（23／26）和92％（24／26）。结果表明获得了2株在带有抗H9亚型AIV高水平母源抗体的商品鸡上免疫效力较好的rFPV。     

H9亚型禽流感病毒血凝素特异性单因子血清制备

为制备特异性的H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清,本研究分别将6株不同亚群的H9亚型AIV的血凝素(HA)基因以鸡偏嗜的密码子进行优化,经全基因合成插入高效真核表达载体pCAGGS中,构建的真核重组质粒转染293T细胞进行瞬时表达,间接免疫荧光试验结果表明,重组质粒中的HA目的基因获得表达.将重组质粒以200μg/只的剂量免疫1月龄SPF鸡,6周后采血分离血清.交叉微量血凝抑制试验结果表明,血凝抑制效价可达8 long2～12 log2,灵敏度高,与其他AIV亚型抗原无交叉反应,型特异性强.     

H9N2亚型禽流感病毒NS1基因缺失减毒活疫苗候选株对蛋鸡的免疫效力评价

为评价H9N2亚型禽流感病毒(AIV)NS1基因缺失减毒活疫苗候选株r TX-NS1-128对蛋鸡的免疫效力,本研究对蛋鸡H9N2亚型AIV母源抗体半衰期、疫苗适宜免疫时间、抗体免疫保护临界值以及免疫鸡抗体消长规律等进行研究。结果显示,雏鸡H9亚型AIV母源血凝抑制(HI)抗体半衰期为3.29 d。雏鸡母源抗体水平对疫苗的免疫效果有较大的影响,以母源HI抗体滴度约为4 log2时免疫为宜。少数HI抗体滴度为4 log2~6 log2的免疫鸡攻毒后可在5 d或3 d内从咽喉短暂排毒,HI抗体滴度为4 log2、5 log2、6 log2和≥7 log2时攻毒保护率分别为80%、90%、90%和100%,建议该疫苗的抗体免疫保护临界值为5 log2。鸡一次免疫后平均HI抗体滴度在5 log2以上可持续9周左右。本研究为H9N2亚型禽流感新型减毒活疫苗的开发和应用提供依据。     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组新城疫病毒的拯救

对现地分离的4株H9亚型禽流感病毒HA基因进行序列测定,选取其中1株在新城疫病毒 La Sota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的基础上,构建了表达H9亚型禽流感病毒野生型HA基因的重组新城疫病毒基因组cDNA克隆,经间接免疫荧光和RT-PCR鉴定,结果表明:拯救重组病毒为rL-H9HA;重组病毒MDT≥168 h,ICPI和IVPI均为0,与亲本疫苗株La Sota具有相似的生长特性;重组病毒保持了La Sota弱毒疫苗亲本毒株对鸡胚良好的高滴度生长适应和低致病特性,具有作为同时预防H9亚型禽流感和新城疫的双价苗的应用前景.     

表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒在水禽的免疫效力

利用表达 H5亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒 ( r FPV- HA)和油乳剂全病毒灭活疫苗分别接种商品鹅 ,评价疫苗在水禽的免疫保护作用。结果发现 ,免疫后 2 1 d,r FPV- HA免疫组 HI抗体检测为阴性 ,灭活疫苗免疫组HI抗体阳性率为 70 % ;用 H5亚型禽流感病毒攻击后 ,与阴性对照组相比 ,r FPV - HA免疫组鹅的口腔和泄殖腔排毒率降低 ,病理变化减轻 ,感染鹅易康复 ,保护率为 80 % ,总体保护效力达到灭活疫苗水平。结果表明 r FPV - HA免疫家鹅可诱导良好保护 ,显示出了良好的应用前景     

H5亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及表达

研究以RT-PCR方法从H5N1亚型禽流感病毒A/DKZJ/12/00(H5N1)中获得禽流感病毒HA部分基因,将目的基因定向克隆到原核表达载体pET-32a,将测序和酶切验证正确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达。结果表明该蛋白得到了可溶性的表达,表达蛋白的分子质量为25ku;Western-blot分析结果表明,该蛋白可以与禽流感H5阳性血清反应(禽流感的单克隆抗体所识别),检测HA的抗体时具有良好的免疫原性。     

重组H5亚型禽流感病毒三价灭活疫苗免疫效果的评价

为了评价重组H5亚型禽流感病毒三价灭活疫苗的免疫效果,在2016年7月至2017年8月期间,对免疫重组H5亚型禽流感病毒三价灭活疫苗(H5N1,Re-6株+Re-7株+Re-8株)的家禽采集了1 999份血清样品,采用血凝与血凝抑制方法进行检测,结果为H5亚型禽流感病毒Re-6株免疫合格率为86.84%,H5亚型禽流感病毒Re-7株免疫合格率71.44%,H5亚型禽流感病毒Re-8株免疫合格率为67.78%。结果表明,免疫重组H5亚型禽流感病毒三价灭活疫苗后,不同毒株的抗体、不同种类的家禽、不同免疫次数的抗体水平均有差异。     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因序列的初步分析

