兔TLR2、TLR3和TLR4部分cDNA序列的克隆及分析

用RT-PCR技术从日本大耳白兔脾脏组织克隆出兔Toll样受体2、3、4基因（拟命名为RTLR2、R TLR3和RTLR4）的cDNA序列并进行测序,获得的3个Toll样受体基因序列长分别为128、150和139bp,并将其测序结果与GenBank中登录的穴兔（Oryctolagus cuniculus）的Toils核苷酸序列进行比对,发现本次克隆到的RTLR2与穴兔TLR2的基因序列（NM_001082781）相似性为99％,而RTLR3与TLR3（NM_001082219）和RTLR4与TLR4（NM_001082732）相似性均为100％。Protein Blast同源性结果显示,RTLR2、RTLR3和RTLR4的氨基酸序列与穴兔TLR2、TLR3和TLR4的同源性皆为100％,与马、人、野猪等其他8种动物TLRs的比较,与RTLR2同源性最高的是马的80％,其他的只有61％～78％;与RTLR3同源性最高是马和野猪的97％,其他也较高达93％～95％;而RTLR4与其他8种动物的同源性均较低75％以下。结果表明：RTLR2、RTLR3和RTLR4分别为免TLR2、TLR3和TLR4的部分cDNA基因序列;TLRs在不同物种的进化过程中存在种属特异性。     

三黄鸡TLR4基因的克隆及序列分析

为了解三黄鸡天然免疫受体TLR4基因的特点,本试验根据GenBank上已公布的其它品种鸡的TLR4基因序列设计引物,利用三黄鸡肝脏提取总RNA为模板,获得三黄鸡TLR4基因的cDNA全序列.基因序列分析表明,三黄鸡TLR4基因编码区全长2532 bp,编码843个氨基酸,N端含有30个氨基酸组成的信号肽,分子质量为95...     

鸭TLR2基因的克隆、序列分析及其结构预测

参考鸡Toll样受体2(TLR2)基因序列设计6对特异引物,采用PC R方法从鸭基因组中扩增得到鸭TLR2基因全序列。结果表明:克隆的鸭TLR2基因编码区全长2 382 bp,由1个开放阅读框组成,编码793个氨基酸,其中亮氨酸为14.2%,含有24个氨基酸的信号肽序列,属于I型跨膜受体,具有富含亮氨酸的重复序列(LR R)和Toll/IL-1R(TIR)同源区结构域;与鸡、人、猪、鼠和牛TLR2基因的同源性依次为80.0%、63.5%、61.4%、60.0%和58.4%,表明该基因是一个比较保守的基因。     

南阳黄牛TLR2基因扩增及序列分析

根据GenBank中发表的牛TLR2基因序列设计引物,通过PCR方法对南阳黄牛的TLR2基因进行分段扩增并测序,拼接后得到包含TLR2完整编码区以及5′端和3′端非编码区的2399bp的全序列。序列分析结果表明,南阳黄牛TLR2基因开放阅读框全长2 355bp,共编码784个氨基酸。南阳黄牛的TLR2基因编码区与荷斯坦牛的相比发生了16个碱基突变,其中9个发生在胞外区,2个发生在跨膜区,5个发生在胞内区,没有引起氨基酸的改变。与GenBank已发表的其他动物TLR2基因参考序列进行比较,结果显示南阳黄牛与荷斯坦牛、野牛、水牛、山羊、绵羊、猪、大猩猩和人的同源性分别为99.3%、99.3%、98.0%、96.3%、95.5%、85.4%、83.2%和83.1%。TLR2N末端存在信号肽且可能在21位氨基酸处存在裂解位点,蛋白分子结构预测TLR2蛋白含1个跨膜结构域。     

PRRSV GP2a胞外区的原核表达及免疫原性分析

为获得有活性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)BJ-4株GP2a胞外区蛋白,以真核质粒pcDNA3.1-ORF2为模板,设计针对GP2a胞外区(41-208aa)的特异性引物,通过PCR等方法,获得重组表达质粒pET-32a-eORF2,转化宿主菌Rosetta(DE3),并用1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。SDS-PAGE结果表明,重组的GP2a胞外区蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约36 000;将包涵体纯化、复性后,以50μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,三免后,抗体效价达1∶102 400;这表明GP2a胞外区成功表达,且具有良好的免疫原性。     

