麦长管蚜电压门控钠离子通道基因克隆及序列分析

克隆获得麦长管蚜电压门控钠离子通道基因cDNA序列,明确其典型特征,为研究麦长管蚜抗性分子机理奠定基础。采用RT-PCR技术,克隆麦长管蚜钠离子通道基因cDNA序列,利用DNASTAR Lasergene 7.10软件对其序列进行分析。克隆得到两条cDNA序列SaNa_v1和SaNa_v2（GenBank登录号分别为MN176137和MN161584）,SaNa_v1序列长3423 bp,共编码1141个氨基酸;SaNa_v2序列长2874 bp,共编码958个氨基酸。同源比对发现,SaNav1与禾谷缢管蚜和桃蚜的第一部分钠离子通道基因相似度分别高达97.81%和97.91%;SaNav2与禾谷缢管蚜和桃蚜的第二部分钠离子通道基因相似性高达97.90%和96.43%。所克隆序列包含4个同源结构域,每个结构域6个跨膜片段（S1～S6）,存在钠通道选择性关键残基“DENS”。本文成功克隆了麦长管蚜中钠离子通道基因,为麦长管蚜钠离子通道抗性机制的研究提供依据。     

小麦抗叶锈病基因Lr38的RGA分析初报

小麦抗叶锈病基因Lr38位于中间偃麦草 (Agropyron intermedium)第7组的一条染色体上,是抗性很强的基因,国内外至今尚未发现对 Lr38有毒性的菌株,是一个应用潜力很大的抗病基因。通过对目前已克隆的抗病基因结构分析,大部分抗病基因存在一些保守区域,利用保守域序列设计简并引物,PCR扩增抗病基因相似序列(Re- sistance gene analogs,RGA),来进行抗病基因克隆是一条很好的途径。本研究根据已克隆基因的蛋白激酶类保守序列设计简并引物RAF3和RAR4,对TcLr38及感病亲本Thatcher进行PCR扩增,旨在明确与小麦抗叶锈病基因Lr38相关的蛋白激酶,为克隆Lr38奠定基础。     

二倍体及四倍体中抗叶锈病基因在双二倍体中的表达与抑制

 通过杂交将近缘植物中的抗病基因导入普通小麦是抗病育种的常用方法。在利用二倍体和四倍体杂交合成双二倍体小麦过程中, 二倍体或四倍体携带的抗叶锈病基因在双二倍体中大多数情况下可以完全表达或部分表达其固有的抗病性, 但部分抗叶锈病基因则不能表达。四倍体波斯小麦Ps5、Ps8和野生二粒小麦D s3含有相同的抗叶锈病基因LrPs (暂定名), 在双二倍体Am1、Am2、Am3、Am5和Am7中可以表达其抗病性, 但在Am4中不能表达;二倍体粗山羊草Ae37含有Lr41和未知基因, 但Lr41在双二倍体Am2中不能表达;四倍体硬粒小麦Dr147携带Lr23和未知基因, 在双二倍体Am6中不能充分表达。抑制基因的存在是导致抗病基因不能表达或部分表达的主要原因之-。抑制基因位于AB染色体组或D染色体组上, 其抑制作用对抗病基因和病菌致病类型具有专化性, 还可能受温度等环境条件和寄主遗传背景等因素的影响。遗传分析结果表明, 在常温下, 双二倍体Am1、Am2、Am3和Am5对叶锈菌致病类型DGS/HB的抗病性均由1对相同的隐性抗病基因LrPs (暂定名)控制, 与它们具有共同的四倍体亲本Ps5有关。Am4不具有苗期抗叶锈病基因, 但含有来自粗山羊草A e39的1对隐性抑制基因SuLrPs (暂定名), 可抑制Am1、Am2、Am3和Am5中隐性抗叶锈病基因的表达。对抗病抑制基因存在原因和遗传分析验证方法等进行了讨论。     