禽流行性感冒 ,简称禽流感 (ＡｖｉａｎＩｎｆｌｕｅｎｚａ ,ＡＩ)是由正黏病毒科、流感病毒属、Ａ型流感病毒所引起的禽类的感染和/或疾病综合症 ,被国际兽疫局确定为Ｉ类烈性传染病 ,并被列入国际生物武器公约动物传染病名单。ＯＩＥ根据对家禽所造成的疾病程度 ,将禽流感划分为高致病禽流感ＨＰＡＩ和低致病禽流感ＬＰＡＩ。Ｈ9Ｎ2亚型禽流感病毒 ,属低致病力禽流感病毒。 1994～ 1999年期间 ,该亚型病毒在全球呈广泛流行趋势 ,且危害日趋严重。中国在 1994年 ,由陈伯伦等[1] 人报道 ,在广东某鸡场的蛋鸡中分离到我国第 1株Ｈ9Ｎ2亚型禽…     

禽流感病毒H9亚型血凝素特异性单克隆抗体的制备和鉴定

以常规方法纯化H9亚型禽流感病毒，制备了两株分泌抗禽流感病毒H9亚型血凝素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞11A5和1182，其上清ELISA效价均为1：10^4，腹水效价为1：10^7和1：10^6，HI效价上清分别为8、7log2，腹水效价均为15log2。采用HI方法证明其对禽流感病毒H9亚型的特异性，通过Western blot方法证明两株单抗都针对H9亚型禽流感病毒HA1蛋白。     

禽流感病毒H7亚型血凝素单克隆抗体的制备

本实验用核酸疫苗免疫BALB/C小鼠.取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经三次克隆和间接ELISA筛选,获得ⅠA3、ⅠB3、ⅠC4和ⅠF7四株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株.通过间接ELISA测定,单抗效价范围是:细胞培养上清1:160～1:640,腹水为1:5×104～1:4×105;经ELISA法测定,四种单克隆抗体仅与试验的H7病毒株反应,而不能与禽流感H5亚型病毒、禽流感H9亚型病毒等反应;单抗的亚类鉴定结果表明,ⅠA3、Ⅰ B3、ⅠC4分泌的抗体为IgG1亚类,ⅠF7分泌的抗体为IgG2b亚类.     

石家庄地区H9亚型禽流感HI抗体免疫效力测定

H9亚型禽流感近十几年来在我国广泛存在，仍是当前禽流感流行的主型。新的研究表明，H9亚型部分流行株的致病力明显变异，尤其对肉仔鸡．死亡率可达到30％以上；对产蛋高峰期的蛋鸡，其产蛋下降幅度大，恢复困难，死淘率也呈上升趋势，给广大养殖户造成了重大经济损失。     

禽流感H5亚型病毒血凝素基因的表达和抗原性分析

参考已发表的Guangdong/96/1(H5N1)基因序列设计引物,用鸡胚扩增中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室保存的病毒,收集尿囊液,提取病毒RNA,经RT-PCR扩增HA基因,将PCR产物平端克隆到pMD18-T中,经酶切、PCR及测序鉴定后,定向亚克隆到pET-30a表达载体中。重组子经酶切和测序鉴定为正确后,用IPTG诱导表达,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层扫描分析重组蛋白的表达情况。重组蛋白r5HA经Ni-NTA His.Bind Resins纯化,并复性,用Western Blotting分析重组蛋白的抗原性。结果表明:表达产物大小约为65 ku,主要存在于包涵体中,表达量约占总蛋白的30%;同时,表达的重组蛋白具有较好的抗原性和特异性,可以用作检测H5亚型禽流感病毒抗血清的捕获抗原。     

H7亚型禽流感病毒灭活疫苗安全性和免疫效力评估

按照《中国兽药典》要求的方法,对3批制备的H7亚型禽流感灭活疫苗的物理性状、安全性和免疫效力进行评估。结果:疫苗物理性状稳定;大剂量和单剂量重复免疫SPF鸡后未出现局部或全身不良反应;免疫后21 d,3批疫苗免疫鸡HI抗体效价平均值分别为8.5 log2、8.4 log2、8.5 log2;以H7N9亚型禽流感病毒株106EID50剂量攻击,14 d观察期内,对照鸡全部排毒,免疫鸡均不排毒,说明疫苗免疫后能阻止病毒的排泄。结果表明:制备的H7亚型禽流感灭活疫苗安全、有效。     

