重组产气荚膜梭菌plc基因植物乳酸杆菌的免疫效果评价

为了评估表达产气荚膜梭菌α毒素plc基因的重组植物乳酸杆菌口服活菌疫苗的免疫保护效果,分别进行了重组活菌疫苗的免疫和产气荚膜梭菌攻菌试验。免疫组雏鸡分为3组,于7~28 d分别连续免疫p SIP409空载体植物乳酸杆菌、pSIP409-plc重组植物乳酸杆菌和灭菌PBS;攻菌组雏鸡免疫方法同上,于43~47 d连续口服产气荚膜梭菌(设置PBS免疫组不攻菌只口服等量PBS对照)。通过病理组织学检查疫苗对雏鸡组织器官的损害作用; ELISA检测抗体动态变化、攻菌后细菌分离计数、剖检肠道病变评分、雏鸡体重变化和免疫器官发育情况来整体评价疫苗的免疫水平。结果显示,与对照组相比重组疫苗的免疫没有对雏鸡组织器官产生损害作用,plc特异性抗体IgG和s IgA水平检测显示,抗体水平随日龄增长呈现上升趋势,且与未免疫组有显著和极显著差异(P 0.05,P 0. 01);攻菌后免疫组雏鸡各项指标在短暂下降后很快升高,且明显高于未免疫组雏鸡。攻菌组各项试验也证明,我们的重组口服活菌疫苗对产气荚膜梭菌攻击雏鸡起到很好的保护作用。     

产气荚膜梭菌NetB毒素基因重组植物乳酸杆菌疫苗免疫保护性研究

为了评估表达产气荚膜梭菌NetB毒素的重组植物乳酸杆菌口服活菌疫苗对鸡的免疫保护效果,分别进行了重组活菌疫苗的免疫和产气荚膜梭菌攻菌试验。免疫组雏鸡分为3组,于7~28日龄分别连续免疫p SIP409空载体植物乳酸杆菌、p SIP409-NetB重组植物乳酸杆菌和灭菌PBS;攻菌组雏鸡免疫方法同上,于43~47日龄连续口服产气荚膜梭菌(设置PBS免疫对照组和不攻菌只口服等量PBS对照组)。通过采用ELISA检测抗体动态变化,观察雏鸡体重变化和免疫器官发育情况以评价疫苗的免疫效果。结果显示,NetB组特异性抗体Ig G和s Ig A水平随日龄增长呈现上升趋势,且与未免疫对照组存在显著或极显著差异(P0.05或P0.01);NetB攻菌组各项指标在短暂下降后很快升高,且明显高于未免疫对照组雏鸡(P0.01)。NetB组周增重14日龄后均高于其他组,且35日龄开始与其他组差异极显著(P0.01);攻菌组体重变化总趋势是NetB攻菌组最高,其次是空载体攻菌组(P0.05),PBS攻菌组最低(P0.01)。免疫组在免疫结束时胸腺和脾脏指数呈明显上升趋势,NetB组的这两项指数分别在56日龄和49日龄达到最高,法氏囊指数在28日龄下降,随后稳步上升;虽然攻菌后各免疫器官指数上升趋势变缓,但NetB攻菌组的各项指数在各时间点均与其他组差异极显著(P0.01)。表明重组口服活菌疫苗对产气荚膜梭菌攻击雏鸡起到很好的保护作用,所构建的重组疫苗安全有效,结果为重组植物乳酸杆菌表达系统应用于口服疫苗提供了理论依据。     

产气荚膜梭菌NetB毒素基因重组植物乳酸杆菌的构建

选择产气荚膜梭菌坏死性肠炎毒素B(NetB)为抗原,构建产气荚膜梭菌NetB毒素基因重组植物乳酸杆菌,利用植物乳酸杆菌穿梭载体pSIP409构建重组质粒pSIP409-NetB,经双酶切鉴定和序列测定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行SppIP诱导表达。Western blot证明重组蛋白表达成功,并且主要以包涵体形式存在,NetB重组蛋白相对分子质量为36 ku。重组质粒pSIP409-NetB电转化植物乳酸杆菌NC8细胞,PCR和双酶切鉴定正确后进行SppIP诱导表达。Western Blot和间接免疫荧光鉴定表明构建的重组植物乳酸杆菌具有诱导分泌NetB蛋白的能力,可作为黏膜免疫的候选抗原。     

