樱桃谷鸭Ⅰ亚群腺病毒PCR方法的鉴定

为明确山东泰安地区鸭腺病毒的发病情况,本研究选择2对针对Ⅰ亚群禽腺病毒(FAd V)的特异性引物,对养殖户送检的54份病死鸭病料及48份死胚进行PCR检测,对Ⅰ亚群FAd V阳性的样品进行克隆、序列测定。结果显示,病料中Ⅰ亚群FAd V阳性率为9.3%(5/54),未从鸭死胚中检测出Ⅰ亚群FAd V感染。序列比对显示,Ⅰ亚群FAd V的部分核苷酸序列与两株血清4型FAd V参考株(中国,KU569296、KU981115)的同源性最高,为97.7%,本研究显示,该PCR检测方法可用于鉴定Ⅰ亚群FAd V,该结果对Ⅰ亚群FAd V的检测和生产上流行血清型的鉴定具有参考意义。     

鸡群中6株FAdV-8a与FAdV-8b型禽腺病毒的分离与鉴定

通过监测鸡群中禽腺病毒的感染情况,为临床养殖提供信息资料。采集河北某鸡场表观健康鸡群泄殖腔拭子45份,在病毒分离的基础上,通过分离株序列比对与遗传进化分析血清型。结果共分离到6株禽腺病毒,其中RPVA0923株和RPVA0924株核苷酸序列与FAd V-8b相似性大于98.68%,与FAd V-8b型K08株、764株有较近的亲缘关系;RPVA0925、RPVA0926、R PVA0927、R PVA09282株核苷酸序列与FAd V-8a型禽腺病毒相似性大于98.81%,与FAd V-8b型TR59株亲缘性最近。本研究分离到4株FAd V-8a和2株FAd V-8b。结果表明临床表现健康鸡群存在携带多血清型禽腺病毒,养殖企业需重视这种现象。     

我国Ⅰ群禽腺病毒主要流行血清型及其防控

对2007~2017年从我国主要养殖区临床病料中分离的86株禽腺病毒(FAd V)血清型鉴定结果表明,我国流行的主要血清型为FAd V-11、FAd V-4、FAd V-8b和FAd V-8a,常与鸡传染性贫血病病毒混合感染。蛋鸡流行的FAd V血清型主要为FAd V-4(88.9%),肉鸡主要为FAd V-11(47.6%),而危害最大的是FAd V-4引起的心包积水-肝炎综合征。在鸡LMH细胞上进行的交叉中和试验结果表明,FAd V-4的高免阳性血清可中和其自身和FAd V-11,但不能中和FAd V-8a、FAd V-8b。提示,有必要研制FAd V-4、FAd V-8a和FAd V-8b三价灭活疫苗和FAd V亚单位通用疫苗。     

鸵鸟Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定、血清型鉴定以及Hexon蛋白基因序列分析

对3份来自不同地方的病死鸵鸟进行病理剖检、病原分离鉴定,确诊为Ⅰ群禽腺病毒感染,并成功分离到3株鸵鸟FAV-Ⅰ。采用PCR方法成功扩增2株临床分离株的Hexon基因,分别克隆于p MD20-T载体,对其进行了核苷酸序列测定、同源性比较及遗传进化分析。并运用Ⅰ群禽腺病毒12个标准毒阳性血清对其中2株毒进行了血清型鉴定。结果显示,分离株2014.07.10-HBHD-TN、2014.07.19-HBHS-TN与12个标准株之间的同源性在72.5%~98.0%之间,其中与FAV-4的同源性最高是98.0%。在系统进化树中,这两个分离株均位于FAV-I的大分支中,且与FAV-4位于同一小分支。这2个分离株经血清学鉴定均为血清4型的毒株。     

