HA蛋白位点变异影响H7N9亚型流感病毒特性的研究进展

2013年春,我国首次出现人感染H7N9亚型禽流感疫情,对家禽养殖和公众健康均产生了严重危害,并且在第5波流行期又演变出血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白裂解位点处存在插入突变的高致病性禽流感病毒株.HA作为A型流感病毒表面表达丰度最高的糖蛋白,在介导病毒与宿主细胞表面受体的结合、促进病毒囊膜与细胞膜的融合...     

鸭源H7N9亚型流感病毒HA蛋白的真核表达及其免疫保护效力分析

为进行鸭源H7N9亚型流感病毒HA蛋白表达纯化及其免疫保护效力分析,本研究以鸭源流感病毒A/Duck/Fujian/S4170/2014 (H7N9)HA基因为模板,PCR扩增后将HA片段克隆至昆虫细胞表达载体p Fast Bac1中。将构建的重组质粒p FBacH7HA转化DH10Bac感受态细胞,提取PCR鉴定为阳性的重组杆粒Bacmid-H7HA,转染SF9昆虫细胞。结果显示重组Bacmid-H7HA表达HA蛋白,并装配成重组杆状病毒,将该病毒感染High Five细胞,大量表达H7-HA蛋白。免疫荧光试验、SDS-PAGE及western blot分析结果表明H7-HA蛋白正确表达且纯度达90%以上,血凝试验表明表达蛋白具有良好的生物活性。利用纯化的H7-HA蛋白免疫SPF鸡后进行攻毒保护试验,评价该蛋白作为免疫原对SPF鸡的免疫保护效力,结果显示HA蛋白免疫组鸡只得到100%保护。以上结果表明本研究表达纯化的H7-HA蛋白可以作为防控H7亚型禽流感的候选亚单位疫苗。     

H7N9亚型流感病毒病原学及流行病学分析

2013年2月以来,我国华东地区出现了H7N9亚型流感病毒感染人的事件,引起了国内外的广泛关注。我国政府采取了迅速而有效的防控措施,在短时间内控制了H7N9病毒的扩散和传播,但是目前此病仍处于散发状态,并且可能在禽类中长期存在,因此会在一段时间内对公共卫生安全造成威胁。该病的病原学研究发现,病毒的8个基因片段全部为禽源,为三源重排的病毒。病毒的HA和PB2蛋白已出现哺乳动物适应性突变,NA和M蛋白出现了金刚烷胺和奥司他韦的抗药性突变。带毒禽类及其污染物是本病的主要传染源,病毒可以通过直接接触和气溶胶在雪貂模型间传播,老年人对此病更加易感。对活禽市场的严格管理,对病毒流行和变异的严密监测,以及对疾病预防意识的增强,是对H7N9有效防控的保证。     

新型重配甲型H7N9流感病毒HA基因序列分析

为了分析2013年新型重配甲型H7N9流感病毒HA基因分子流行病学特征,从NCBI数据库下载不同分离宿主的流感毒株HA全基因序列,应用分子生物学软件进行遗传演化分析。结果显示:A/Hangzhou/1/2013(H7N9)株HA裂解位点为PEIPKGR↓GLF,含有2个碱性氨基酸;HA蛋白有糖基化位点5个。抗原位点和受体结合位点,相对于之前人感染的H7亚型流感病毒发生不同程度变化。与A/Hangzhou/1/2013(H7N9)株中HA片段的核苷酸同源率较高的前10个毒株均分离自亚洲国家禽类,同源率达到95%以上。此次新型重配H7N9流感毒株HA基因是否由禽传给人有待进一步研究。     

