温度和药剂胁迫下黄翅绢野螟实时荧光定量PCR内参基因筛选

为筛选黄翅绢野螟(Diaphania caesalis)逆境胁迫下稳定表达的内参基因,使该虫抗逆基因的定量表达分析标准化.本研究根据黄翅绢野螟成虫转录组注释结果,利用qPCR技术分析了9个分别编码ACT、β-TUB、GAPDH、G6PDH、RPS3a、RPL13a、EF1α、EIF4A、/3-ACT的候选内参基因在温度...     

二化螟实时荧光定量PCR内参基因筛选和表达稳定性评价

【目的】筛选特定试验条件下二化螟(Chilosuppressalis)稳定表达的内参基因,为二化螟基因表达研究奠定基础。【方法】根据二化螟转录组测序结果挑选出11个候选基因,利用实时荧光定量PCR测定其在二化螟不同发育历期、不同组织、温度处理、杀虫剂处理、取食不同饲料、取食不同水稻、dsRNA处理和混合样品的表达量,利用RefFinder、BestKeeper、Ge Norm和NormFinder等软件和ΔC_t值对11个候选基因的稳定性进行评估。【结果】5种分析方法表明,在二化螟不同发育历期稳定性较高的内参基因是AK、RPL10和EF1,不同组织中稳定性较高的内参基因是EF1、TUB和ACTB,不同温度下较稳定的内参基因为TUB、RPL10和EF1,杀虫剂处理样品中较稳定的是TF4和ACTA,取食不同饲料较稳定的是TUB、TF4、EF1和RPL10,取食不同品种水稻较稳定的是TUB和EF1,dsRNA处理样品中较稳定的是TUB、AK、ACTB和EF1,混合样品中较稳定的是EF1、TUB和ACTB。【结论】为不同试验条件下选择合适的内参基因提供了参考,也有利于在二化螟基因表达研究中获得更加可靠准确的数据。     

铝胁迫下橡胶苗实时荧光定量PCR内参基因的筛选

铝毒是热带地区酸性土壤上抑制作物生长的主要因素,但目前关于铝活化后对橡胶树生长和产胶的影响及橡胶树耐铝机制的研究很少。为了筛选出橡胶树在铝毒胁迫下稳定表达的内参基因用于实时荧光定量PCR分析,本研究选择了Actin、Actin7、18S rRNA、40S rRNA、YLS8、UBC2、UBC4、GAPDH、FP和ADF等10种常见的基因作为候选内参基因,通过qRT-PCR检测,利用内参基因评价软件geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Ct算法以及综合评价软件RefFinder对10个候选内参基因的表达稳定性进行评估。综合评价结果表明,铝胁迫后表达稳定性排名前3的内参基因依次分别为UBC4、40S rRNA和FP。进一步选取UBC4、40S rRNA、FP基因和UBC4+40S rRNA+FP基因组合以及稳定性较差的GAPDH基因作为内参基因对橡胶树铝诱导苹果酸分泌转运蛋白基因HbALMT-1和HbALMT-2进行相对表达分析,结果显示2个目的基因相对于3个内参基因及其组合均显示出一致的表达水平,而稳定性较差的内参基因GAPDH未能准确地对目的基因的表达量进行校正。综上所述,筛选出UBC4、40S rRNA和FP基因以及UBC4+40S rRNA+FP基因组合可作为铝毒胁迫不同天数下表达最稳定的内参基因,可用于铝毒胁迫下橡胶树相关基因的表达分析。     

澳洲坚果实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

澳洲坚果是重要的热区经济作物,目前国内外尚无关于澳洲坚果实时荧光定量PCR分析内参基因的报道。选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析准确性的先决条件。为筛选澳洲坚果实时定量PCR最适内参基因,以澳洲坚果的根、茎、叶、果皮、果仁为材料,利用实时荧光定量PCR技术,对18S rRNA,Actin,CYP,EF1a,EF1b,GAPDH,MDH,TUBa,TUBb,UBQ,UBC等11个常用的内参基因在澳洲坚果不同组织中的表达稳定性进行了分析。geNorm软件分析的最适内参基因数目为2,最稳定内参组合为MDH和EF1b,TUBa基因的稳定性最差。BestKeeper分析结果认为,MDH基因表达最稳定,EF1b次之,与geNorm结果一致。NormFinder软件稳定性分析显示,GAPDH最稳定,其次是CYP基因;TUBa基因表达最不稳定。ΔCt算法结果表明,18S基因表达最稳定,其次是GAPDH基因,MDH和EF1b排第3和第4。RefFinder综合排序为：MDH>18S>GADPH>EF1b>CYP>UBC>EF1a>Actin>TUBb>UBQ> TUBa。因此,MDH基因在澳洲坚果不同组织中表达最稳定,初步确认可以作为实时荧光定量PCR分析的校正内参基因,在澳洲坚果的基因表达模式分析中具有重要意义。     

