过氧化氢诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的建立

本试验旨在利用过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)作为刺激源,以细胞存活率及抗氧化指标为判断指标,建立奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)的氧化损伤模型。试验一采用单因子完全随机试验设计,将第3代贴壁生长的BMEC随机分为42组,每组10个重复。细胞培养液中分别添加0、100、200、400、600、800和1 000μmol/L H2O2,使之分别作用2、4、6、8、12、24 h,测定细胞数量,计算存活率。试验二是在试验一得出的适宜H2O2作用时间(本试验的结果为6 h)的基础上,采用单因子完全随机试验设计,将第3代贴壁生长的BMEC随机分为7组,每组6个重复,BMEC中添加不同浓度的H2O2(0、100、200、400、600、800和1 000μmol/L)作用细胞6 h,收集细胞和培养液测定抗氧化指标,筛选使细胞发生氧化损伤的适宜H2O2作用浓度。试验一结果表明,600μmol/L H2O2作用细胞6 h,BMEC的存活率降低至79.79%。试验二结果表明,600~1 000μmol/L组与其他各组相比均显著降低了谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性,提高了丙二醛含量(P<0.05),但600、800和1 000μmol/L组之间差异不显著(P>0.10)。结果 提示,H2O2作用浓度为600μmol/L、作用时间为6 h,使BMEC产生了明显的氧化应激,可作为建立细胞氧化损伤模型时的适宜条件。     

小鼠卵巢颗粒细胞氧化应激损伤及对沉默信息调节因子2相关酶1信号通路的影响

本试验旨在通过探究不同浓度过氧化氢(H₂O₂)对小鼠卵巢颗粒细胞(MOGC)氧化应激损伤的影响,以构建MOGC氧化应激模型,并探究氧化应激损伤对沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)信号通路的影响。试验选用MOGC,采用单因素试验设计,分别用0(对照组)、100、200、400和800μmol/L H₂O₂处理24 h,测定细胞凋亡、细胞内活性氧(ROS)生成量、相关抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量以及凋亡相关基因表达。结果表明：1)与对照组相比,不同浓度H₂O₂组细胞活力均显著降低(P<0.05),当H₂O₂浓度大于200μmol/L并且作用时间超过24 h时,细胞活力低于50%。2)与对照组相比,不同浓度H₂O₂组细胞凋亡率显著提高(P <0.05)。3)与对照组相比,200、400和800μmol/L H₂O₂     

天门冬多糖对小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖的影响

本试验旨在研究天门冬多糖对小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖的影响。从正常小鼠分离脾脏淋巴细胞体外培养,在细胞培养体系中分别加入终浓度为50、100、200、400 mg/L天门冬多糖或配合刀豆素(5 mg/L)作用24、487、2 h,以MTT法测定细胞的增殖程度。结果表明,天门冬多糖可显著促进体外培养的小鼠脾脏淋巴细胞增殖,并与ConA有协同作用。     

过氧化氢诱导斜带石斑鱼原代肝细胞氧化损伤模型的构建

本试验以斜带石斑鱼原代培养肝细胞为研究对象,以过氧化氢为刺激源,以肝细胞存活率和抗氧化指标的变化为判断指标,旨在建立稳定的斜带石斑鱼原代肝细胞氧化损伤模型。在原代肝细胞培养液中分别添加0(对照)、100、200、400、600、800和1 000μmol/L过氧化氢,使之分别作用2、4、6、8、12和24 h,共42组,每组10个重复,测定肝细胞存活率。在得出适宜过氧化氢作用时间的基础上,使每个浓度的过氧化氢(每个过氧化氢浓度设6个重复)作用于肝细胞适宜时间后,收集肝细胞和培养液测定抗氧化指标,筛选使肝细胞发生氧化损伤的适宜过氧化氢作用浓度。结果显示:800μmol/L过氧化氢作用肝细胞8 h,斜带石斑鱼肝细胞的存活率降低至61.98%;800和1 000μmol/L组与其他各组相比,肝细胞超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶(600μmol/L组除外)和过氧化氢酶活性显著降低(P0.05),丙二醛与脂质过氧化物含量显著升高(P0.05),但800和1 000μmol/L组之间差异不显著(P0.05)。以上结果表明,过氧化氢作用浓度为800μmol/L、作用时间为8 h,可作为建立斜带石斑鱼肝细胞氧化损伤模型的适宜条件。     