一株禽源高致病性H7N9亚型流感病毒分子特性研究

为了研究一株禽源高致病性H7N9亚型流感病毒,分析其变异进化及部分生物学特性,试验以从H7N9亚型流感病毒阳性病死鸡的肺脏组织中提取的总RNA为模板,利用特异性引物扩增出全基因序列,分析其核苷酸和氨基酸序列,利用同源建模在线服务软件SWISS-MODEL对突变位点附近的氨基酸序列空间结构进行研究。结果表明:PCR扩增出H7N9亚型流感病毒8个基因片段,即HA、NA、PA、PB1、PB2、NP、NS、M,这8个基因片段均与A/Chicken/Heinan/ZZ01/2017(H7N9)的相应片段具有较高的同源性; HA的第135,226位和NA第401,429位氨基酸存在突变;除A135V突变外,L226Q、A401T、K429R突变均能导致受体结合位点或唾液酸结合位点体积的改变。说明根据基因同源性分析结果,黑龙江省的H7N9流感疫情可能是从中国中部地区传播而来;根据受体结合位点的分析结果,L226Q、A401T和K429R突变可能影响病毒与宿主细胞间的相互作用。     

关注H7N9流感病毒

当前,全球对发生在我国的人感染H7N9流感病毒事件保持密切关注。这是一种在人类中从未被发现过的新型病毒,病毒基因组初步分析表明,该病原体可能在家禽中传播,但并不会引起严重症状,这使得病毒难以监测,截至目前,该病毒的动物宿主仍未发现。本期聚焦了《Nature》等对该病毒研究的相关报道。     

H7N9亚型流感病毒感染与传播研究概况

鉴于H7N9亚型流感病毒易变异的特点以及人感染后的高死亡率,该病毒是否具备人际间传播的能力成为研究的热点。研究显示,H7N9亚型流感病毒的氨基酸突变不仅会影响病毒的毒力、耐药性,而且对病毒的跨种传播至关重要。为此,本文在参考国内外相关文献的基础上,从H7N9亚型流感病毒的溯源、感染宿主与传播媒介、传播与复制3个方面对病毒的最新研究进展进行整理,为更加全面了解该病毒的来源、传播与复制,科学理解该病毒对不同宿主的感染及防控提供参考。     

H7N9流感病毒的防控

H7N9病毒是甲型流感中的一种,给家禽养殖业和消费者健康构成了重大威胁,为积极有效应对,本文将甘肃省酒泉市肃州区预防和控制H7N9病毒中的一些实际做法进行了总结分析,以供参考。     

H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白S145N变异株致病性及抗原特性

为确定近年来H9N2亚型禽流感病毒(AIV) HA蛋白S145N点突变对病毒毒力变化和抗原性变异的影响,笔者对从全国不同地区分离的12株H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株和HP疫苗参考株进行了半数鸡胚感染量(EID50)、半数鸡胚致死量(ELD50)、平均鸡胚致死时间(MDT)、雏鸡脑内致病指数(ICPI)、鸡静脉致病指数(IVPI)和8周龄SPF鸡感染排毒试验,并与抗H9N2亚型AIV HP参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性进行测定.结果发现,H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株毒力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长.单抗2A4和F6不能抑制H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞.研究结果表明,H9N2亚型AIV呈现变异趋势,有毒力增强和抗原性变异毒株出现.S145为H9N2亚型AIV HA蛋白的1个抗原位点,是血凝抑制抗体结合的位点,但有该位点漂变导致抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用.这提示该病的防控面临着新的挑战.     

H7N9流感病毒的动态

1采取生物安全措施应对H7N9流感病毒联合国粮农组织表示,中国政府需要采取强有力的生物安全措施应对出现的H7N9禽流感病毒。与其它流感病毒如H5N1高致病性禽流感病毒相比,这种新病毒在家禽中很难被发现,因为感染动物并没有患病的迹象。     