绿头鸭线粒体DNA控制区全序列测定及分析

用PCR产物直接测序法,获得5只绿头鸭线粒体DNA控制区(D-loop)全序列。序列分析显示:绿头鸭D-loop区全长为1051bp,碱基A、G、T、C含量分别为27.97%、15.51%、25.21%、31.30%,A+T含量大于C+G;共检测到11个多态位点,其中转换10个,颠换1个,没有发现插入和缺失,核苷酸多样度为0.0046。结合GenBank已公布河鸭属鸭类D-loop区序列,基于邻接法和最小进化法构建河鸭属鸭类系统进化树。结果表明,绿头鸭、斑嘴鸭及家鸭三者关系密切,它们共同构成进化枝A,推测在家鸭的形成过程中,绿头鸭和斑嘴鸭都作出了贡献;其它河鸭类聚为进化枝B。     

绿头鸭线粒体DNA控制区全序列测定及分析

用PCR产物直接测序法,获得5只绿头鸭线粒体DNA控制区(D-loop)全序列.序列分析显示:绿头鸭D-loop区全长为1051bp,碱基A、G、T、C含量分别为27.97%、15.51%、25.21%、31.30%,A+T含量大于C+G;共检测到11个多态位点,其中转换10个,颠换1个,没有发现插入和缺失,核苷酸多样度为0.0046.结合GenBank已公布河鸭属鸭类D-loop区序列,基于邻接法和最小进化法构建河鸭属鸭类系统进化树.结果表明,绿头鸭、斑嘴鸭及家鸭三者关系密切,它们共同构成进化枝A,推测在家鸭的形成过程中,绿头鸭和斑嘴鸭都作出了贡献;其它河鸭类聚为进化枝B.     

三黄鸡TLR21基因启动子区的克隆与序列分析

为了对三黄鸡TLR21基因启动子区序列进行遗传特征分析,试验采用酚-氯仿抽提法提取鸡肉组织DNA,设计引物扩增TLR21基因启动子区部分序列,进行单核苷酸多态性检测,并与京白939、来亨鸡、海兰褐壳蛋鸡、农大褐3号、白羽乌骨鸡等5个品种鸡进行对比。结果表明:三黄鸡的TLR21基因启动子区序列与其他5个品种鸡的对应序列同源性达到99%以上,在第46,94,130,150,200,220,1 216位出现单核苷酸多态性;三黄鸡与来亨鸡亲缘关系最近,与农大褐3号亲缘关系最远。     

巴马香猪TLR2基因cDNA的克隆及生物信息学分析

利用NCBI公布的TLR2基因序列设计引物,RT-PCR克隆巴马香猪(Sus barbatus)TLR2基因。核酸序列分析表明,巴马香猪TLR2基因开放阅读框长2358bp,编码785个氨基酸,该蛋白等电点为7.52,相对分子质量为89480;与普通猪比对发现,巴马香猪TLR2基因有15个碱基发生突变;与小鼠、狗、鸡、牛、羊和人的同源性分别为73.4%,82.4%,59.5%,85.3%,84.6%,82.4%。TLR2膜外区蛋白为背侧多个α螺旋和内侧多个β折叠平行交替排列构成一个弯曲状螺旋结构;N末端存在信号肽,且可能在21～22位氨基酸处存在裂解位点;胞外区有4个明显的LRR,分别位于第76～99、360～385、413～432和457～476位氨基酸区;膜外区含6个N连接的糖基化位点。     

鲤鱼外周血白细胞TLR5M全长cDNA克隆及序列分析

本试验以鲤鱼TLR5M的EST序列为基础进行5'-RACE试验,获得了其cDNA的全长序列。结果表明,该序列共3182 bp,包含38 bp的5'端非编码区,486 bp的3'端非编码区,1个2658 bp的开放阅读框(ORF),共编码885个氨基酸。序列同源性比对结果表明,该序列与麦瑞加拉鲮鱼TLR5基因同源性高达84.46%。     

水牛TLR2cDNA的克隆与生物信息学分析

本研究通过RT-PCR分段扩增得到水牛Toll样受体2(TLR2) cDNA序列,并利用亚克隆重叠区进行全长序列拼接.将拼接产物与pMD20-T栽体连接,重组质粒经PCR酶切鉴定后测序,并进行生物信息学分析.结果表明,克隆得到的序列全长2 455 bp,含有一个大小为2 355 bp的开放阅读框,共编码784个氨基酸,...     