小麦抗叶锈基因Lr 38的AFLP标记

 小麦叶锈病是小麦的重要病害之一,几乎在所有小麦种植区都有发生,严重时可造成5%~15%甚至更大的产量损失^[1]。小麦抗叶锈基因Lr38发现位于中间偃麦草(Agropyron intermedium)第7组的一条染色体上,并被标定在6 DL上^[2],是抗性很强的抗叶锈病基因,国内外至今尚未发现对Lr38有毒性的菌株,是一个应用潜力很大的抗病基因。     

玉米大斑病菌CaM基因的克隆及三氟拉嗪的抑菌作用

 以玉米大斑病菌为材料,根据同源序列法分别进行了3'端和5'端的RACE扩增,获得了玉米大斑病菌钙调素基因cDNA全长。利用genomic walking技术获得了CaM基因启动子序列,该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如TATA-box、Spl、AP-2和TFⅡD)。Southem杂交结果表明,玉米大斑病菌CaM基因在基因组中以单拷贝形式存在。用CaM特异性抑制剂三氟拉嗪(trifluoperazine)处理玉米大斑病菌,发现其对孢子萌发和附着胞形成的抑制作用与浓度呈正相关,同一浓度下,抑制剂对附着胞形成的抑制作用大于对孢子萌发的抑制。推测CaM基因在玉米大斑病菌的致病过程中起着至关重要的作用。     

偃麦草属E染色体组特异SCAR标记对Lr19的特异性和稳定性研究

 小麦抗叶锈基因Lr19来源于长穗偃麦草,表现优良的抗叶锈性,国内外发现对Lr19有毒性的小麦叶锈菌菌株的报道较少。本研究以TcLr19和Thatcher亲本以及TcLr19×Thatcher F₂代单株构建的分离群体为材料,建立了与Lr19共分离的稳定的SCAR分子标记,命名为Y₁₉SCAR₉₈₂。对49个小麦抗叶锈近等基因系材料的稳定性检测结果表明,其重复性好且为Lr19特异的分子标记。对120个小麦品种检测的结果表明,该标记可有效应用于小麦抗叶锈分子辅助选择育种。     

一个小麦csAtPR5-类似基因的克隆、鉴定和表达分析

 小麦(Triticum aestivumL.)品系‘兰考90(6)’在2AL染色体臂上携带1个隐性抗白粉病基因,暂命名为PmLK906。以‘中国春’/‘兰考90(6)21-12’杂交F₃代纯合株系构建的抗、感cDNA池为探针进行小麦基因芯片杂交,结果表明与粗山羊草(Aegilops tauschii)csAtPR5类似的基因在抗病池中的表达量比感病池中约高2^4.2倍。随后,从‘兰考90(6)21-12’中成功克隆了一个2 125 bp的全长csAtPR5-类似基因cDNA序列,暂命名为TaAetPR5(GenBank登录号:EU082094)。TaAet-PR5与csAtPR5的cDNA序列有93%的相同。TaAetPR5编码1个由657个氨基酸组成的多肽,与csAtPR5有88%的相同。蛋白推导分析表明TaAetPR5的分子量为74.5 kDa,pI 6.82,可能是一个可溶性的球蛋白,存在于细胞核中的可能性是95%。接种小麦白粉病菌(Blumeria graminisf.sp.tritici)后12至72 h,‘兰考90(6)21-12’幼苗叶片中的TaAetPR5基因转录水平不断提高。感白粉病的‘中国春’中没有检测到TaAetPR5基因。     