H7N9亚型禽流感病毒HA基因mRNA的构建

H7N9亚型禽流感病毒(AIV)持续给家禽及人类健康造成威胁。为构建H7N9亚型AIV (简称H7N9AIV) mRNA疫苗,本研究以AIV分离株A/chicken/Yunnan/SD024/2021 (H7N9)(简称CK/YN/SD024/2021)的HA基因为目的基因、选择来自人β-球蛋白和非洲爪蟾β-球蛋白的不同编码基因序列作为HA基因的非翻译区(UTR),构建了中间转录质粒p GEM-YN和p XT7-YN,以2个质粒为模板通过体外转录制备了mRNA m H7-YN-p GEM和m H7-YN-p XT7;将2种mRNA转染HEK293T细胞,western blot鉴定结果显示2种mRNA转染的细胞均可检测到约为70 ku的HA蛋白条带和50 ku的HA1蛋白条带;通过间接免疫荧光试验(IFA)确定最适转染剂量和HEK293T细胞中HA蛋白的动态表达,结果显示,3μg mRNA转染106个细胞并于转染24 h后荧光信号强度均最强;将2种mRNA转染鸡胚成纤维细胞(CEF),均可通过IFA检测到HA蛋白的表达。以上结果表明,本研究正确构建了2种含H7N9 AIV HA基因的m...     

高致病性H7N9流感病毒RT-LAMP检测方法的建立

2017年2月广东CDC首次报告了一种新的H7N9流感病毒变异株,该变异株在血凝素(HA)基因的裂解位点发生了插入型突变,从而成为对禽高致病性的H7N9流感病毒(HPH7N9)。因此,急需建立一种快速简便的H7N9流感病毒检测方法。根据HP-H7N9的HA基因序列,设计一组HP-H7N9特异性的RT-LAMP引物,在对反应体系进行优化的基础上,建立了HP-H7N9的RT-LAMP检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验。结果显示,本方法只对HPH7N9特异性扩增,而对低致病性H7N9病毒(LP-H7N9)、H7N3流感病毒(H7N3)、H3N2流感病毒(H3N2)、H5N1禽流感病毒(H5N1)、H9亚型禽流感病毒(H9)、新城疫病毒(NDV)、甲型H1N1流感病毒(H1N1)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)等病原未见扩增。该方法最低能够检测到2.97×10~5copies(10-6稀释度)的阳性质粒,具有良好的检测灵敏度。本方法操作简便,对设备需求较低,试验耗时短,反应结果可直接肉眼观察判读,适用于基层兽医站所、养殖场及野外监测点的HP-H7N9的快速筛查和监测。     

宠物鸟H3N8亚型流感病毒HA基因的特征性分析

来自香港和世界各地的10株宠物鸟H3N8流感病毒的HA基因进行了全基因序列测定,用DNASTAR和Tree-View软件进行序列编辑,序列翻译,进化树绘制和分子演化分析.结果表明来自不同国家和地区的H3N8流感病毒的HA基因都非常相似,都形成一个独立的分支,属于欧亚亚系,同源率为95.9%～100%;香港2001年宠物鸟的毒株之间的同源率最高,分别为99.2%～100%.HA基因与A/Equine/Jilin/89(H3N8)的同源性为最高,在92.9%～93.6%之间.氨基酸分析表明只有A/Parakeet/Netherland/33/01的HA基因在97～99受体结合位点处有一个额外潜在的糖基化位点NKT;因此可见宠物鸟H3N8流感病毒的HA基因高度保守,HA基因均来自共同的祖先.     

我国H9N2亚型流感病毒的研究进展

猪流感(SwineInfluenza,SI)是由正粘病毒科流感病毒引起的一种急性,高度接触传染性的群发性猪呼吸道疾病,是猪的主要免疫抑制病之一。临床以突发、高热、咳嗽、呼吸困难、衰竭、高发病率、低死亡率为特征,单纯SI的病理变化主要表现为病毒性肺炎及其他呼吸器官的炎性变化,但有其他病原继发或混合感染时,病理变化会严重而复杂。1918年美国首次报道了SI。1930年Shope首次分离鉴定了经典HlNl亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)。SIV具有生态学的特殊性和非常重要的公共卫生意义。每次人流感新变异株出现并引起人流感暴发流行前后…     

H6亚型鸭源流感病毒HA基因序列分析

为了研究H6亚型禽流感病毒的分子特征,本研究从鸭的咽喉拭子样本中分离到一株禽流感病毒,通过血凝抑制试验证实该分离株为H6亚型流感病毒,命名为A/duck/Heilongjiang/QG 1/2013(H6).对其血凝素基因进行了克隆和序列分析,结果表明分离株与我国鸭源禽流感病毒A/duck/Guangxi/585/2005 (H6N5)的同源性最高,达到97.8％.系统发育树分析进一步证实分离株与A/duck/Guangxi/585/2005 (H6N5)的亲缘关系最近,共同起源于台湾分离株A/chicken/Taiwan/G23/87 (H6N1).本研究为H6亚型禽流感的流行病学研究补充了新的数据.     