重组产气荚膜梭菌plc毒素基因植物乳酸杆菌的构建

依据乳酸菌的肠道益生作用,选择产气荚膜梭菌关键致病因子α毒素/磷脂酶C为抗原,构建产气荚膜梭菌α毒素去除信号肽的plc基因片段重组植物乳杆菌,利用植物乳酸菌穿梭载体pSIP409构建重组质粒pSIP409-plc,经双酶切鉴定和序列测定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行SppIP诱导表达。Western Blot证明重组蛋白表达成功,并且主要以包涵体形式存在,plc重组蛋白相对分子质量分别为40 kDa。重组质粒pSIP409-plc分别电转化植物乳杆菌NC8细胞,PCR和双酶切鉴定正确后进行SppIP诱导表达。Western Blot和间接免疫荧光鉴定表明,构建的重组植物乳酸杆菌具有诱导分泌plc蛋白的能力,可作为黏膜免疫的候选抗原。     

G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备及其免疫保护效果的评价

为研制G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗,本研究将G型产气荚膜梭菌菌株(7a9-2、D3-2)增菌培养后接种产毒培养基高效产毒,除菌后获得外毒素,经粗提后进行SDS-PAGE检测。结果显示：制备的G型产气荚膜梭菌外毒素含有α、NetB两种毒素蛋白。将两株G型菌株所产外毒素经2倍倍比稀释后经腹腔注射小鼠,检测外毒素的致病性,结果显示7a9-2菌株所产外毒素毒力较强,可作为疫苗候选株。因此选择7a9-2菌株制备外毒素,并经甲醛灭活后制备G型产气荚膜梭菌类毒素疫苗,经检验合格后免疫三黄鸡。免疫后5周内,每周随机选取10只鸡采血分离血清,采用ELISA方法检测鸡血清中的抗体效价。结果显示,免疫组鸡血清稀释100倍后,一免组鸡的抗体效价最高可达6.83log2,二免组鸡抗体效价最高可达8.34log2,免疫后鸡体内可产生较高水平的抗G型产气荚膜梭菌的抗体。免疫后实验鸡通过口服鸡球虫卵囊和G型产气荚膜梭菌菌液进行攻毒试验,结果显示,攻毒后免疫组鸡肠道病变程度和发病率均显著低于对照组(P<0.05)。在整个实验过程中观察各组鸡的生长情况,计算鸡平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F...     

商品肉鸡梭菌性肠炎的试验诊断

为了对商品肉鸡梭菌性肠炎的发病情况进行调查,本试验对收集的不同养殖模式的具有肠炎症状的肉鸡肠道内容物进行了产气荚膜梭菌的分离鉴定、活菌计数、菌株毒素类型鉴定以及动物试验,并对其中的43株分离株进行了药敏试验,同时也对不同宿主来源的14株产气荚膜梭菌进行了16S rRNA基因的同源性分析。结果显示,患病鸡肠道分离到的产气荚膜梭菌均为A型且肠道内容物活菌数量达10~6CFU/g以上;动物试验结果显示,攻毒菌液上清的小鼠在观察期内死亡并表现出明显的坏死性肠炎症状;药敏试验结果表明,不同来源菌株耐药性存在差异;同源性分析发现,不同宿主来源的14株产气荚膜梭菌无明显宿主特异性。本试验结果可为临床肉鸡梭菌性肠炎的了解及防治提供一定的参考价值。     