桃蚜电压门控钠离子通道基因cDNA克隆及其生物信息学分析

克隆获得桃蚜电压门控钠离子通道基因cDNA序列，明确钠离子通道的典型特征，为研究桃蚜抗性分子机理奠定基础。采用实验技术主要有RT-PCR和PCR，克隆桃蚜钠离子通道基因cDNA序列，利用相关软件对其序列进行生物信息学分析。克隆得到两段cDNA序列MpNa_v-1（NCBI登录号：MN124170）和MpNa_v-2（NCBI登录号：MN176136）。MpNa_v-1长度为2945 bp，包括2877 bp的完整开放阅读框，共编码958个氨基酸；MpNa_v-2长度为3546 bp，包括3486 bp的完整开放阅读框，共编码1161个氨基酸。MpNa_v-1和MpNa_v-2共同组成桃蚜的钠离子通道α亚基，MpNa_v-1包含同源结构域Ⅰ和同源结构域Ⅱ，MpNa_v-2包含同源结构域Ⅲ和同源结构域Ⅳ。同源比对发现，桃蚜与豌豆蚜和高粱蚜钠离子通道基因相似度分别高达97.67%和97.65%，所克隆序列包含昆虫钠离子通道α亚基典型特征，具有MFM模块，并含有蚜虫类钠通道特有模块DENS。成功地克隆桃蚜钠离子通道基因，为阐明其对拟除虫菊酯类药剂产生靶标抗性的分子机制奠定基础。     

菲律宾稻瘟病菌生理小种中AVR-Pita及其同源基因的序列与功能分析

根据已克隆的AVR-Pita及其同源基因序列设计4对引物,对来自菲律宾的74个稻瘟病单孢菌株DNA进行PCR扩增和序列分析,研究了与水稻抗病基因Pi-ta互作的稻瘟病菌无毒基因AVR-Pita及其同源基因序列多态性与进化关系。结果显示,在42个菌株中扩增出AVR-Pita1基因目的条带,31个菌株中扩增出AVR-Pita3基因目的条带,55个菌株中扩增出AVR-Pita4基因目的条带,但所有供试菌株均未扩增出AVR-Pita2基因目的条带。对PCR产物进行测序分析,发现AVR-Pita1基因在菲律宾的生理小种中存在序列多态性,可划分为5个单倍型,共有10个多态性位点;AVR-Pita3和AVR-Pita4基因序列较保守,序列比对后没有发现多态性。对不同单基因系接种鉴定,发现除第3种AVR-Pita1单倍型外,含有AVR-Pita1单倍型1、2、4及5的生理小种均不能与Pi-ta基因互作,从而使Pi-ta单基因系IRBLta-CT2在接种后表现为感病。以上试验结果说明AVR-Pita1基因变异性较强,且序列改变后会导致基因功能的变化。     

白粉菌侵染后的拟南芥酵母双杂交cDNA文库构建及其利用

 拟南芥广谱抗病基因RPW8对拟南芥白粉病菌、霜霉病菌和烟草花叶病毒等均具有抗性。为了深入研究其广谱抗病机制,筛选鉴定与RPW8具有直接相互作用的蛋白,我们以含有RPW8的拟南芥纯合转基因系S5为材料,接种拟南芥白粉菌系UCSC1,36 h后取样,构建了白粉菌侵染初期的拟南芥cDNA文库。为了提高文库对长片段基因5′端的覆盖率,分别使用含有oligo(dT)和oligo(dN)的接头引物反转录cDNA第一链,PCR扩增双链cDNA。将纯化后的双链cDNA与线性化载体pGADT7-Rec混合,利用同源重组技术在酵母菌株Y187中构建cDNA文库。经检测,文库转化效率为5.0×10⁶/3 μg pGADT7-Rec,滴度为2.5×10⁸ CFU·mL^-1,插入片段长度在350～2 000 bp之间,平均插入片段大小为750 bp。用RPW8.1和RPW8.2构建诱饵载体,分别获得11和12个候选互作蛋白。结果表明此cDNA文库质量较好,适用于互作蛋白的筛选。     

小麦抗叶锈病基因近等基因系TcLr35基因表达差异研究

cDNA—AFLP技术结合了RT-PCR和AFLP技术,用于分析植物mRNA的表达差异。该技术保留了AFLP技术的可靠性与高效性,可广泛地应用于植物生长发育过程基因分离与表达特性的研究。小麦叶锈病是世界上影响小麦产量的重要病害之一,提高品种抗病性是防治该病害最经济有效的方法。在目前已发现的近90个抗叶锈基因中,有56个基因已被正式定名,其中有9个成株抗性基因和慢锈性基因,即Lr12、Lr13、Lr22a、Lr22b、Lr34、Lr35、Lr37、Lr48和Lr49。Lr35基因来源于拟斯卑尔托山羊草（Aegilops speltoides）,该基因位于2B染色体上,是一个十分有效的成株抗性基因。     