载牛乳铁蛋白肽-壳聚糖纳米粒对过氧化氢诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的保护作用

本试验以载牛乳铁蛋白肽-壳聚糖纳米粒(BLfcin-NPs)为添加剂,研究其对过氧化氢(H₂O₂)诱导的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)氧化损伤的保护作用。采用单因素完全随机试验设计,以BMECs为模型,采用不同浓度[0(对照组)、100、200、400、600、800、1 000μmol/L] H₂O₂对BMECs分别处理0、2、4、6、8、12 h,确定构建BMECs氧化损伤模型的最佳H₂O₂浓度及作用时间。以500μg/mL的BLfcin-NPs预处理BMECs 12 h后用400μmol/L的H₂O₂处理6 h,检测BMECs内线粒体膜电位(MMP)、抗氧化指标以及抗氧化与凋亡相关基因mRNA相对表达量。结果显示：1)与0μmol/L H₂O₂处理的对照组相比,不同浓度H₂O₂作用6 h后显著或极显著降低BMECs活力(...     

紫茎泽兰多糖的免疫调节活性研究

紫茎泽兰是多年生草本或亚灌木。20世纪40年代由缅甸传入中国云南后,迅速在西南地区扩散,破坏了植物的群落结构、畜牧业生产和农业生产。通过研究紫茎泽兰提取物中的多糖成分,首次发现其具有免疫活性。为研究紫茎泽兰多糖(EAP)的免疫调节作用,试验用4个不同剂量的紫茎泽兰多糖50μg/m L,100μg/m L,200μg/m L和400μg/m L刺激人源(A549)细胞和鼠源(RAW264.7)细胞,分别作用12 h,24 h和36 h,用荧光定量PCR测定细胞因子白细胞介素(IL-6),肿瘤坏死因子(TNF-α),干扰素(IFN-β和IFN-γ)的表达情况,结果表明EAP浓度为200μg/m L,作用时间为36 h时这4种细胞因子的表达水平都较高。对于免疫佐剂的开发或免疫调节剂的研制具有重要作用。     

外源褪黑素对鹿茸软骨细胞生长发育的影响

试验旨在探讨褪黑素对体外培养的鹿茸软骨细胞增殖、周期及凋亡的影响。利用甲苯胺蓝、茜素红S、阿利新蓝染色鉴定软骨细胞,采用外源添加褪黑素的方法,用不同浓度(0、400、800、1 200、1 600和2 000 pg/mL)、不同时间(24、48和72 h)处理鹿茸软骨细胞,CCK-8法检测细胞增殖。选取800 pg/mL褪黑素处理软骨细胞24 h,利用流式细胞仪检测细胞周期的分布及细胞凋亡情况,采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中睾酮含量。结果显示,经不同浓度的褪黑素处理鹿茸软骨细胞不同时间后,800 pg/mL褪黑素处理鹿茸软骨细胞24 h细胞活力极显著增加(P0.01)。软骨细胞经褪黑素处理后,与对照组相比,褪黑素处理组细胞G1期比例显著降低(P0.05);G2期比例极显著增加(P0.01),细胞被阻滞在G2期;褪黑素处理组细胞早期凋亡率无显著变化(P0.05),晚期凋亡率显著下降(P0.05);ELISA检测睾酮分泌水平均显著上升(P0.05)。综上,外源添加800 pg/mL褪黑素可以促进鹿茸软骨细胞的增殖,抑制软骨细胞的晚期凋亡,促进睾酮的分泌;以上结果可为阐明褪黑素参与鹿茸生长发育机制提供参考。     

