吕东平研究组在细菌中实现植物泛素化途径的重建

<正>泛素化是一种重要的真核生物蛋白质翻译后修饰方式,它决定了被修饰蛋白的命运。泛素化的过程分为三步系列的酶促反应,分别由E1、E2和E3来催化,并最终使泛素共价地结合到了底物蛋白上。通常来讲,整个泛素化途径至少需要五个蛋白的参与:泛素单体、E1、E2、E3和底物蛋白。中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心吕东平研究组利用合成生物学的手段,将编码以上5个植物蛋白的基因同时在同一大肠杆     

‘白叶1号’返白过程中泛素化酶基因序列分析与表达

‘白叶1号’(Camellia sinensis cv. Baiye 1)是一种遇低温发生阶段性返白的特异茶树品种。泛素化酶系统由泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3组成,前期从‘白叶1号’阶段性返白过程叶片中分离了多个泛素化酶差异表达基因。本研究以‘白叶1号’返白前期、返白期和复绿期的鲜叶为原料,探讨了‘白叶1号’返白过程中主要生化成分含量与前期获得的五个泛素化酶基因表达模式的关系。返白期氨基酸、没食子酸、生物碱含量较高,儿茶素含量较低;5个基因在复绿期的表达量皆高于返白期。5个泛素化酶蛋白中都含有多个磷酸化位点,CsE3-2含有的磷酸化位点最多;CsE1-1、CsE1-2为细胞核内蛋白,CsE2定位在高尔基体膜上,Cs E3-1定位在核膜上,参与诱导细胞凋亡,CsE3-2可能为内质网膜内在蛋白,参与内质网相关降解(ERAD)通路;Cs E3-2蛋白的二级结构主要是α-螺旋,其他4个泛素化酶的二级结构主要是无规则卷曲。研究结果表明:(1)泛素化酶系统可能参与了‘白叶1号’返白过程中氨基酸含量上升的响应过程;(2)儿茶素含量在返白期的降低可能与叶绿体的解体有关;(3) 5个泛素化酶参与了泛素蛋白酶体途径和泛素非蛋白酶体途径中的多个调控过程。本研究对于进一步认识‘白叶1号’阶段性返白过程中的分子调控机制和揭示茶树生长发育的精确调控过程有一定的意义。     

植物泛素基因研究进展

笔者通过已有研究总结了泛素蛋白酶体系统的组成成分,单泛素、多聚泛素、类泛素基因结构及泛素系统在植物生长发育中的作用,并对E3连接酶在应对生物及非生物胁迫应激反应方面的功能取得的进展进行综述。针对现有的相关研究,提出了靶蛋白研究较少、E3连接酶的HECT家族报道不多及E3调控网络、泛素化的时间位点仍不清楚等问题。对加强克隆相关基因及基因之间互作的研究、加强靶蛋白信息研究及E3分子机制等未来泛素研究做出展望,以期为植物泛素系统、泛素基因结构及功能方面的研究提供参考。     

水稻泛素连接酶功能研究进展

泛素广泛调控真核细胞的生命活动,泛素连接酶（E3）在泛素-蛋白酶体降解系统中特异性地识别目标底物。本文综述了水稻E3在激素信号传导、生长发育、生物胁迫和非生物胁迫等方面所起的作用。将来的研究重点是剖析水稻E3及目标底物互作方式,为水稻品质改良和抗逆育种提供借鉴与指导。     

甜菜应答盐胁迫PUB基因的生物信息学分析

旨在为研究甜菜U-box型E3泛素连接酶提供理论基础。以甜菜T710-Mu品系为试验材料,前期通过转录组数据获得在盐胁迫下差异表达的甜菜PUB基因(plant U-box gene),利用生物信息学的方法对这些PUB基因进行分析,主要包括理化性质分析、染色体定位分析、基因序列分析、结构域分析、家族分类分析以及互作蛋白预测。结果显示甜菜PUB基因在甜菜9条染色体上均有定位,并且包含PUB蛋白具有的多个保守结构域,如U-box,Pkinase、Pkinase-Tyr、Usp、Arm以及KAP结构域,以拟南芥U-box家族分类为依据发现甜菜U-box多位于ClassⅡ、ClassⅢ、ClassⅣ中,甜菜PUB蛋白可作为E3泛素连接酶与多种功能蛋白相互作用,实现泛素化修饰。植物PUB蛋白具有E3泛素连接酶活性,在植物生长发育过程以及抵抗环境压力中起到重要作用。     