贵州省鸡心包积液-肝炎综合征实验室诊断与病原基因分型

为证实鸡心包积液-肝炎综合征(hydropericardium hepatitissyndrome,HHS)在贵州省的流行、病原遗传变异和基因分型情况,对贵州首个疑似HHS病例进行实验室检测,并基于Hexon基因进行病原基因分型。结果显示:病例组织材料中PCR扩增获得约295 bp特异性Hexon基因片段;基于Hexon基因分型显示,本病例病原与国内外报道的禽腺病毒Ⅰ群血清4型(FAd V-4)同源性高达100%,与禽腺病毒Ⅰ群代表株CELO株(U46933)同源性达到64.5%;系统进化分析显示,FAd V-4贵州流行株与禽腺病毒Ⅰ群代表株CELO株和FAd V-4国内外流行株均处于同一进化分支,而与禽腺病毒Ⅱ群和禽腺病毒Ⅲ群处于不同进化分支。结果表明:本病例确为贵州省首次报道HHS病例,病原基因分型为禽腺病毒Ⅰ群血清4型,研究结果为贵州省HHS防控提供参考。     

Ⅰ群禽腺病毒hexon基因分型与序列分析

对鸡群中感染的Ⅰ群禽腺病毒hexon基因进行分型与序列分析,以期明确Ⅰ群禽腺病毒基因型的分布和hexon基因变异情况。参考GenBank上FAdV基因序列,设计2对引物,采用套式PCR技术扩增临床病料中Ⅰ群禽腺病毒hexon基因,测序后获得了8株FAdV hexon基因片段。结果表明,构建系统进化树发现,其中HM、SXFS、LQQD、HXGB、GSPL、DYQY和FP共7株属于FAdV-4型,而GS株属于FAdV-1型。7株FAdV-4型毒株核苷酸同源性在99.9%～100%之间,推导的氨基酸序列同源性均为100%,提示这7株FAdV-4型流行毒株高度同源。FAdV-1型的GS与CELO株核苷酸、推导的氨基酸序列同源性均为99.2%,提示GS与CELO株亲缘关系较近。在鸡群中发现存在FAdV-1型和FAdV-4型Ⅰ群禽腺病毒,各血清型毒株之间高度同源,毒株遗传稳定性高。     

禽腺病毒AH株的分离与鉴定

为获得禽腺病毒毒株,将临床疑似Ⅰ群禽腺病毒感染病例的肝组织,通过接种SPF鸡胚进行病毒分离,用PCR方法对分离产物进行扩增,将PCR产物进行序列测定,对测定的序列在NCBI网上进行分析,结果显示,从病料可分离出病毒,用PCR方法特异性地扩增出了与设计片段大小相一致的片段,序列分析表明,分离株序列与禽腺病毒SD1-15分离株序列同源性99%,说明分离株为Ⅰ群禽腺病毒血清4型。     

三株J亚群禽白血病病毒的分离及其gp85基因序列分析

本试验从湖北省分离到3株J亚群禽白血病病毒,并通过病理解剖、DF-1细胞培养和RT-PCR进行了鉴定,分别命名为HB1002、HB1003和HB1009。根据J亚群原型毒株HPRS-103序列设计引物,扩增gp85基因并测序。序列分析表明:基因片段大小均为921 bp,与预期一致;分离到的3株病毒之间核苷酸同源性在97.7%~99.7%,氨基酸同源性在95.1%~99.0%;与原型毒株HPRS-103核苷酸序列同源性在94.1%~94.8%;与其它ALV-J核苷酸同源性在87.6%~97.3%;进化树分析表明,分离到的3个毒株与JS09GY6同源性最近,在95.2%~97.3%。     