奶牛小肠上皮细胞氧化损伤模型的构建

本试验旨在构建奶牛小肠上皮细胞氧化损伤模型,为研究氧化应激状态下的肠道养分吸收机制提供平台和基础。采用不同浓度的H_2O_2(0、50、100、200、400、800μmol/L)处理奶牛小肠上皮细胞不同时间(2、4、6 h),用噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活率,氯化硝基四氮唑蓝(NBT)法测定细胞内活性氧(ROS)含量,比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。结果表明:与对照组相比,200μmol/L H_2O_2作用奶牛小肠上皮细胞2 h的细胞存活率(64.03%)显著降低(P0.05),细胞内ROS含量和培养液中LDH活性显著上升(P0.05),细胞内SOD和GSH-Px活性均显著降低(P0.05)。综上所述,200μmol/L H_2O_2作用奶牛小肠上皮细胞2 h,可构建奶牛小肠上皮细胞氧化损伤模型。     

表皮生长因子对成年水牛晶状体上皮细胞促增殖作用

为观察表皮生长因子 ( epidermalgrowth factor,EGF)对成年水牛晶状体上皮细胞增殖作用的影响。将不同浓度 EGF作用于体外培养的成年水牛晶状体上皮细胞 ,采用 MTT法测定细胞的增殖能力。结果 :EGF在浓度为 1ng/ m L和 1 0 ng/ m L作用的前 3 d促增殖作用逐渐加强 ,呈现时间依赖性 ,且在第 3 d达到最大促增殖效果。不同浓度的 EGF对晶状体上皮细胞的增殖作用不同 ,浓度在 1 0 ng/ m L作用 2 4h后即有明显的促增殖作用 ( P <0 .0 5) ,而作用72 h后最低的有效浓度为 1 ng/ m L,而且 2 50ng/ m L EGF有最大促增殖作用。结论 :EGF是诱导成年水牛晶状体上皮细胞增殖的重要因素。     

红景天提取物对肉鸡外周血白细胞免疫调节作用的研究

为了研究红景天提取物对肉鸡外周血白细胞免疫调节作用的影响,试验取3只健康雄性肉鸡分离外周血白细胞,以每孔1×106/m L接种于24孔细胞培养板,然后将红景天提取物(浓度分别调整至200,100,50,0μg/m L) 200μL加入24孔细胞培养板,37℃、5%CO2条件下培养24 h,离心后收集上清液,检测上清液中细胞因子和免疫球蛋白含量。结果表明:相比于不添加红景天提取物的对照,100μg/m L、200μg/m L红景天提取物显著提高了细胞上清液中IgG和IgM含量(P0. 05)。此外,100μg/m L红景天提取物相比于对照还显著提高了细胞上清液中IL-1β含量(P 0. 05),100μg/m L、200μg/m L红景天提取物显著提高了细胞上清液中IL-6和TNF-α含量(P0. 05)。说明红景天提取物能够促进肉鸡外周血白细胞免疫球蛋白和细胞因子的产生,改善肉鸡的免疫机能,但在100μg/m L内存在剂量依赖性。     

葎草黄酮对牛乳腺上皮细胞相关基因表达的影响

以奶牛乳腺上皮细胞为细胞模型,用MTT法检测细胞的存活和生长情况,用不同浓度的黄酮溶液(0、100、200、400、600、800mg/L)刺激奶牛乳腺上皮细胞12h,再用相同浓度的黄酮溶液(400mg/L)作用于奶牛乳腺上皮细胞不同时间(1、4、9、12、16、24h),分别提取细胞总RNA,用荧光定量PCR法测定GHR、β-CN、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ泌乳相关基因的表达,研究葎草提取物总黄酮对乳腺上皮泌乳及炎性相关因子表达的影响。结果表明,试验组与空白组相比,奶牛乳腺上皮细胞中IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-8的表达水平降低(P0.05);生长激素受体(GHR)、β-酪蛋白(β-CN)的表达量高于对照组(P0.05)。说明葎草黄酮能上调奶牛乳腺上皮细胞β-CN和GHR的表达量,以浓度为400mg/L培养4h~12h的效果最佳。     