携带NDV HN基因疫苗的重组减毒鸡白痢沙门菌口服免疫原性研究

为研究携带新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)基因疫苗的重组减毒鸡白痢沙门菌的口服免疫原性,将携带NDV HN基因的重组质粒pcDNA3-HN电转化减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpC79-13,构建重组疫苗菌株ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)。将重组菌株ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)以1×10~9 CFU·只-1口服免疫7日龄雏鸡,同时设PBS、ΔcrpC79-13(pcDNA3)和NDVⅣ系疫苗免疫对照,于免疫后7、14、21、28、35d测定免疫雏鸡诱导的抗NDV的HI抗体、鸡白痢沙门菌IgG抗体和肠道黏膜IgA抗体动态水平,同时测定免疫雏鸡的外周血淋巴细胞增殖水平并进行攻毒试验。结果表明,成功获得携带NDV HN基因疫苗的重组菌株Δcrp C79-13(pcDNA3-HN);在免疫后14~35d,可诱导产生抗NDV的HI抗体,且在免疫后21d时达到最高值;可诱导产生抗鸡白痢沙门菌的IgG抗体,且在免疫后28d达到最高值;Δcrp(C79-13pcDNA3-HN)组肠道黏膜IgA抗体含量最高值略高于Δcrp C79-13(pcDNA3)组,但差异不显著(P0.05)。在免疫28d以后,Δcrp(C79-13pcDNA3-HN)组外周血淋巴细胞刺激指数极显著高于PBS对照组(P0.01),显著高于ΔcrpC79-13(pCDNA3)组(P0.05)。用103EID50 NDV F48E9株攻毒,保护率达67%(10/15),用108 CFU鸡白痢沙门菌C79-13攻毒,保护率为100%。本研究结果表明重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)具有良好的口服免疫原性。     

产气荚膜梭菌噬菌体及乳酸杆菌联用改善肉鸡生长性能和调节肠道菌群功能研究

【目的】明确产气荚膜梭菌噬菌体及乳酸杆菌联用对肉鸡的生产性能、肠道形态结构及微生物多样性的影响,为禽健康养殖中产气荚膜梭菌的感染提供关键防控技术。【方法】选取240只1日龄青脚麻鸡,随机分为4组：HN02噬菌体组、乳酸杆菌组、HN02噬菌体+乳酸杆菌联用组及空白对照组,每组6个重复,每个重复10只鸡,试验期14 d,期间连续每天饮用噬菌体和/或乳酸杆菌。统计平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)及料重比(F/G),计算脏器系数。取盲肠内容物测定产气荚膜梭菌数量,并对16S rRNA基因进行扩增,分析肠道微生物群落结构和多样性。【结果】与空白对照组相比,HN02噬菌体+乳酸杆菌联用能显著提高雏鸡平均日增重及绒毛高度/隐窝深度(P<0.05),显著降低雏鸡料重比和空肠、回肠隐窝深度(P<0.05),且处理14 d的抑菌效果最佳,产气荚膜梭菌的数量减少1.17 lg CFU/mL。微生物多样性显示,HN02噬菌体+乳酸杆菌联用饮水后雏鸡盲肠内容物菌群中变形菌门、厚壁菌门、放线菌门及拟杆菌门相对丰度较高,属水平中乳杆菌属相对丰度较高,与空白对照组相比,HN02噬菌体+乳酸杆...     

D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的研制及保护效果的评价

为研制更有效的预防家畜D型产气荚膜梭菌肠毒血症的疫苗,本研究采用D型产气荚膜梭菌标准菌株增菌培养,经自制产毒培养基高效产毒,制备成D型产气荚膜梭菌氢氧化铝类毒素疫苗和白油类毒素疫苗。通过不同剂量疫苗免疫绵羊的攻毒保护试验和免疫绵羊的抗体水平监测,评估疫苗的免疫保护效果。结果表明:D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗安全性良好,氢氧化铝苗和白油苗对绵羊有效免疫剂量均为4 m L(外毒素对小鼠半数致死量为2-6.4/m L),绵羊接种一个有效免疫剂量后,氢氧化铝疫苗免疫保护周期为6周以上;白油疫苗免疫保护周期为21周以上。本研究结果表明两种疫苗均具有良好的应用前景。     