Ⅰ群禽腺病毒4型陕西分离株33K、Fiber-1、Fiber-2、pⅢa基因的克隆及序列分析

为明确Ⅰ群禽腺病毒陕西分离株相关基因的特征,通过聚合酶链反应(PCR)技术分别扩增了禽腺病毒陕西分离株SX17株的4个基因片段,即33K、Fiber-1、Fiber-2、pⅢa,将其分别克隆到pCold-SUMO载体后进行序列测定,并将克隆得到的4个基因片段与发表的相应序列进行序列比对及遗传进化分析。结果表明,克隆得到的4个片段与Ⅰ群禽腺病毒4型同源性最高,33K基因核苷酸及推导的氨基酸同源性在99.3%~100%与91.5%~100%之间,Fiber-1基因核苷酸及推导的氨基酸同源性在98.5%~100%与65.9%~100%之间,Fiber-2基因核苷酸及推导的氨基酸同源性在98.1%~100%与99.3%~100%之间,pⅢa基因核苷酸及推导的氨基酸同源性在98.6%~100%与98.5%~100%之间。由遗传进化树可知,这些基因在遗传关系上与血清4型位于同一分支,亲缘关系最近,分析显示陕西分离株为Ⅰ群禽腺病毒血清4型。     

9株Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及hexon基因的遗传变异分析

为了解山东省肉鸡场禽腺病毒的感染流行特点,为其科学防治提供依据,通过临床症状观察、病毒分离鉴定、鸡胚致病性试验、血凝试验、PCR检测及克隆测序等方法进行病原检测分析。结果表明,发病肉鸡主要表现为精神沉郁、采食减少等临床症状。鸡胚致病性试验可见死亡胚体呈全身出血、体型小、肝肿大现象。血凝试验显示,分离株不具凝集鸡、鸭、大鼠红细胞的特性。对hexon基因进行克隆测序分析显示,LY9株与Ⅰ群禽腺病毒血清8型亲缘性近,与参考株(58株)的核苷酸同源性为98.8%,氨基酸同源性为98.6%。其余8株分离株间的核苷酸同源性为91.3%~99.8%,氨基酸同源性为97.8%~100%;与Ⅰ群禽腺病毒血清4型参考株(HB1510株)属同一进化分支,核苷酸同源性为93.1%~100%,氨基酸同源性为98.9%~100%。结论:从山东省4家肉鸡场分离到的9株病毒均为Ⅰ群禽腺病毒。     

禽腺病毒血清4型吉林株的分离鉴定与遗传变异分析

对吉林地区送检的疑似禽腺病毒感染样品进行了分子流行病学调查,并对检测为阳性的样品进行病毒分离鉴定,共得到61个I型禽腺病毒流行毒株。对hexon基因进行的PCR扩增,获得长度为1 414,1 786,1 670bp的基因片段。通过测序分析发现,吉林地区禽腺病毒流行毒株基因型由B型变化为C型,血清型4型。根据同源性分析结果显示,本次获得的3个分离株与禽腺病毒4型标准毒株ON1株的核苷酸序列相似性较高,达到了99.1%。     

Ⅰ群禽腺病毒12个血清型毒株Hexon蛋白全基因序列测定和酶切位点分析

利用3对引物(A、B、C)分别进行Ⅰ群禽腺病毒的12个血清型毒株的Hexon全基因序列PCR扩增,并进行序列测定和PCR-RFLP分析,通过DNAStar软件和MEGA软件进行序列分析并绘制遗传发育进化树。结果显示,Hexon基因全长为2 800左右个核苷酸,编码约940个氨基酸,不同血清型之间的同源性为75.2%～99.5%,变异范围是0.0%～24.3%。推导的氨基酸同源性为20.7%～98.8%,差异性为0.0%～24.2%。12个血清型之间Hexon全基因序列信息用来评价Ⅰ群禽腺病毒家族的种系发育关系,构建的进化树显示出5个主要的分支。选用限制性内切酶HaeⅡ,利用存在差异的Hexon序列片段D特异性可以有效区分大部分血清型。结果表明,获得了Ⅰ群禽腺病毒12个血清型不同毒株的Hexon全基因序列并进行了分子进化分析,同时结合12个血清型PCR-RFLP分析,为进一步分析鉴别Ⅰ群禽腺病毒不同血清型提供依据。     