乌苏里貉TLR8基因的分子克隆、序列分析及组织表达分析

为了解乌苏里貉TLR8基因特点及其在不同组织中的表达水平,本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆其c DNA全长序列,应用生物学软件分析该基因及预测其编码蛋白的特征,并对该基因在乌苏里貉不同组织中的表达水平进行检测。结果显示该基因全长3 191 bp,ORF全长3 117 bp,编码1 038 aa,含有Toll-like受体家族典型的结构域特征。同源性分析显示乌苏里貉TLR8基因核苷酸序列与犬同源性最高,达99.3%,与其他食肉目哺乳动物也具有较高的同源性,在89.2%~92.9%。组织表达分析显示TLR8基因在乌苏里貉各组织中广泛表达但表达量存在差异。本研究结果为进一步研究乌苏里貉抗病毒免疫及育种相关研究奠定了基础。     

奶牛白细胞介素2基因的克隆及序列分析

根据GenBank发表的奶牛白细胞介素2(IL-2)基因序列,设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增奶牛IL-2基因,琼脂糖电泳显示扩增出的片段约为477bp。回收片段,克隆入pMD18-T载体,经菌落PCR、酶切及重组质粒PCR鉴定,测序结果显示,克隆的奶牛IL-2基因与GenBank发表的奶牛IL-2基因序列同源性为98.7%。该序列与水牛和山羊的IL-2基因序列同源性最大,在95%以上;氨基酸和抗原性比较分析显示,奶牛的IL-2与山羊及水牛的IL-2在这两方面有较高的同源性。     

水牛FADS2基因的电子克隆及序列分析

试验旨在利用电子克隆法对水牛Δ6脂肪酸脱氢酶（Δ6-fatty acid desaturases,FADS2）基因进行克隆和生物信息学分析,为探究FADS2基因对水牛泌乳性能的作用机制奠定基础。以奶牛FADS2基因序列（GenBank登录号：NM_001083444.1）为探针设计引物,利用电子克隆法克隆水牛FADS2基因,并通过RT-PCR验证,对FADS2基因的序列特征进行生物信息学分析。测序结果表明,水牛FADS2基因序列全长为36 600 bp,由12个外显子和11个内含子组成,包含一个长1 335 bp的开放阅读框,可编码444个氨基酸。序列同源性分析显示,水牛FADS2基因编码序列与牦牛、黄牛、人、猪、家兔、虎鲸和褐家鼠序列的同源性分别为98.88%、98.88%、89.66%、90.79%、90.85%、92.35%和87.11%。蛋白质预测分析表明,水牛FADS2蛋白分子质量为52.51 ku,理论等电点（pI）为8.75,呈弱碱性,属于亲水性蛋白,无信号肽。系统进化树分析结果表明,FADS2基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性,其中水牛与牦牛、黄牛亲缘关系较近,与褐家鼠亲缘关系较远。水牛FADS2基因的成功克隆为今后阐明水牛泌乳性能的作用机制奠定了基础。     

隆林山羊ACSS2基因的克隆及序列分析

根据藏系绵羊的ACSS2基因序列设计克隆引物,并以隆林山羊肌间脂肪组织为模板克隆ACSS2基因并测序。利用在线生物信息学软件分析ACSS2蛋白的序列特性,分析不同物种间ACSS2基因的进化关系及三级结构,从而预测隆林山羊ACSS2基因的功能。结果发现,隆林山羊ACSS2基因CDS全长2 103bp,由18个外显子组成,编码701个氨基酸残基。与牛(NM_001105339)、人(NM_018677)、绵羊(XM_012114899)、小鼠(NM_019811)序列的ACSS2基因相比较,核苷酸相似性分别为97.9%、91.5%、97.6%和88.2%,氨基酸的相似度分别为98.4%、93.6%、97.4%和91.9%。其中绵羊较山羊多出13个氨基酸(G279-Q291,GKPKEKPKHIRPQ)。隆林山羊ACSS2蛋白与其他物种间具有相似的三级结构系统,且与绵羊和牛具有较近的亲缘关系,而与猪的亲缘关系较远。     