高等植物蛋白质的特异性降解系统

在细胞内功能蛋白质处于不断的合成与降解中,其中蛋白质的特异性降解是蛋白功能调节的重要机制。蛋白质的特异性降解分为泛素依赖的途径和非泛素依赖途径。在泛素依赖的降解途径中,蛋白质在泛素激活酶、泛素结合酶、泛素连接酶的作用下泛素化,然后在26S蛋白酶体中进行降解。蛋白质也可不依赖泛素被26S蛋白酶体降解,或被游离的20S蛋白酶体降解。本文主要介绍高等植物中的蛋白质特异性降解途径及特异性机制的研究进展。     

小麦条锈菌看家基因SNP引物的开发及多态性位点研究

利用NCBI数据库进行小麦条锈菌看家基因SNP引物开发,从NCBI搜索到15个基因的序列,利用Primer Premier 5.0软件设计了22对引物,利用其进行条锈菌DNA的PCR扩增、测序,并与标准序列比对,从而筛选出SNP引物。在候选基因中,柠檬酸盐合酶(Cs)、热休克蛋白hsp90(Hsp)、泛素活化酶E1(Uba)及泛素结合酶E2(Ubc)4个基因的5对SNP引物表现多态性,能检测到条锈菌SNP位点依次为4、6~7、4和7个,均为系统发生信息位点,并摸索出优化的PCR反应体系及条件。利用开发的引物研究条锈菌群体结构,可揭示病原菌起源、进化、传播,为病害治理提供依据。     

植物E3泛素连接酶与非生物胁迫相关研究进展

为更加深入了解植物E3泛素连接酶响应非生物胁迫的作用机制,笔者回顾了近年来拟南芥、水稻、小麦等多种植物中的E3参与非生物胁迫的相关研究,对泛素蛋白酶体途径、E3泛素连接酶的类型进行了介绍,并重点总结了近几年E3泛素连接酶在植物响应非生物胁迫方面的相关研究进展。针对研究现状,指出功能冗余E3的研究问题及利用高通量技术寻找靶标蛋白的问题,旨为完善E3泛素连接酶参与非生物胁迫调控机制提供理论基础。     

杜仲U-box基因家族鉴定及分析

植物U-box蛋白是编码含有U-box结构域的基因家族,其编码蛋白大多是泛素系统中特异性识别底物的泛素连接酶E 3,在植物的生长发育、生物及非生物胁迫中起着广泛的调控作用。目前对杜仲的U-box基因了解较少,本研究通过生物信息学和荧光定量PCR技术,对杜仲U-box基因进行鉴定和表达分析。结果表明,杜仲基因组中含有40个U-box基因,根据蛋白结构域将其分为7类,并分析了基因家族成员的基因结构、系统发育、保守结构域和基序等。此外,U-box-Arm结构家族成员的基因表达分析发现,该家族成员的表达具有一定的组织特异性。     

拟南芥U-box蛋白的研究进展

泛素-26s蛋白酶体途径（ubiquitin-26s proteosome pathway,UPP）是真核生物体内一种高度选择性的蛋白降解途径。U—box蛋白是该途径中决定底物特异性的一种泛素连接酶E3。U—box结构域大约由70个氨基酸残基构成,在酵母、植物和动物等真核生物中高度保守。植物U-box蛋白（plant U—box protein,PUB）的数目远多于其他生物,在植物的生长发育过程中起着重要作用。目前在拟南芥中已发现60多个PUB蛋白（Arabidopsis plant U-box protein,AtPUB）,成为近年来受到较多关注的一类蛋白。本文根据蛋白的结构特征和系统进化树比较,将61种AtPUB蛋白分为7大类。同时,对已报道AtPUB蛋白的功能进行了综述并提出了研究展望。     