不同氮处理茶树实时定量PCR内参基因筛选和验证

为筛选不同氮处理下茶树(Camellia sinensis)实时荧光定量PCR(q RT-PCR)试验体系中最佳内参基因,以茶树幼叶、成熟叶和幼根为材料,应用qRT-PCR分析GAPDH、18S rRNA、β-actin、RPL13、a-tubulin、Ru BP等6个内参基因在不同氮浓度和氮源处理下的表达变化,借助GeNorm和NormFinder程序对候选内参基因稳定性进行评价。结果表明,在不同氮浓度和氮源处理下,GAPDH、b-actin和RPL13表达稳定性较好,GAPDH+β-actin组合稳定性最佳,可用作茶树基因表达研究的内参基因;而a-tubulin和RuBP表达稳定性较差,不适合做内参基因。为进一步证实上述结果,分别以GAPDH、a-tubulin、GAPDH+β-actin组合为内参基因,分析茶树幼叶中硝酸根转运蛋白基因(CsNRT1.2)和铵根转运蛋白基因(Cs AMT1.1)的表达水平,发现以GAPDH和GAPDH+β-actin组合为内参基因时,目的基因的相对表达量随处理时间延长变化规律基本一致;而以a-tubulin为内参基因时,目的基因的变化规律与前两者存在明显差别。因此,根据特定试验体系选择合适的内参基因对于qRT-PCR定量结果的准确性和可靠性具有重要意义。     

大豆胞囊线虫侵染下野生大豆根组织实时定量PCR分析中内参基因的筛选

以高抗和高感HG 0大豆胞囊线虫的野生大豆种质为试验材料,采用q RT-PCR技术检测了ACT11(Glyma.18G290800)、Tubulin-motif(Glyma.19G194800)等24个候选持家基因在不同大豆胞囊线虫侵染时期(接种后9,15和20 d)野生大豆根系中的基因表达情况,除Actin(Glyma.08G182200)出现了非特异扩增外,其它23个持家基因的q RT-PCR扩增效果均理想,扩增特异性高。分析上述23个持家基因的表达丰度,并利用Best Keeper、ge Norm和Normfinder对其表达稳定性进行评价。结果表明:持家基因间的表达丰度不尽相同,而且有些持家基因在不同品种间或不同处理间(接种虫卵和接种水)也存在表达丰度的差异。23个持家基因的表达稳定性也不相同,综合来看,表达最不稳定的基因为Cons9(Glyma.10G152200)、Cons2(Glyma.17G138500)、Cons1(Glyma.15G270900)和Tubulin-motif(Glyma.20G136000),本试验条件下它们不适宜作内参基因;其余持家基因相对稳定,本试验条件下可选择Tubulinmotif(Glyma.15G132200),Cons6/SKIP16(Glyma.12G051100)或Tubulin-motif(Glyma.05G110200)作为内参基因,它们表达量较高,表达最为稳定,其Ct平均值分别为25.7、26.5和25.0,标准偏差分别为0.540、0.575和0.490,ge Norm软件评价其稳定性的M值分别为0.698、0.715和0.727。该研究为野生大豆抗胞囊线虫相关基因的表达分析提供了参考。     

白银豆2个内参基因片段的克隆与初步分析

以白银豆幼苗为研究对象,克隆2个常用候选看家基因肌动蛋白基因(actin)和18S rRNA的片段,并应用半定量RT-PCR技术分析它们在不同组织及低温处理叶片中的表达.结果表明,各样本间的表达量无显著差异,说明actin和18S rRNA可用于校正白银豆目标基因的表达量.     