PCV-2海南株ORF2基因的克隆及序列分析

为了研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)ORF2基因的分子特征,试验采用PCR方法从疑似圆环病毒感染的猪组织病料中扩增ORF2基因(大约730 bp),将纯化后的PCR产物克隆入p MD18-T载体,筛选鉴定后进行序列测定。结果表明:克隆的PCV-2海南株ORF2基因与来自国内的GZ株的核苷酸序列及推导氨基酸序列相似性最高,分别达到99.6%和99.6%;与疫苗株SH的核苷酸序列相似性为98.9%,推导的氨基酸序列相似性为98.7%;而与疫苗株LG的核苷酸序列相似性为91.3%,推导的氨基酸序列相似性为90.6%。     

鸭TLR3基因胞外区的原核表达及抗体制备

采用PCR方法扩增鸭TLR3基因胞外区,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导后,表达重组TLR3蛋白,并从包涵体中纯化重组蛋白。结果显示,PCR扩增得到972 bp的TLR3基因胞外区,用纯化的重组TLR3蛋白免疫实验兔,制备TLR3的多克隆抗体,用Western blot和ELISA检测其特异性及效价。本研究成功表达了TLR3基因胞外区,用该蛋白免疫实验兔后,制备的多抗能与TLR3特异性反应。     

绿头鸭Cytb基因全序列测定及其系统地位分析试验

为了给河鸭属野鸭的系统地位研究提供分子水平依据,试验采用PCR产物直接测序的方法,检测得到4只绿头鸭线粒体Cytb基因全序列.序列分析结果显示,4只绿头鸭Cytb基因序列完全相同,其碱基A、G、T、C含量分别为26.86%、13.91%、24.23%、35.00%,A+T含量约大于G+C含量.结合GenBank中已公布的河鸭属野鸭Cytb基因序列,基于邻接法(N-J法)和最小进化法(ME法)构建河鸭属野鸭系统进化树,结果表明12种河鸭可分为3个进化枝,绿头鸭与斑嘴鸭、棕颈鸭、针尾鸭、绿翅鸭属同一进化枝.     

基因外显子2的克隆与序列分析

 本研究对高繁殖力的山羊品种济宁青山羊和低繁殖力的山羊品种内蒙古绒山羊共20只母羊的骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15, BMP15）基因第2外显子的扩增产物进行了克隆测序及序列比较分析。结果表明：BMP15基因第2外显子的第3对引物扩增片段存在多态。济宁青山羊与内蒙古绒山羊相比，其BMP15基因外显子2差异由2个核苷酸和2个氨基酸改变组成，核苷酸同源性为99%。济宁青山羊与鸡、小鼠、人、猪、牛、绵羊之间BMP15基因外显子2的核苷酸序列同源性为71%～99%，氨基酸序列同源性为43%～99%。     

弓形虫DOC2基因C-端的克隆及序列分析

为研究弓形虫DOC2基因作为弓形虫疫苗候选抗原分子的可行性,本试验用RT-PCR技术扩增DOC2基因编码区的C-端并测序。将该基因片段用生物信息学软件翻译为氨基酸序列后,预测弓形虫DOC2蛋白C-端的生物学特性、高级结构和B细胞抗原表位。结果表明,DOC2基因C-端片段长度为1887 bp。将其翻译成氨基酸序列后预测含有11个亲水区域和7个跨膜区。二级结构中含有19个α-螺旋、1个β-转角和17个无规则卷曲。结合柔性区域等分析,DOC2蛋白C-端共含有12个线性B细胞抗原表位。结果表明DOC2蛋白C-端可作为弓形虫疫苗候选分子,为研制新型弓形虫DNA疫苗或表位肽疫苗提供理论基础。