白花蛇舌草提取物对肉鸡淋巴细胞增殖功能的影响

为了研究中药白花蛇舌草对肉鸡免疫力的调节作用,探讨其作用机理。在体外培养的肉鸡血液和脾脏淋巴细胞中加入不同浓度的白花蛇舌草水煎剂、粗多糖和总黄酮等成分,观测其对淋巴细胞增殖功能的影响。白花蛇舌草水煎剂、粗多糖和总黄酮分别在浓度为4 000 mg/L、1 000 mg/L~2 000 mg/L和5 mg/L~100 mg/L时对鸡血液淋巴细胞有明显的刺激增殖作用(P0.05),在浓度为200 mg/L~800 mg/L、10 mg/L~1 600 mg/L和25 mg/L~50 mg/L时对鸡脾脏淋巴细胞的增殖具有明显的刺激作用(P0.05)。研究结果说明白花蛇舌草水煎剂、粗多糖和总黄酮对体外培养的肉鸡淋巴细胞的增殖均有促进作用。     

壳寡糖对脂多糖诱导猪空肠上皮细胞氧化损伤的作用

本试验旨在通过脂多糖(LPS)诱导猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)来建立氧化应激模型,探讨壳寡糖(COS)的抗氧化作用效果。采用噻唑蓝(MTT)法检测LPS和COS对IPEC-J2作用12、24、48 h后细胞增殖活性的变化;选择适宜浓度LPS(1.0μg/m L)和COS(200μg/m L)作用于IPEC-J2,分为对照组、LPS组、COS组、LPS+COS组。采用Western Blot法检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)蛋白的表达;试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)的含量。结果表明:1.0μg/m L的LPS对IPEC-J2作用24 h,细胞增殖的抑制率为41.6%,为造模的最适浓度和作用时间;COS在一定浓度范围内对IPEC-J2有增殖作用,其浓度为200μg/m L时效果最佳,作用时间为24 h时,细胞增殖率达到126.3%。LPS+COS组较对照组的SOD、CAT活性和M DA含量差异不显著(P0.05),Nrf2和HO-1蛋白相对表达量显著升高(P0.05);LPS+COS组较LPS组的Nrf2蛋白相对表达量显著升高(P0.05),HO-1有升高趋势,但差异不显著(P0.05),SOD、CAT活性显著升高(P0.05),M DA含量显著降低(P0.05)。由此可见,LPS诱导IPEC-J2氧化应激,而COS可进一步促进Nrf2和HO-1蛋白的高表达,并提高抗氧化酶的活性,降低氧化产物含量,从而增强细胞对氧化应激的抵抗力,起到保护作用。     

不同浓度EPA和DHA对C2C12成肌细胞增殖及凋亡的影响

本试验旨在研究二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)对体外培养的C2C12成肌细胞增殖和凋亡的影响。用不同终浓度DHA和EPA(0、6.25、12.5、25、50、100μmol/L)分别作用C2C12细胞12、24、48 h后,用CCK-8法检测细胞的增殖情况;用不同终浓度DHA和EPA(0、50、100μmol/L)分别作用C2C12细胞48 h后,用TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果表明:终浓度为50、100μmol/L的EPA处理细胞48 h,C2C12细胞增殖能力受到显著抑制,但不同浓度DHA处理组细胞的增殖能力无明显变化。此外,EPA处理C2C12细胞后,TUNEL法显示凋亡细胞数增加,且100μmol/L的EPA处理组细胞凋亡最明显。然而,与对照相比,DHA处理组细胞无明显凋亡。上述结果表明,EPA能抑制C2C12成肌细胞增殖并促进其凋亡,而DHA对细胞增殖和凋亡无明显影响。     