产气荚膜梭菌α毒素C末端与中和抗原表位的串联表达及免疫保护性分析

为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的C末端(CPAC)与中和抗原表位NE(ARGFAK)的串联融合蛋白并评价其免疫原性,对已知的A型产气荚膜梭菌CPAC及NE的编码基因进行优化设计,并将两个基因的三拷贝序列串联,经人工合成获得基因片段GCPAC3NE3。将该片段克隆至原核表达载体p ET30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白。利用Western blot方法检测重组蛋白与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。随后,以纯化的重组蛋白免疫家兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测家兔血清的中和抗体效价。在二免后21 d,以1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素对家兔进行攻毒。结果表明重组蛋白主要以包涵体的形式存在表达且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。每毫升的一免抗血清可中和40个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和80个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,重组蛋白具有良好的免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的实验数据。     

重组产气荚膜梭菌ε毒素三点突变体的融合表达及其免疫活性分析

为获得并评价重组产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)三点突变体蛋白的毒力及免疫活性,对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,同时引入包括第30和196位酪氨酸突变为丙氨酸,及第106位组氨酸突变为脯氨酸共3个氨基酸突变,并在该基因5'端添加Th细胞表位(T)和鞭毛蛋白(flagellin)N末端编码序列,经人工合成获得基因片段GTFNETXm3。随后,将该基因片段克隆至原核表达载体p ET30a-(+),转染BL21(DE3)菌诱导表达、纯化,从而获得重组蛋白,进而利用Western blot方法检测重组蛋白与D型产气荚膜梭菌抗血清的反应性,并检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)及小鼠的毒力。最后,将重组蛋白与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。结果显示,重组蛋白主要以包涵体的形式存在,且能与D型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;100μg/m L的重组蛋白未显示细胞毒性;6.25 mg/kg剂量的重组蛋白对小鼠无致死性;每毫升的一免抗血清可中和80~120个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和750~1100个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素;用1个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。试验表明,产气荚膜梭菌ETX三点突变体的毒力基本消失,且保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。     

仔猪大肠杆菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗的研制与应用

为了研制仔猪大肠杆菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗,将大肠埃希菌C83549(K88)、C83644(K99)、C83710(987P)菌株和C型产气荚膜梭菌C59-2菌株分别接种适宜培养基,提取大肠埃希菌纤毛和C型产气荚膜梭菌外毒素,灭活和脱毒后加入冻干保护剂,冷冻干燥制成冻干灭活疫苗。该疫苗性状为类白色海绵状疏松团块,无菌检验合格,疫苗对仔猪和怀孕母猪安全,怀孕母猪免疫该疫苗后所产仔猪对大肠埃希菌和C型产气荚膜梭菌的攻毒保护率均在80%以上。临床应用结果表明,该疫苗能明显提高免疫母猪的窝平仔猪成活数。     

产气荚膜梭菌重组ε毒素突变体的免疫保护力评价

旨在获得产气荚膜梭菌ε毒素的重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。对已知的D型产气荚膜梭菌ε毒素编码基因进行了优化设计和人工合成,同时引入3个氨基酸点突变:第30和196位酪氨酸突变为丙氨酸,第106位组氨酸突变为脯氨酸。将该基因片段克隆至原核表达载体pET30a-(+)中进行表达,并纯化。利用Western blot方法检测纯化蛋白质与D型产气荚膜梭菌ε毒素抗血清的反应性,并检测其对小鼠的毒力。随后,以纯化的重组蛋白质免疫兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。结果表明,ε毒素的重组突变体为可溶性表达,通过灰度扫描,其表达量比例可达40%;该蛋白质能与D型产气荚膜梭菌ε毒素抗血清反应,小鼠安全试验显示,6.25×106 ng·kg-1的蛋白质仍无毒力;免疫兔血清对D型产气荚膜梭菌ε毒素的中和效价在一免后可达50~60最小致死量(MLD),二免后可达400~450 MLD;用1个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到保护。由此表明,产气荚膜梭菌重组ε毒素突变体无毒力且保留了良好的免疫原性,为D型产气荚膜梭菌病新型疫苗的研制提供了重要的实验数据。     