泛素化修饰及其在植物蛋白质组学中的研究进展

泛素化修饰是真核生物中一种重要的蛋白质翻译后修饰,几乎参与调控细胞内所有重要的生命活动过程。近年来,随着泛素化蛋白质富集技术和质谱技术的不断发展,泛素化蛋白质组学研究取得了重大进展。目前泛素化蛋白质组学研究多集中在动物和酵母中,而在植物中开展的相对较少。为了总结植物中泛素化蛋白质组学的最新研究成果,本文对泛素化修饰、质谱法鉴定泛素化位点、泛素化蛋白的富集方法及泛素化蛋白质组学在植物光调节、激素处理和逆境胁迫条件下的应用研究进行综述,为泛素化修饰在植物领域的最新研究提供理论基础。     

巴西橡胶树HbUBC22基因克隆与表达分析

泛素蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome pathway, UPP）是细胞内最重要的且具有高度选择性的蛋白质降解途径,而泛素结合酶E2/UBC是该途径的一个关键酶。本研究通过对巴西橡胶树同源EST序列拼接和RT-PCR扩增的方法,克隆了一个巴西橡胶树的泛素结合酶基因HbUBC22,该基因的开放阅读框（ORF）共807 bp,编码268个氨基酸,编码蛋白含有一个保守的UBC结构域和一个高度保守的半胱氨酸催化位点。系统进化关系分析发现,HbUBC22蛋白与蓖麻、杨树、油茶和葡萄的UBC蛋白的同源性最高,分别为89%、85%、85%和81%;在拟南芥基因组中,HbUBC22则与AtUBC22的同源性最高达到73%。表达谱分析结果显示,HbUBC22受乙烯利和茉莉酸甲酯诱导显著上调表达。原核表达分析结果表明,经IPTG诱导后,HbUBC22能够在大肠杆菌中表达出目标蛋白。本研究结果为进一步研究HbUBC22在橡胶树中的生物学功能奠定了良好基础。     

甘蔗类泛素蛋白UBL5应答SCMV侵染及其与SCMV-6K2的互作

泛素化修饰在蛋白功能调控、生长发育和逆境应答中具有重要作用。类泛素蛋白(ubiquitin-likeproteins,UBLs)是泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)的重要组分。本课题组前期利用酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2H)技术从甘蔗(Saccharumspp.hybrid)中分离鉴定了1个与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)编码蛋白6K2互作的类泛素蛋白UBL5,命名为Sc UBL5,长度为73aa。本研究利用双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验进一步证实了Sc UBL5与SCMV-6K2互作;生物信息学分析表明, Sc UBL5为稳定的亲水性非分泌蛋白,无信号肽和跨膜结构。系统进化树分析表明, Sc UBL5具有明显的种属特异性。亚细胞定位分析表明,Sc UBL5定位于细胞质和细胞核。实时荧光定量PCR分析发现,Sc UBL5基因的表达具有明显的组织特异性,在完成形态建成的正一叶、第7叶、根和第8节间...     

鹰嘴豆分离蛋白的酶解工艺研究

通过单因素实验和正交实验,得出碱性蛋白酶水解鹰嘴豆分离蛋白的最佳反应条件是：pH8.5、反应温度55℃、底物浓度[S] 2%、酶与底物浓度之比[E]/[S]2%,在此条件下,蛋白水解率可以达到27.86%;碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶在各自最佳反应条件下（碱性蛋白酶pH8.5、反应温度55℃、[S]2%、[E]/[S]2%,木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶均为pH7.2、反应温度55℃、[S]2%、[E]/[S]2%）依次水解鹰嘴豆分离蛋白,反应结束时,蛋白水解度可达到34.64%。     

一个快速响应干旱的F-box基因的克隆和表达分析

F-box是Skp1-Cullin1-F-box (SCF)型泛素连接酶E3的重要组成部分,在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆到与耐旱早期响应相关的F-box基因,命名SiFBX (GenBank登录号为KC252635.1)。该基因全长510 bp,编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明,该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸,缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明,该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb序列处,预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR分析表明,该基因分别在正常干旱、PEG和ABA诱导下,表达量出现显著变化。     