呕吐毒素对IPEC-J2细胞凋亡的影响

本研究以IPEC-J2细胞为材料,研究不同浓度和时间处理下呕吐毒素(DON)对猪空肠上皮细胞凋亡的影响。通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖毒性,筛选出合适的DON作用时间(6、12、24 h)。通过低浓度(200 ng/mL)和高浓度(2 000 ng/mL)DON分别作用IPEC-J2细胞6、12、24 h,检测DON对细胞有丝分裂周期和细胞早期凋亡的影响。结果表明:1)DON对IPEC-J2细胞生长有明显抑制作用,200和2 000 ng/mL DON浓度下,48和72 h的细胞存活率显著低于24 h(P0.05);2 000 ng/mL DON浓度下,72 h的细胞存活率显著低于48 h(P0.05)。2)不同DON浓度对细胞周期影响不同,低浓度DON主要作用于细胞有丝分裂S期,干扰DNA的复制;而高浓度DON主要作用于细胞有丝分裂G2/M期,干扰有关酶与纺锤丝蛋白质的合成。3)DON作用6 h,低浓度DON组和高浓度DON组早期凋亡率和总凋亡率显著高于对照组(P0.05);DON作用12 h,高浓度DON组早期凋亡率和总凋亡率显著高于对照组和低浓度DON组(P0.05)。由此可见,DON抑制了IPEC-J2细胞增殖,低浓度DON使细胞有丝分裂停留在S期,高浓度DON使细胞有丝分裂停留在G2/M期。DON促使细胞早期凋亡,使总凋亡率上升,且促凋亡作用随DON浓度升高而增强。     

白藜芦醇通过沉默调节蛋白1-解偶联蛋白2信号通路降低小鼠睾丸间质细胞TM3的氧化损伤

本试验旨在研究白藜芦醇(RES)对氧化损伤小鼠睾丸间质细胞TM3的保护作用,并探索其可能的作用机制。首先,用不同浓度(0、150、200、250、300μmol/L)的过氧化氢(H2O2)处理小鼠睾丸间质细胞TM3 8 h,确定建立氧化损伤细胞模型的适宜H2O2浓度;然后,用不同浓度(0、2.5、5.0和10.0μmol/L)的RES分别处理正常细胞24 h,确定RES安全浓度;最后,用安全浓度的RES处理氧化损伤细胞24 h。在整个培养过程中采用i CELLigence实时无标记细胞功能分析仪监测细胞的增殖情况;待安全浓度的RES处理氧化损伤细胞结束后采用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针法检测细胞中活性氧(ROS)的含量,实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和蛋白质印迹(Western blotting)法分别检测沉默调节蛋白1(SIRT1)/解偶联蛋白2(UCP2)信号通路中关键因子SIRT1和UCP2 mRNA和蛋白质的相对表达量。结果表明:1)用浓度为150μmol/L及以上的H2O2处理细胞8 h后,极显著降低细胞存活率(P0.01),因此确定150μmol/L为建立氧化损伤细胞模型的适宜H2O2浓度。2)用10.0μmol/L及以下浓度的RES处理正常细胞24 h后,细胞存活率均无显著变化(P0.05);用2.5、5.0和10.0μmol/L的RES处理氧化损伤细胞24 h后,细胞存活率均显著提高(P0.05),且各浓度RES组间无显著差异(P0.05)。因此,选用5.0μmol/L为RES的安全浓度。3)用5.0μmol/L的RES处理氧化损伤细胞24 h后,细胞中ROS的含量极显著降低(P0.01);细胞中SIRT1 mRNA和蛋白质的相对表达量极显著增加(P0.01),而UCP2 mRNA和蛋白质的相对表达量则显著或极显著降低(P0.01或P0.05)。由此可见,适宜浓度的RES可激活SIRT1同时抑制UCP2的表达,UCP2通过负反馈调节方式减少细胞内ROS的生成,从而在一定程度上抑制TM 3细胞的氧化损伤。     