茶树低温胁迫下microRNA实时定量PCR内参基因的筛选

MicroRNA（miRNA）在基因的转录后调控上起到重要作用,对其表达水平的定量研究已成为一种常见实验,选择合适的内参基因是确保实时荧光定量PCR（qRT-PCR）准确性的先决条件。本研究以茶树为材料,挑选了9个候选内参基因,用qRT-PCR技术检测它们在不同样本中的表达量,采用BestKeeper和geNorm软件进行表达稳定性综合分析。结果表明,一种茶树新miRNA（PC-3p-222）在不同低温处理以及不同茶树组织中表达最为稳定,Ct平均值为22~23,丰度适中,可以作为茶树低温胁迫下miRNA qRT-PCR的内参基因,为miRNA定量研究工作提供参考。     

禾谷缢管蚜羧酸酯酶基因cDNA片段的克隆与序列分析

为开展禾谷缢管蚜（Rhopalosiphum padi Linnaeus）抗性的分子生物学研究,设计简并引物并采用RT—PCR技术,克隆了长度分别为260、331、337bp的3个禾谷缢管蚜的羧酸酯酶cDNA片段,命名为Rp．est1、Rp．est2、Rp．est3;3个片段推导氨基酸残基分别为87、110、112个;同源性分析表明,Rp．estl、Rp．est2、Rp．est3之间的相似性在40％左右,表明其分别代表不同基因;Rp．est1、Rp．est2、Rp．est3与其他昆虫羧酸酯酶基因序列具有较高的相似性,其GeneBank登录号分别为AY622997、AY869713、AY869714。     

实时荧光定量PCR筛选稻曲病菌内参基因

 通过实时定量PCR分析了稻曲病菌中5个传统内参基因18S rRNA、GAPDH、ubiquitin、β actin、α tubulin的mRNA差异表达情况,并利用geNorm软件分析了它们在4个发育时期和NaCl胁迫处理中的表达稳定性。结果表明,在菌龄为7 d、8 d、9 d、10 d的稻曲病菌中,α tubulin 2和β actin表达稳定;在0.4 mol/L  NaCl溶液处理0 h、4 h、8 h、12 h、16 h后,β actin和α tubulin 2表达稳定。因此,当利用荧光定量PCR分析比较稻曲病菌基因表达差异时,可选择α tubulin和β actin作为内参基因。     

橡胶树树皮miRNA定量表达分析的内参筛选

世界所需天然橡胶主要来自橡胶树，橡胶树的乳管是合成和储存天然橡胶的组织，树干树皮中的次生乳管与天然橡胶生产密切相关，由维管形成层分化而来。次生乳管数量与天然橡胶产量呈显著正相关。因此，乳管分化是天然橡胶生产面临的一个重大理论课题。植物miRNAs是一类长约20~24个核苷酸的非编码小RNA分子，通过介导基因沉默在植物生长发育、细胞分化及逆境适应中起着非常重要的调节作用。橡胶树乳管分化过程中差异miRNAs的鉴定对于进一步认识乳管分化的分子机理具有重要的作用。实时荧光定量PCR（qPCR）已广泛用于miRNA的定量表达分析，选择合适的miRNA内参对于准确进行miRNA的表达定量至关重要。本研究以冠菌素（coronatine, COR）诱导橡胶树萌条分化次生乳管的实验系统，采用小RNA Poly A加尾的qPCR技术分析COR处理对形成层区3个非编码RNA（U6 snRNA、5S rRNA、18S rRNA）和6个miRNA（hbr-miR159b、hbr-miR396b、miR169-x、miR172-y、miR535-x、miR894-x）候选内参的表达稳定性的影响。geNorm和NormFinder软件的联合分析结果显示，表达稳定性最高的是hbr-miR396b和miR894-x，稳定性较差的是U6 snRNA。hbr-miR396b和miR894-x可作为合适的内参基因，用于分析COR影响下的miRNA相对定量表达，为鉴定橡胶树次生乳管分化相关的差异表达miRNAs奠定良好基础。     