蛋鸡Ⅰ群腺病毒湖北株的分离与分子鉴定

从蛋鸡养殖场采集疑似"心包积水-肝炎综合症"蛋鸡的肝脏,分离病毒,处理后接种于SPF鸡胚。应用PCR方法扩增Ⅰ群腺病毒hexon基因并进行序列分析;将分离的病毒感染30日龄健康雏鸡,观察感染后鸡群临床症状和病死鸡病理变化。结果显示:分离的3株禽腺病毒病毒基因同源性为100%;与Ⅰ群腺病毒血清4型同源性为99.8%;与Ⅱ群禽腺病毒和Ⅲ群禽腺病毒同源性为43.1%~78.6%;病毒感染雏鸡后,第3 d出现鸡只死亡,第5 d达到死亡高峰期,整个试验阶段鸡只死亡率达到60%,解剖、死亡鸡可见典型心包积液-包涵体肝炎症状,肾细胞中出现空泡和坏死。结果表明,本研究成功分离1株Ⅰ群腺病毒,命名为Ⅰ群腺病毒湖北株。     

J亚群禽白血病病毒安徽分离株的鉴定及其gp85基因序列分析

从安徽省的黄羽肉鸡和罗曼蛋鸡中各分离鉴定出1株J亚群禽白血病病毒,克隆获得了2条相应的gp85基因序列,并与参考毒株进行序列比对。结果表明,两分离毒株与J亚群参考毒株同源性为82.1%~99.4%,分离毒株之间同源性为85.4%。其中肉鸡分离毒株与J亚群原型毒株HPRS-103同源性为97.1%,与J亚群国内毒株SD09TA04、SDYC02J同源性均为99.4%;蛋鸡分离毒株与HPRS-103的同源性为89.0%,与SD09TA04和SDYC02J同源性仅为88.6%。两分离毒株的gp85氨基酸序列出现突变和缺失,在高变区hr1、hr2变异明显。进化分析进一步表明,2个分离毒株亲缘关系较远,可能来源于不同的原始病毒株。     

I群禽腺病毒的分离鉴定与同源性分析

为了解鸡群中I群禽腺病毒(FAd V-I)的流行现状,从山东、黑龙江、吉林等地部分大规模养鸡场采集病料,进行病毒分离、PCR鉴定及同源性分析。结果显示:从76份病料中分离到10株FAd V-I,分离率为13%;10株FAd V-I中,1株为血清4型,6株为血清8b型,1株为血清9型,2株为血清11型。结果表明,山东、黑龙江、吉林等地均存在一定的FAd V-I流行,主要流行血清型已由4型转变为8b型,因此需要评估当前的4型灭活苗能否有效防控这些地区的FAd V-I流行。     

一例肉鸡包涵体肝炎病例的诊治

从东北某疑似感染FAdV-Ⅰ病毒AA+肉鸡养殖公司采集病料送至瑞普生物诊断中心,采用PCR方法禽腺病毒Ⅰ群核酸(FAdV-Ⅰ)核酸检测,结果成阳性。回收琼脂糖凝胶中的目标核酸送至测序公司测序,利用MegAlign软件和MEGA6.06软件分别做腺病毒分离株与禽腺病毒Ⅰ型hexon基因的同源性分析和基因进化分析,结果发现该分离株与FADV-11型参考株同源性为99.9%,基因型属于D亚型,血清型属于11型。对发病鸡群采用注射腺病毒卵黄抗体和干扰素,同时使用保肝护肾中药肝肾宝和放继发感染抗生素头孢噻呋钠,控制住了病情。     