水杉泛素结合酶基因的克隆

水杉(Metasequoia glyptostroboides)是著名的杉科孑遗植物,对水杉的分子遗传研究在其资源保护和利用方面具有重要意义。本研究以水杉为实验材料,在全长转录组测序的基础上克隆了一个泛素结合酶基因(MgUC-E2),并进一步对该基因作了生物信息学分析。结果表明:MgUC-E2基因cDNA编码链全长为691 nt,可以编码长度为148个氨基酸的泛素结合酶。该酶蛋白的分子量为16 545.09 kD,等电点为7.72,平均吸水值为-0.343;含有15个磷酸化修饰位点和5个常见功能位点;在预测的二级结构中共包括5个螺旋区、4个折叠区和一些无规则卷曲区;三级结构分析的结果进一步证实MgUC-E2基因就是编码泛素结合酶。本研究结果可为水杉及其它相关物种的泛素结合酶基因的结构及功能研究提供一些参考。     

疣粒野生稻泛素结合酶基因的全长cDNA序列克隆与分析

从已构建疣粒野生稻消减cDNA文库中随机挑取阳性单克隆经测序得到ESTs, 通过生物信息学分析, 选取与泛素结合酶具有同源功能的EST以RACE技术分离克隆到1个疣粒野生稻泛素结合酶基因的全长cDNA序列, 命名为OmE2 (Oryza meyerianaBaill. ubiquitin-conjugating enzyme, OmE2), 该序列长917 bp, 最大开放阅读框为528 bp, 编码的蛋白具有175个氨基酸, 该蛋白的分子量为19.31 kD, 理论等电点为9.32。OmE2蛋白与其他物种的泛素结合酶具有高度的一致性和相似性, 含有泛素结合酶活性位点的保守序列及半胱氨酸残基, 且具有3个跨膜结构域, 推测OmE2是一类泛素结合蛋白兼跨膜蛋白。经RT-PCR分析, OmE2基因是受白叶枯病病原菌胁迫诱导表达的, 是首次从野生稻中发现的可能参与疣粒野生稻胁迫信号传导和抗病应答反应的基因。     

贮藏条件对采后龙眼果皮褐变底物性质的影响

利用光谱特征和酶学反应,分析采后贮藏环境条件对龙眼果皮酶促褐变底物性质的影响。结果表明,龙眼褐变底物在光照、高温和碱性条件下不稳定,容易变褐;O2处理提高了褐变底物与龙眼多酚氧化酶(PPO)的反应能力,而CO2处理明显减缓其与龙眼PPO的酶促褐变反应;氧化剂H2O2加速了该酶促反应,但还原剂VC及Na2S2O5阻止底物酶促褐变;K+,Na+,Ca2+和Zn2+对底物溶液的稳定性无显著影响,而该底物溶液在Fe3+,Fe2+,Cu2+,Pb2+存在下不稳定。     

酶水解乳清蛋白工艺条件的研究

采用4因素二次正交旋转实验,对蛋白酶A水解乳清蛋白的工艺条件(pH值、温度、酶与底物浓度比、水解时间)进行优化。建立了以乳清蛋白水解度为响应值的二次正交旋转回归模型,依据该模型确定以乳清蛋白水解度为响应值的最佳水解条件分别为:初始pH值为6.87,温度为59.6℃,酶与底物浓度比为2000.31 U/g,水解时间为2.91 h。     

中科院遗传发育所在拟南芥独脚金内酯信号研究中取得新进展

<正>独脚金内酯(Strigolactones,SLs)是一类新的植物激素,调控侧芽伸长、株高、叶片形状、衰老、种子萌发、侧根生长等发育过程,在单子叶植物和双子叶植物中具有功能保守性。在水稻独脚金内酯信号途径中F-box蛋白DWARF3(D3)与独脚金内酯的受体DWARF4(D14)形成SCF复合体,参与泛素介导的蛋白降解。DWARF53(D53)基因编码独脚金内酯信号途径中的关键抑制因子,该抑制因子在独脚金内酯作用下,与D14、D3形成复合体,并被泛素化修饰和降解,从而解除了对下游基因表达的抑制。但是拟南芥