H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的真核表达及抗原性的鉴定

目的:通过哺乳动物细胞表达出禽源H7N9流感表面HA蛋白,并鉴定其抗原性。方法:通过引物设计,利用融合PCR方法扩增得到H7N9禽流感HA基因,以p CAGGS为表达载体构建重组质粒p CAGGS-H7-thrombin。测序正确后将重组质粒转染293T细胞。经72 h后收获上清,通过镍柱和凝胶层析柱纯化后得到目的蛋白。Western blot和ELISA结果鉴定纯化的H7蛋白的抗原性。结果:293T细胞表达的上清经HisTrapTMHP纯化后过Superdex 200 10/300 GL分子筛,在洗脱体积达到11 m L左右出峰,由出峰位置判断其为H7三聚体。Western blot检测在60 ku左右有一条阳性条带,ELISA检测其对抗H7N9小鼠阳性血清有很高的反应值。试验成功表达禽流感病毒H7N9的H7蛋白,并且针对H7N9的阳性血清有较高的灵敏性,为进一步研究H7N9亚单位疫苗奠定了基础。     

禽流感病毒H7亚型血凝素基因的原核表达及鉴定

参考已发表的禽流感病毒(AIV)H7亚型血凝素(HA)基因序列设计引物，经RT-PCR扩增了AIV-H7亚型的HA1基因片段，再将该片段定向插入到原核表达载体pGEX-4T-2中，转化大肠埃希氏菌。重组表达栽体经酶切和测序鉴定后，用IPTG诱导表达。用Western-blotting和ELISA试验鉴定表达产物的抗原性。结果表明，融合表达蛋白能与AIV H7N1、H7N2、H7N7和H1N1亚型标准抗血清反应，而与H5N1、H9N2等其他13个亚型的抗血清无交叉反应。     

Clade7.2 H5N1亚型禽流感重组病毒疫苗株的构建及免疫效力评价

致病性禽流感病毒(AIV)编码HA抗原基因的不断进化,进而出现抗原性变异是导致原有疫苗无法提供完全免疫保护的主要原因,因此需要构建并更新疫苗株。本研究在系统分析AIV病毒抗原性基础上,采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以clade7.2 H5亚型A/chicken/He Bei BD/SC007/2012(CK/BD/2012)的c DNA为模板经SOE-PCR扩增,将高致病性AIV的HA基因编码裂解位点序列336PQIEGRRRKR348突变为低致病性特征的336PQRETR343序列,以A/chicken/Shanxi/2/2006(CK/SX/2/2006)作为NA基因的供体,构建clade7.2 AIV疫苗候选株r PR8-BD/2012,并对其进行生物学特性和免疫原性评估。结果显示,该疫苗候选株对鸡胚无致病性,能够在鸡胚中高滴度生长(9 log2),静脉内接种致病指数(IVPI)为0,对雏鸡无致病性。将r PR8-CK/BD/2012作为种毒,按照常规方法制备灭活疫苗,免疫4周龄SPF雏鸡,免疫3周后对亲本强毒株的HI平均抗体效价达7.2 log2;采用亲本强毒A/chicken/He Bei BD/SC007/2012和同分支异源强毒株A/chicken/He Bei/SD001/2013以105 EID50剂量攻击,免疫组均能够得到完全保护。以上结果表明r PR8-CK/BD/2012疫苗候选株具有鸡胚适应性、生物安全性和良好的免疫原性,可以作为有效防控clade7.2 H5N1 AIV的疫苗株。     

H9N2亚型禽流感病毒细胞灭活疫苗的免疫效果评价

由于经济和技术因素的制约,尚未有成功的禽流感细胞疫苗产品上市.为此,本研究在细胞扩增而来的含有H9亚型禽流感病毒(AIV)HA和NA基因的SH441HANAPR8(NS mutant)重组病毒里加入终浓度为0.1％的甲醛进行灭活.结果显示,37℃条件下灭活24 h的效果最佳.灭活好的H9 AIV SH441HANAPR8(NS mutant)与佐剂Montanide ISA 70VG乳化制备成灭活苗,以0.05、0.1、0.2、0.3 mL/只的剂量,分别胸部肌肉注射免疫3周龄的SPF鸡,并于免疫后21d静脉感染A/Chicken/Shanghai/441/2009 (H9N2) AIV.结果显示,该疫苗的最小免疫剂量为0.2 mL.此外,研究还发现,当HI抗体效价≥25时,疫苗对鸡只的攻毒保护率达到100％.