六点始叶螨内参基因筛选及其在超氧化物歧化酶基因EsSOD表达分析中的应用

为了筛选稳定内参基因分析六点始叶螨超氧化物歧化酶基因EsSOD的表达量,本研究采用geNorm、Bestkeeper、Normfinder和RefFinder软件分析6个候选内参基因actin、gapdh、rpl13、α-tub、β-tub和18sRNA在六点始叶螨幼螨、前若螨、后若螨和雌成螨中的表达稳定性。结果表明,根据geNorm软件分析得出6个候选内参引物的稳定性从大到小的排序为：actin>β-tub>rpl13>α-tub>gapdh>18sRNA;根据NormFinder软件分析得出的稳定性从大到小的排序为：rpl13>β-tub>actin>α-tub>18sRNA>gapdh;根据BestKeeper软件分析得出的稳定性从大到小的排序为：β-tub>rpl13> actin>gapdh>α-tub>18sRNA;最终根据RefFinder软件的综合分析结果,actin和β-tub是稳定性最佳的2个内参引物。分别以actin和β-tub为内参进行EsSOD基因表达量的RT-qPCR分析,结果表明,与取食感螨橡胶树种质‘IAN2904’后EsSOD表达量相比,不同龄期六点始叶螨取食抗螨橡胶树种质‘IRCI12’后EsSOD表达量均降低。本研究获得了可用于六点始叶螨EsSOD表达量分析的稳定内参引物,为橡胶树种质抗螨性分子机理研究奠定了理论基础。     

A New and Simple Method for Collecting Eggs of the Striped Stemborer,Chilo suppressalis

The method for collecting eggs of the striped stem borer, Chilo suppressalis using plastic bags was studied in comparison with using caged rice plants. There was no significant difference in fecundity of C. suppressalis at 279 eggs/moth and in percentage of hatched eggs at 95% between in plastic bags and on rice plants. More egg masses were collected on plastic bags than on rice plants, whereas more smaller egg masses (less than 100 eggs per mass) in plastic bags than on rice plants. The advantages in collecting eggs of C. suppressalis and other insects by using plastic bags were also discussed.     

A New and Simple Method for Collecting Eggs of the Striped Stemborer,Chilo suppressalis

The method for collecting eggs of the striped stem borer, Chilo suppressalis using plastic bags was studied in comparison with using caged rice plants. There was no significant difference in fecundity of C. suppressalis at 279 eggs/moth and in percentage of hatched eggs at 95% between in plastic bags and on rice plants. More egg masses were collected on plastic bags than on rice plants, whereas more smaller egg masses (less than 100 eggs per mass) in plastic bags than on rice plants. The advantages in collecting eggs of C. suppressalis and other insects by using plastic bags were also discussed.     

玉米ZmNRT关键基因挖掘以及氮响应基因共表达网络构建

以玉米自交系B73（V4版本）作为参考基因组,利用生物信息学方法鉴定玉米ZmNRT基因家族成员,从系统发育关系、GO（Gene Ontology）富集、基因结构和玉米不同时期及组织下的表达谱等方面全面解析玉米ZmNRT基因家族。基于qPCR实验和共表达网络分析,对玉米ZmNRT家族基因在氮响应中的作用进行系统的研究。结果表明,在玉米全基因组水平上共鉴定到 162 个 ZmNRT 基因,主要分为 ZmNRT1（62 个）和 ZmNRT2（100 个） 两大类群。GO富集发现,仅46个基因参与硝态氮转运过程,这些基因被不均等分成7个亚家族,每个家族1～15个基因。基因表达模式分析结果显示,不同生育期和组织下ZmNRT基因表达是差异的。在氮诱导下,qPCR鉴定结果显示,12个ZmNRT基因是氮响应基因,9个基因表达上调,3个基因表达下调。共表达网络结果发现,其中10个ZmNRT基因与已知的氮代谢基因存在显著共表达关系（|r|>0.8 p-value<0.05）,推测这10个基因可能是调控玉米氮代谢的关键基因。     

Cloning and expression analysis of kenaf (Hibiscus cannabinus L.) major lignin and cellulose biosynthesis gene sequences and polymer quantification during plant development

In order to apply state-of-the-art molecular breeding techniques in fibre crop it is necessary to have a good knowledge of major polymer biosynthesis gene sequences and their expression pattern. Polymerase chain reaction was employed to isolate sequences of the major genes for lignin and cellulose biosynthesis in a kenaf cultivar. CeSA, 4cl, c4h, cad, and ccr gene primers were designed according to their conservative regions; partial sequences of lignin and cellulose biosynthesis genes were obtained. One actin II gene sequence was also isolated from the kenaf genome as a housekeeping gene to be employed in qPCR analysis. Expression levels of genes c4h, cad and CeSA in bark and core from plants harvested at three different growth stages were evaluated. Using qPCR analyses it was found that the expression levels of the two biosynthesis lignin genes in bark tissues increased during plant growth, while a negative trend was recorded in core tissues. In both bark and core, the quantity of lignin was positively correlated to plant growth while cellulose content decreased.     