产气荚膜梭菌ε毒素突变体的表达及免疫保护力评价

为获得产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,并将第106位组氨酸突变为脯氨酸,经人工合成获得基因片段GETXH106P。将GETXH106P克隆至原核表达载体p ET30a(+),转染BL21(DE3)菌中进行表达与纯化,从而获得重组蛋白r ETXH106P。利用Western blot方法检测r ETXH106P与D型产气荚膜梭菌抗血清的反应性,并检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)以及小鼠的毒力。随后,将r ETXH106P与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。结果表明,r ETXH106P为可溶性表达,通过灰度扫描,其可溶性表达量比例可达30%;该重组蛋白能与D型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;细胞毒性试验结果显示,100μg/m L的重组蛋白仍无细胞毒性;小鼠安全性实验结果显示,6.25×106ng/kg剂量的重组蛋白对小鼠仍无致死性;每毫升的一免抗血清可中和450~700个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和3000~4000个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素;用1 MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。以上结果表明,产气荚膜梭菌r ETXH106P重组蛋白毒力基本消失,且保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。     

表达禽流感病毒NP和M2融合基因重组乳酸菌的构建及鉴定

为了在乳酸菌中表达H9N2亚型禽流感病毒（AIV）NP和M2基因并检测其反应原性,先以pMD19-T-M2质粒作为模板,采用PCR方法克隆M2全长基因,然后将M2基因亚克隆入pSIP409-pgsA′-NP质粒中,构建重组质粒pSIP409-pgsA′-NP-M2。并将重组质粒pSIP409-pgsA′-NP-M2通过电转化的方法转入植物乳杆菌Lb.plantarum NC8中,制备重组菌NC8-pSIP409-pgsA′-NP-M2。诱导表达NC8-pSIP409-pgsA′-NP-M2重组乳酸菌,并通过流式细胞术、免疫荧光和免疫印迹技术验证。结果表明,重组菌NC8-pSIP409-pgsA′-NP-M2能够经诱导表达NP-M2融合蛋白,并且与兔源NP单克隆抗体和抗M2的小鼠血清具有反应原性。这为后续研究禽流感广谱口服疫苗奠定基础。     

产气荚膜梭菌α-β2-ε毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究

为研究产气荚膜梭菌α、β、ε3种主要外毒素的免疫原性,构建基因亚单位多价疫苗,本研究通过PCR分别扩增α-β2及ε3种毒素基因,分别克隆于p Pro HTa载体中构建重组表达质粒p Pro-α-β2-ε,并转化大肠杆菌进行这3个目的基因的融合表达。SDS-PAGE分析显示,表达的α-β2-ε毒素融合蛋白大小约90 ku,主要以包涵体形式存在。将其免疫BALB/c小鼠后,分别利用A型和B型产气荚膜梭菌强毒素对免疫鼠进行攻毒,并测定免疫鼠血清中抗体对毒素的中和活性。结果表明,免疫鼠对A型和B型产气荚膜梭菌毒素1 LD100和2 LD100的攻毒保护率分别为100%和60%以及100%和80%。体外中和试验显示,免疫鼠血清稀释为1∶20时,对1 LD100A型和B型产气荚膜梭菌毒素的中和效率均可达到100%。以上结果表明,本研究制备的α-β2-ε融合蛋白具有良好的免疫原性,能够有效刺激机体产生中和抗体,可以作为基因工程疫苗的有效组分,为产气荚膜梭菌多价候选亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