Lr46: a gene conferring slow-rusting resistance to leaf rust in wheat

ABSTRACT Wheat (Triticum aestivum) cultivar Pavon 76 carries slow-rusting resistance to leaf rust that has remained effective in Mexico since its release in 1976. 'Pavon 76' was crossed with two leaf rust-susceptible wheat cultivars, Jupateco 73S and Avocet S, and between 118 and 148 individual F(2) plant-derived F(3) and F(5) lines were evaluated for adult-plant leaf rust resistance at two field sites in Mexico during different seasons. Evaluation of F(1) plants and parents indicated that the slow-rusting resistance was partially dominant. Segregation in the F(3) and F(5) indicated that the resistance was based on two genes with additive effects. Monosomic analysis was carried out to determine the chromosomal locations of the resistance genes. For this purpose, two or three backcross-derived cytogenetic populations were developed by crossing 'Pavon 76' with a monosomic series of adult-plant leaf rust-susceptible cultivar Lal-bahadur. Evaluation of such BC(2)F(3) and BC(3)F(3) lines from 16 confirmed 'Lalbahadur' monosomics indicated that one slow-rusting gene was located in chromosome 1B of 'Pavon 76'. This gene, designated as Lr46, is the second named gene involved in slow-rusting resistance to leaf rust in wheat.     

一个二粒小麦LRR类受体蛋白激酶基因的克隆和鉴定

 Near the HMW-glutenin gene of wheat (Triticum aestivum), there is a locus (temporarily named TaXa) encoding LRR-receptor-like protein kinase, which is homologous to disease resistance protein Xa21 of rice (Oryza sativa). Through RT-PCR approach, a cDNA clone of ZS2002 was isolated from the orthologous locus of TaXa in Triticum turgidum. ZS2002 was 3 081 bp long and encoding a peptide composed of 1 026 amino acid. The protein included N-terminal conserved sequence, LRR domains, a transmembrane region and a serine/threonine protein kinase domain. ZS2002 was expressed in root, stem, leaf and spike. The transcribing in seedling leaves was significantly enhanced by Blumeria graminis f.sp. tritici. TaXa gene might play a role in powdery mildew resistance reaction in Triticum.     

国槐凝集素基因的克隆及其功能

植物凝集素是一类能高度特异可逆结合到单糖或寡糖上的蛋白,含有至少一个非催化结构域,近年来在农作物抗虫工程中得到了广泛关注。本文从豆科植物国槐中克隆得到了一个新的凝集素基因SjLectin并初步研究了其对小菜蛾的抗性功能。从国槐幼叶中提取总RNA,采用RT-PCR法分离克隆出SjLectin基因的cDNA片段,该基因在GenBank中登录号为KC140286.1。SjLectin基因全长837 bp,编码279个氨基酸组成的蛋白。该蛋白与其他豆科凝集素的同源性均高达66%以上,属于豆科凝集素家族中的一员。在35S启动子控制下,利用根癌农杆菌介导法转化烟草品种W38,获得了该基因的抗卡那霉素植株。通过PCR和RT-PCR法筛选阳性转基因植株,证明SjLectin基因已经转化到烟草基因组中并在转录水平上得到了有效表达。接虫试验证明,阳性植株对小菜蛾的抑制率平均达62.2%。     