蝴蝶兰PhPP2Aa基因作为低温胁迫内参基因的研究

实时荧光定量PCR（qPCR）技术因其具有简单灵敏、准确高效等诸多优点,成为目的基因表达水平研究最常用的技术手段。而结果的可靠性取决于很多因素,其中使用合适的内参基因是qPCR技术最基本的应用前提。许多研究表明没有一种内参基因可以在任何条件下都能稳定地表达。目前尚未见到关于蝴蝶兰低温生长条件下最佳内参基因选择的有关报道。蛋白磷酸酶2A（PP2A）是真核生物体内一种主要的细胞内源丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。本研究根据蝴蝶兰低温转录组测序结果克隆得到1个PP2A的A亚基基因,其cDNA开放阅读框（ORF）长度为1764 bp,编码1个含有587个氨基酸的蛋白,将该基因命名为PhPP2Aa,GenBank登录号为MW847782。序列分析结果表明,该基因与其他植物PP2A核苷酸序列相似性均在80%以上,氨基酸序列与小兰屿蝴蝶兰PP2A序列相似性为99.66%。基于氨基酸序列进化分析结果表明,蝴蝶兰PhPP2Aa与小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛的亲缘关系最近。将蝴蝶兰PP2A与其他7种候选内参基因（TUA、TUB、ACTIN、F-box、RPL19、RPL36及RPL41）进行实时荧光定量PCR,用3种常用内参基因分析软件对各个基因Ct值进行稳定性分析,结果表明蝴蝶兰8个候选内参基因在低温胁迫条件下表达水平最稳定的内参基因为PP2A,其次为ACTIN;最不稳定的基因为F-box,其次为TUA。以蝴蝶兰PP2A作为内参基因探讨低温胁迫响应基因PhNAC1的表达情况,结果显示蝴蝶兰PhNAC1的表达模式符合低温胁迫条件下的表达特性。该结果表明蝴蝶兰PhPP2Aa基因可作为低温胁迫条件下目的基因转录水平研究的内参基因。     

橡胶树‘热研7-33-97’死皮相关研究的qRT-PCR内参基因筛选

在橡胶树死皮以及死皮康复相关研究中,为获得可靠的基因表达结果,筛选合适的内参基因显得尤为重要。本研究以‘热研7-33-97’健康树、三级死皮树和死皮康复树为试验材料,收集其中的胶乳,采用qRT-PCR技术,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper三种内参筛选软件,综合分析了20个候选内参基因在不同胶乳样品中的表达情况。结果表明：eif2、ACT7a、UBC2b在健康树中较稳定;UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b、ACT7b在三级死皮树中较稳定;UBC2b、eif2和ROC3在三级死皮恢复树中较稳定。选择胶乳代谢相关基因HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3对候选的内参基因进行验证,筛选出本研究中适合的一组稳定可靠的内参基因是eif2和UBC2b,其中ejf2是最佳内参基因,18S不适合作为本研究的内参基因。     

氟虫腈亚致死剂量处理对二化螟和大螟幼虫体内解毒酶系活力的影响

氟虫腈对二化螟Chilo suppressalis (Walker)和大螟Sesamia inferens (Walker)幼虫的LD50值各为0.1749 μg/g和10.1352 μg/g。经氟虫腈亚致死剂量（LD15）处理后,二化螟和大螟幼虫羧酸酯酶（CaE）和谷胱甘肽S 转移酶（GST）的比活力和最大反应速率（vmax）均显著增强,而多功能氧化酶（MFO）则显著降低。二化螟CaE和MFO的米氏常数（Km）经氟虫腈处理后均显著增高,而GST的无显著变化;大螟CaE、GST和MFO的Km均极显著降低。这表明氟虫腈在二化螟和大螟幼虫体内的代谢途径可能存在较大差异,而2种螟虫体内解毒酶对底物亲和力的不同可能导致两者对氟虫腈敏感性的差异。