二乙烯三胺/一氧化氮聚合物诱导的奶牛乳腺上皮细胞损伤模型的建立

泌乳期间的奶牛由于代谢旺盛,往往会产生大量一氧化氮(NO),诱导发生氧化应激,进而对细胞产生毒害作用。本试验旨在探讨二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(DETA/NO)诱导奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)氧化应激的损伤条件,并建立氧化应激模型。本试验利用不同浓度(0、10、30、100、500、1 000μmol/L)的DETA/NO作为刺激源,作用BM EC 2、4、6、8、12、24 h,通过测定细胞存活率、抗氧化指标、炎症因子和NO含量及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)活性,筛选适宜的DETA/NO作用时间及作用浓度,建立BMEC氧化损伤模型。结果表明:1 000μmol/L的DETA/NO作用细胞6 h,细胞存活率降低为74.27%,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性也均显著降低(P0.05),然而,i NOS活性,NO、白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、丙二醛含量则呈现相反的变化规律,显著升高(P0.05)。综上所述,1 000μmol/L的DETA/NO处理细胞6h,可构建理想的BM EC氧化应激模型。     

咖啡酸对LPS诱导的犬子宫内膜上皮细胞活率下降的影响

通过研究不同浓度的咖啡酸对脂多糖(LPS)诱导的犬子宫内膜上皮细胞活率下降的影响,探讨咖啡酸的抗炎作用效果,为宠物临床治疗犬子宫内膜炎的新药研发提供依据。根据LPS剂量筛选试验确定LPS诱导炎症模型的浓度;通过咖啡酸药物毒性试验,根据抑制率IR≤10%,选择低、中、高3个咖啡酸剂量组;用噻唑蓝比色法(MTT)测定不同剂量组的咖啡酸对LPS诱导的细胞活率下降的影响。结果显示,50mg/L LPS作用于子宫内膜上皮细胞12h能够引起细胞活率的显著下降(P0.05);咖啡酸作用于子宫内膜上皮细胞12h后,与对照组相比,1μg/L~200mg/L组细胞活率均没有显著差异(P0.05),且IR10%,500 mg/L组有极显著性差异(P0.01),且IR40%;作用24h后,1μg/L~25mg/L组细胞活率没有显著差异(P0.05),IR10%,50~100mg/L组有显著差异(P0.05)且IR10%,200、500mg/L组有极显著差异(P0.01),IR50%;咖啡酸中剂量组(50mg/L)和咖啡酸高剂量组(100mg/L)对LPS引起的细胞的活率具有明显的提高作用。结果表明,咖啡酸对LPS诱导的子宫内膜细胞活力下降具有一定的保护作用,且在安全范围内,随着药物浓度升高,保护作用增强。     

湿生扁蕾乙酸乙酯提取物对乙醇诱导L02细胞氧化损伤的保护作用研究

研究湿生扁蕾乙酸乙酯提取物(GEE)对乙醇诱导人正常肝细胞(L02)氧化损伤的保护作用及其机制。用400μmol/L乙醇诱导L02细胞建立体外细胞氧化损伤模型,加入GEE 25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL作用24 h,采用MTT法检测细胞存活率;检测细胞培养上清液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、细胞内超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量的变化;DCFH-DA探针染色流式细胞仪检测细胞内ROS水平;DTNB-GR动力学循环法检测胞内还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量变化。结果表明,400μg/mL乙醇诱导L02细胞24 h可建立肝细胞氧化损伤模型。GEE在25～100μg/mL对L02细胞无损伤。与模型组比较,GEE中剂量、高剂量组能显著提高L02细胞存活率(P0.001);降低细胞上清液中ALT、AST含量(P0.001);使细胞内SOD活力显著提高(P0.001);MDA含量明显降低(P0.001);同时使细胞内ROS水平降低(P0.01)、GSH/GSSG比值提高(P0.001)。提示GEE对乙醇诱导的L02细胞损伤具有保护作用,其机制可能与其减轻氧化应激反应有关。