表面展示副结核分枝杆菌抗原MAP3007的大肠杆菌活载体疫苗株的构建与免疫效力评价

为构建表面展示副结核分枝杆菌抗原MAP3007的大肠杆菌活载体疫苗株,本研究将冰核蛋白(INP)作为展示平台,将目的基因克隆于构建的pET-INP表面展示载体中,转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,对目的蛋白的表达与定位进行检测。将110只雌性BALB/c小鼠随机分为PBS组(30只),INP-28a对照组(30只),INP-MAP3007重组菌免疫组(30只),空白未攻毒组(20只),其中对照组INP-28a与重组菌INP-MAP3007免疫组以5×10~5cfu/200μL/只剂量分别免疫INP-28a空菌与INP-MAP3007重组疫苗,PBS组注射等体积PBS,3免后以5×10~8cfu/只进行副结核分支杆菌K-10株攻毒试验,空白未攻毒组不做处理,通过检测各组小鼠抗体水平、细胞因子、CD4~+和CD8~+T细胞亚群、增重率以及肠、肝脏和脾脏的病理损伤综合评价疫苗的免疫效果。结果显示,目的蛋白MAP3007正确表达且定位于细菌表面;经3次免疫后疫苗组与其他对照组相比能产生较高的抗体水平(p0.001);攻毒后与其他对照组相比,疫苗组小鼠细胞因子IFN-γ和IL-4极显著升高(p0.001),同时抗炎性细胞因子IL-10降低;疫苗组CD4~+T、CD8~+T淋巴细胞数量极显著增加(p0.001),且疫苗组小鼠体重增长速度与未攻毒组基本一致;病理组织学结果发现疫苗组各器官病变情况相对较轻或无显著病变。上述结果表明表面展示活载体疫苗能够诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫进而提供较好的免疫保护,且可以降低其病理损伤程度,减缓病程。本研究为新型副结核杆菌疫苗的研制奠定了基础。     

表达鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原TATA4与鸡IL-IL-2的侵入型乳酸菌构建及鉴定

为探究鸡柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)表面抗原TA4在植物乳杆菌NC8的表达情况,使用PCR扩增TA4片段,同时使用细胞因子ChIL-2作为免疫佐剂,应用猪圆环病毒2A肽(P2A)序列使抗原与免疫佐剂共表达,连接有金黄色葡萄球菌的纤连蛋白结合蛋白A(FnBPA)的409载体,构建两株重组侵入型乳酸菌NC8 pSIP 409-FnBPA-pgsA′-TA4和NC8 pSIP 409-FnBPA-pgsA′-TA4-IL2。使用自制多克隆抗体通过Western blot检测重组菌的蛋白表达情况。结果表明,两种侵入型目的蛋白TA4和IL-2使用多克隆抗体检测均可成功检测到蛋白表达,为后期动物试验及益生菌口服疫苗的制备奠定了基础。     

甘草总黄酮对鸡产气荚膜梭菌坏死性肠炎的治疗作用

选择具有显著抗炎效果的甘草总黄酮为受试化合物,考察其抗产气荚膜梭菌所致鸡坏死性肠炎的效果,为甘草总黄酮在坏死性肠炎的治疗应用提供依据。选择AA^+肉鸡,经口给予产气荚膜梭菌ATCC13124菌悬液建立肉仔鸡坏死性肠炎模型,之后使用甘草总黄酮对造模成功的肉鸡进行治疗,通过剖检考察肉鸡肠道的病变情况、病变评分、日增重及器官指数等指标以评估甘草总黄酮对坏死性肠炎的治疗效果。结果显示,通过经口攻菌成功建立了肉仔鸡坏死性肠炎模型;剖检发现,经甘草总黄酮治疗的模型鸡其肠道病变程度明显缓解,病变损伤评分显著低于感染组,炎性因子含量显著降低;治疗组肉鸡日增质量及器官指数与健康肉鸡差异不显著。结果表明,甘草总黄酮能够缓解产气荚膜梭菌所致坏死性肠炎对肉鸡肠道的损伤,具有作为抗生素替代品治疗坏死性肠炎的潜力。     

产气荚膜梭菌α毒素C末端的二拷贝串联表达与免疫原性分析

本研究旨在获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)C末端(第247-370位氨基酸,CPA_C)二拷贝串联融合蛋白,并评价其免疫原性。对已知的A型产气荚膜梭菌CPA_C编码基因进行优化设计,将其以同向串连的方式串联成二拷贝基因(GCPA_(C2)),经人工合成获得基因片段GCPA_(C2)。将GCPA_(C2)克隆至原核表达载体pET-30a (+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rCPA_(C2)。利用Western Blot方法检测rCPA_(C2)与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。随后,用rCPA_(C2)免疫家兔,并检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。在二免21 d后,经耳缘静脉注射1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素,检测rCPA_(C2)对家兔的免疫保护效果。结果表明,rCPA_(C2)主要以包涵体的形式表达且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。每毫升的一免和二免抗血清分别可中和30个和80个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素。1个兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,rCPA_(C2)具有良好的免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的实验数据。