J亚群禽白血病病毒GDHX01株分离与基因序列分析

为了解胡须鸡中是否存在禽白血病病毒(ALV)感染,从广东某胡须鸡养殖场中无菌采集胡须鸡血样,采用DF-1细胞培养、ELISA抗原检测、PCR扩增等方法,成功分离鉴定出一株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为GDHX01株。测序结果显示GDHX01株病毒基因组DNA序列全长为7616 bp,gp85基因全长919 bp。通过与其他禽白血病病毒参考毒株的基因组DNA序列进行比对分析,发现GDHX01与国内外J亚群禽白血病参考毒株同源性85.3%～95.7%之间。进一步比对发现,GDHX01毒株的gp85基因序列与国内外ALV-J参考株CAUGX01的同源性最高为95.8%。结果表明,在胡须鸡群中存在J亚群禽白血病病毒的感染。     

辽宁猪圆环病毒病流行状况调查与分析

用PCR技术,对2008-2012年来自于兽医门诊病例的3 336份样品,以及2010-2013年采集屠宰场的930份组织样品进行了PCV-2核酸检测。结果表明,PCV-2感染在辽宁临床发病猪群中普遍存在,感染率呈逐年上升趋势。测定了11株PCV-2毒株进行全基因序列,同源性分析表明,11株分离毒株之间的同源性为94.5%~99.4%,与国内参考毒株间的同源性为94.5%-99.7%,与国外参考毒株间的同源性为94.3%~99.3%;结果还显示,PCV2b仍然为我省猪群PCV-2的主要流行基因型。     

Ⅰ群禽腺病毒血清4型QD株的分离与鉴定

为了对Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的毒株进行分离,试验采用病毒分离、DNA提取、PCR鉴定、Hexon基因序列分析、病毒毒价测定、病毒形态学观察及动物回归试验等方法对青岛地区疑似心包积水及包涵体肝炎病鸡的肝脏进行了研究。结果表明:该分离毒株提取的DNA经PCR鉴定为阳性;该分离毒株序列与已发表的Ⅰ群禽腺病毒4型序列同源性为97.7%,病毒毒价为1×10~8TCID_(50)/0.1 mL;病毒形态为球形、无囊膜、二十面体对称的粒子结构;在动物回归试验中,病死肉鸡心包有积液,发病鸡肝脏的中央静脉广泛淤血,肝细胞发生空泡样变性,细胞浆和细胞核内可见嗜碱性包涵体。说明该分离株为Ⅰ群禽腺病毒血清4型毒株。     

鸡腺病毒12个血清型代表毒株Penton蛋白基因分析

为了解鸡腺病毒（fowl adenovirus,FAdV）Penton基因的遗传进化规律,试验根据GenBank中已公布的各基因型序列设计特异性引物,通过PCR技术分别扩增12个血清型毒株的Penton基因,连接至pEASY-Blunt Simple Cloning Vector上进行序列测定,并将12个血清型毒株Penton蛋白的核苷酸序列与NCBI上已公布的标准毒株的核苷酸序列使用ClustalW法进行分析比对,绘制遗传进化树。结果显示,12种血清型Penton蛋白核苷酸序列与各血清型标准毒株同源性均在99.2%以上,其中FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-4、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-10、FAdV-11与对应标准株同源性高达100%,这进一步证实了实验室保存毒株与世界相应标准毒株的一致性。Penton蛋白虽然保守性较高,但不同种之间仍存在明显差异。FAdV-A1与其他种毒株同源性为70.6%~73.3%;FAdV-B5与其他种毒株同源性为70.6%~77.9%;FAdV-C同种不同血清型之间核苷酸同源性为99.6%,FAdV-C4与其他种之间同源性71.2%~73.4%;FAdV-D同种不同血清型之间核苷酸同源性为95.6%~98.7%,与其他种之间最高为85.3%;FAdV-E同种不同血清型之间核苷酸同源性为98.2%~99.4%,不同种间最高为85.3%。即相同种毒株之间差异较小,不同种毒株之间差异较大。依据Penton蛋白的核苷酸序列同样可以将FAdV分为A、B、C、D、E 5个种。本研究通过成功克隆FAdV 12种血清型Penton基因,并进行遗传进化分析,为今后对FAdV诊断、监测及毒株鉴定提供了参考。