玉米衰老相关蛋白基因ZmSAP的克隆与表达分析

利用立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)诱导胁迫下玉米高耐纹枯病自交系幼苗叶片所构建的cDNA文库中获得的EST序列,通过电子克隆和RT-PCR方法,结合cDNA末端快速扩增技术,从玉米叶片中分离克隆到衰老相关蛋白基因的全长cDNA序列,命名为ZmSAP(GenBank登录号:GU253311)。序列分析表明,ZmSAP全长1156bp,包含一个完整的603bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码200个氨基酸,相对分子量为21.92kD,等电点为10.38。该氨基酸序列与豌豆、挪威云杉、寄生藻等有不同程度的同源性且在不同物种间具有一个保守结构域,染色体定位发现该基因位于玉米第1条染色体上。荧光定量PCR分析表明,在高耐纹枯病自交系R15和高感纹枯病材料478中ZmSAP基因在病菌胁迫初期呈诱导表达,可能参与了病原菌诱导的细胞程序性死亡过程,说明该基因与纹枯病菌胁迫响应机制密切相关。     

Cloning and characterization of NBS-LRR encoding resistance gene candidates from Tomato Leaf Curl New Delhi Virus resistant genotype of Luffa cylindrica Roem

We employed degenerate primers to amplify nucleotide-binding site (NBS) domain of resistance gene candidates (RGCs) from Tomato Leaf Curl New Delhi Virus (ToLCNDV) resistant Luffa cylindrica (sponge gourd) genotype, DSG-6. Sixteen non-redundant sequences of RGCs were identified with un-interrupted open reading frames (ORFs) and high amino acid sequence homologies (60–98%) to various nucleotide-binding site leucine-rich repeat (NBS-LRR) proteins from GenBank database. Alignment of the deduced amino acid sequence and phylogenetic analysis of the NBS domain revealed six and ten sponge gourd (sg) RGCs belong to the Toll Interleukin Receptor (TIR) and non-TIR group of NBS-LRR genes, respectively. The sgRGCs consisted of conserved NB-ARC [homologous region shared with APAF-1 (apoptotic protease-activating factor-1), R proteins and CED-4 (Caenorhabditis elegans death-4 protein)] domain from P-loop nucleoside triphosphatase (NTPase) family and characteristic P-loop, Kinase-2, RNBS-A, Kinase-3A and GLPL motifs. The comparative analysis of expression profiles of sgRGCs in asymptomatic and field-driven symptomatic leaf tissues of ToLCNDV resistant and susceptible genotypes revealed RGCLc28 is expressed consistently in resistant genotypes. The differentially expressed RGCLc28 of DSG-6 is predicted to have strong association with the resistance trait against the leaf curl and mosaic disease in sponge gourd and may serve as important genomic resource for candidate gene discovery.     

入侵害虫松树蜂嗅觉共受体SnocOrco基因的鉴定及其表达模式分析

为探究我国重大入侵害虫松树蜂Sirex noctilio的嗅觉分子机制,通过RT-PCR技术克隆松树蜂嗅觉共受体SnocOrco基因的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析,且采用qPCR技术明确SnocOrco在组织中的特异性表达谱和时空表达特性。结果表明,SnocOrco基因（GenBank登录号：MK748989）开放阅读框全长1 446 bp,编码481个氨基酸,氨基酸序列具有7个跨膜螺旋结构和1个高度保守结构功能域Pfam：7tm_6。SnocOrco属于稳定的疏水性膜蛋白,同源性比对和系统发育分析结果显示,氨基酸序列与膜翅目、鳞翅目、鞘翅目和双翅目其它昆虫的Orco都具有很高的同源性,其中与麦茎蜂Cephus cinctus的CcinOrco同源性最高,达到87.14%,在系统发育树中聚为一支。qPCR结果显示,SnocOrco主要在雌、雄成虫触角中高表达,约为外生殖器中表达量的6 000倍和4 000倍,且在雌成虫中的表达量高于雄成虫中的表达量;在2~7日龄成虫触角中SnocOrco的相对表达量在2日龄时达到最高,之后随着日龄的增加呈下降趋势;昼夜节律显示,SnocOrco相对表达量从9：00—15：00呈先上升后下降的趋势,在11：00时达到最高。表明SnocOrco基因在松树蜂两性交流中起着重要作用。