H7N9亚型流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测H7N9亚型流感病毒的通用荧光RT-PCR方法,根据GenBank数据库中收录的相关基因组序列,应用Primer 5.0软件设计合成针对H7和N9序列的特异性引物和TaqMan探针,并对该方法开展特异性、敏感性、重复性试验.结果显示:H7和N9核酸片段最低检测限均为1.7×103 copies/mL;...     

蝙蝠流感病毒与H9N2亚型禽流感病毒M蛋白的免疫原性比较研究

为比较新发蝙蝠流感病毒H17N10亚型与禽流感病毒H9N2亚型的M蛋白(包括M1和M2蛋白)的免疫原性,分别构建两种亚型流感病毒M1、M2的原核表达载体和真核表达载体,利用前期反向遗传学技术拯救获得两种重组病毒感染MDCK细胞,并分别与相应的单抗或多抗进行免疫印迹和免疫荧光鉴定。结果显示,两种亚型病毒的M1蛋白的原核表达产物均与M1多抗反应,均不与2株M1单抗反应;拯救的两种重组病毒感染细胞后及其M1蛋白的真核表达产物均与M1的单抗5F2反应,不与单抗3G8及M1的多抗反应,两种亚型的结果一致;而两种亚型的M2蛋白通过与单抗和多抗反应,出现了不一致的结果,M2的单抗仅与蝙蝠流感病毒M2的原核表达产物反应,不与H9N2禽流感病毒M2的原核表达产物反应,M2的多抗则反之;且M2的多抗仅与H9N2禽流感M2的真核表达产物以及拯救病毒反应,均不与蝙蝠流感病毒M2的真核表达产物及拯救病毒反应。本研究证实这两种亚型流感病毒的M2蛋白之间确实存在免疫原性的差异,并且筛选到了可以区分蝙蝠流感病毒和禽流感病毒的M2抗体,为进一步研究流感病毒M蛋白相关的生物学机制提供了基础。     

H5亚型鸭源流感病毒HA基因序列生物信息学分析

A型流感病毒（AIV）引起的禽类禽流行性感冒（avian influenza,AI）或相关疾病,被国际兽疫局定为甲类传染病。AIV中最容易突变的基因是血凝素（HA）基因,具有亚型和株的特异性,是区分病毒亚型的依据之一。本研究从GenBank中下载了所有209条鸭源H5禽流感病毒HA基因的全序列,利用生物信息学软件构建进化树研究序列的聚类特点;比较不同年份毒株的HA基因的受体结合位点氨基酸,找出受体结合位点氨基酸的变异规律;比较不同年份分离的鸭源H5N1序列的HA1和HA2蛋白的剪切位点,找出各年份毒株的剪切位点的特点;比较不同年份分离序列的潜在糖基化位点,统计各年份潜在糖基化位点的数量以及序列变化。期望找到H5亚型鸭源流感病毒的变异规律和变异方向,为鸭源流感的防控起到积极的作用。     

猪源H9N2亚型流感病毒HA基因的序列测定及真核表达

利用RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Zhejiang/7/2004(H9N2)(SW/ZhJ7/04)HA基因,测序后将其克隆到真核表达载体pCAGGS上,经酶切分析、PCR鉴定和测序验证,得到重组表达质粒pCAGGS-HA,之后将其转染293T细胞,48h后收集转染细胞样品,进行SDS-PAGE分析,结果显示HA蛋白获得了表达。经Western blot检测,结果表明pCAGGS-HA能够在体外瞬时表达具有免疫学活性的HA蛋白,通过免疫小鼠,对其免疫效果进行了初步研究。